苗智穎,念 陳,邵學(xué)廣,陳 強(qiáng)

(1.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 唐山 063000;2.海南醫(yī)學(xué)院,?？?571199;3.南開(kāi)大學(xué)藥物化學(xué)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300071;4.南開(kāi)大學(xué)生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300071)

基于多壁碳納米管-鉑納米顆粒納米復(fù)合材料的乙醇生物傳感器*

苗智穎1,念 陳2,邵學(xué)廣3,陳 強(qiáng)4*

(1.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 唐山 063000;2.海南醫(yī)學(xué)院,?？?571199;3.南開(kāi)大學(xué)藥物化學(xué)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300071;4.南開(kāi)大學(xué)生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300071)

采用超聲法制備了多壁碳納米管-鉑納米顆粒(MWCNTs-PtNPs)納米復(fù)合材料,并將其修飾于乙醇生物傳感器,表現(xiàn)出良好的檢測(cè)性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:傳感器最低檢測(cè)限為0.02 mmol/L,線性范圍為0.25 mmol/L～3.00 mmol/L,靈敏度為0.923 32 μA/(mmol/L),并且具有高穩(wěn)定性和良好的重現(xiàn)性。

生物傳感器;乙醇;多壁碳納米管-鉑納米顆粒;納米復(fù)合材料

乙醇(Ethanol,CH3CH2OH)是醇類的一種,對(duì)人體液(血液、血清、唾液、尿液、汗液等)中的乙醇精確快速的檢測(cè)在臨床和法醫(yī)檢定方面具有重要意義[1]。近年來(lái),已發(fā)展了多種乙醇檢測(cè)方法,如氧化還原滴定法、分光光度法、呼氣法、高效液相色譜法、氣相色譜法、生物傳感器法等[2-4]。其中,基于酶制劑的生物傳感器由于檢測(cè)方便、快速和準(zhǔn)確,能夠滿足即時(shí)檢測(cè)的要求而受到廣泛的關(guān)注[5-6],而且隨著材料科學(xué)的發(fā)展,采用納米材料修飾電極的出現(xiàn)[7-10],進(jìn)一步提高了乙醇檢測(cè)的性能,尤其是以多壁碳納米管MWCNTs(Multi-Wallcarbon Nanotubes)為代表的納米材料,已廣泛應(yīng)用于多種高性能生物傳感器的制備[11-12]。明膠包埋法作為傳統(tǒng)酶固定化方法,具有操作簡(jiǎn)單、條件溫和、能阻礙大分子干擾物等優(yōu)點(diǎn),適合結(jié)構(gòu)復(fù)雜的八聚體乙醇氧化酶AOD(Alcohol Oxidase)的固定。本文將用超聲法制備的MWCNTs-PtNPs納米復(fù)合物修飾在絲網(wǎng)印刷電極上,在聚丙烯胺鹽酸鹽/聚磺化乙烯硫酸鹽PAA/PVS(poly(allyl-amine)/poly(potassium vinyl sulfate))自組裝膜提高傳感器抗干擾性基礎(chǔ)上,利用包埋法將乙醇氧化酶固定在電極表面,構(gòu)建了乙醇生物傳感器,并考察了影響電極性能的因素。所制備的傳感器不僅表現(xiàn)出較寬的線性范圍和較高的靈敏度,還表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

乙醇氧化酶(AOD,EC1.1.3.13 from Pichia pastoris,5 483 U/mL)、氯鉑酸鉀、尿酸、醋氨酚、抗壞血酸購(gòu)于Sigma;多壁碳納米管(MWCNTs,直徑30 nm～50 nm,長(zhǎng)度0.5 μm～1 μm,羧基基團(tuán)0.73 wt%,純度95%)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所;聚丙烯胺鹽酸鹽(Poly(allyl-amine),PAA,Mw:10 000)和聚磺化乙烯硫酸鹽(Poly(potassium vinyl sulfate),PVS,Mw:170 000)購(gòu)于Aldrich;乙醇購(gòu)于天津市化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的其他試劑均為分析 純,溶液均為去離子水配制。循環(huán)伏安(CV)曲線和計(jì)時(shí)電流(i-t)曲線在電化學(xué)測(cè)試系統(tǒng)(Model 283型,M270數(shù)據(jù)處理軟件,美國(guó)EG&G公司)上進(jìn)行,采用絲網(wǎng)印刷電極(BVT-AC1.W2.RS:工作電極-Pt,參比電極-Ag/AgCl,對(duì)電極-Pt,上海安贊商貿(mào)有限公司),實(shí)驗(yàn)前溶液通入氮?dú)獬?所有的實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

1.2 MWCNTs-PtNPs納米復(fù)合物的制備

將MWCNTs用混酸(濃硫酸∶濃硝酸=3∶1,V∶V)超聲處理4 h,離心后去掉上清液,MWCNTs用雙蒸水反復(fù)洗滌至中性,干燥后用雙蒸水配置成1 mg/mL溶液備用。取1 mL 1 mg/mL MWCNTs溶液于燒杯中,室溫下邊攪拌邊加入2 mL 0.01 mol/L K2PtCl6水溶液,然后將混合液超聲2 h,最后室溫下攪拌20 h,離心收集最終產(chǎn)物,雙蒸水配置成1 mg/mL溶液備用。

1.3 納米復(fù)合物修飾酶電極的制備

將絲網(wǎng)印刷電極分別在乙醇、去離子水中超聲清洗,然后在0.5 mol/L稀硫酸溶液中在-0.3 V～+1.5 V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,直至循環(huán)伏安曲線達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),以除去電極表面的金屬雜質(zhì)。然后將電極在2 mg/L PAA與PVS溶液交替浸入25 min,間隔以PBS沖洗,重復(fù)上述過(guò)程在電極表面自組裝(PAA/PVS)2膜;取5 μL MWCNTs-PtNPs水溶液滴加到工作電極表面,室溫下干燥后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0 μL明膠(10%,W/V)、10 μL AOD(1 mg/L)混勻,取10 μL滴加于處理好的工作電極表面,放4 ℃冰箱中自然干燥,12 h后取出。

1.4 電化學(xué)測(cè)試

電化學(xué)測(cè)試前,先將電極置于0.1 mol/L pH 7.5的PBS中浸泡5 min,以洗去結(jié)合松散的酶蛋白。將電極放入20 mL pH 7.5 PBS中進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試。在50 mV/s掃描速度下測(cè)定工作電極的循環(huán)伏安曲線,初始電位0 mV,折回電位+600 mV。在+400 mV電位下測(cè)定工作電極的計(jì)時(shí)電流曲線,測(cè)定時(shí)施加電磁攪拌。

2 結(jié)果與討論

2.1 MWCNTs-PtNPs納米復(fù)合物的透射電鏡表征

圖1為MWCNTs-PtNPs納米復(fù)合物的透射電鏡圖,從圖1(a)中可以清晰的看到黑色的納米鉑顆粒附著在碳管的表面,納米鉑顆粒的直徑約為2 nm～3 nm;與其相對(duì)應(yīng)的空白碳管圖1(b)未發(fā)現(xiàn)表面有黑色顆粒狀結(jié)構(gòu)。

圖1 TEM表征結(jié)果

圖2 不同材料修飾的電極對(duì)乙醇的電流響應(yīng)

2.2 不同材料修飾的電極對(duì)乙醇的電流響應(yīng)及工作曲線

分別將PtNPs、MWCNTs和MWCNTs-PtNPs納米復(fù)合物修飾于電極表面,在+400 mV(vs.Ag/AgCl)電位下測(cè)量電極對(duì)2 mmol/L乙醇的電流響應(yīng),結(jié)果如圖2所示。

其中MWCNTs-PtNPs納米復(fù)合物的增效作用最明顯(曲線d),這主要?dú)w因于MWCNTs-PtNPs納米復(fù)合物大的比表面積和良好的生物相容性以及良好的電子傳遞能力,不僅增大了酶的固定量,同時(shí)保持了酶的活性。故本實(shí)驗(yàn)中選擇MWCNTs-PtNPs納米復(fù)合物修飾電極制備乙醇傳感器。

將AOD/MWCNTs-PtNPs/(PAA/PVS)2/Pt電極連接電化學(xué)工作站,構(gòu)建用于乙醇定量測(cè)定的生物傳感器,在+400 mV(vs.Ag/AgCl)電位下測(cè)定計(jì)時(shí)電流曲線,分別加入不同量的乙醇形成乙醇濃度梯度,測(cè)試結(jié)果如圖3所示。

圖3 傳感器對(duì)乙醇濃度響應(yīng)的計(jì)時(shí)電流曲線

在20 mL 0.1 mol/L pH 7.5 PBS中測(cè)試,測(cè)試電位+400 mV(vs.Ag/AgCl),電磁攪拌,室溫25 ℃,箭頭標(biāo)注表示單次加樣后乙醇總濃度。

將實(shí)驗(yàn)中電流響應(yīng)值與濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系繪制成乙醇傳感器工作曲線,并根據(jù)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程——米氏方程(Michaelis-Menten equation)進(jìn)行擬合[13]:

V=Vmax·[S]/(Km+[S])

(1)

式中:V為反應(yīng)速率,由加樣后穩(wěn)態(tài)電流值Iss所代表;Vmax為最大反應(yīng)速率,由酶被底物飽和時(shí)的最大響應(yīng)電流Imax所代表;[S]為體系中的底物濃度;根據(jù)5次獨(dú)立測(cè)定重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值繪制乙醇生物傳感器工作曲線,如圖4所示。

圖4 乙醇傳感器的工作曲線

該工作曲線的線性范圍為0.25 mmol/L～3.0 mmol/L,靈敏度為0.923 32 μA/(mmol/L),乙醇檢測(cè)時(shí)加樣前基線平均值為7 nA,信噪比(S/N)為3時(shí),傳感器最低檢測(cè)限為0.02 mmol/L。

2.3 傳感器的抗干擾性與穩(wěn)定性

抗壞血酸、尿酸和醋氨酚是體液中常見(jiàn)的氧化還原活性物質(zhì),本研究在電極上固定AOD之前,先在電極表面自組裝(PAA/PVS)2納米膜來(lái)增強(qiáng)傳感器的抗干擾能力。結(jié)果顯示,與1 mmol/L乙醇產(chǎn)生的電流相比,0.5 mmol/L尿酸產(chǎn)生的干擾電流為8.97%,0.1 mmol/L醋氨酚產(chǎn)生的干擾電流為1.92%,0.1 mmol/L抗壞血酸產(chǎn)生的干擾電流為4.81%。表明制備的乙醇傳感器在對(duì)血液中所含的尿酸、醋氨酚、抗壞血酸的抗干擾性良好。這歸功于(PAA/PVS)2自組裝膜對(duì)干擾物的擴(kuò)散阻礙作用,4種干擾物分子較大,難于通過(guò)微小孔結(jié)構(gòu)擴(kuò)散到電極表面進(jìn)行氧化[14]。

所制備的乙醇生物傳感器穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。電極不用時(shí)置于4 ℃冰箱pH 7.5 PBS中保存,在7周時(shí)間內(nèi)連續(xù)測(cè)定電極對(duì)2 mmol/L乙醇的響應(yīng)電流,響應(yīng)電流值下降緩慢,第49天乙醇生物傳感器響應(yīng)電流仍保持了初始值的82.2%,表明制備的傳感器具有良好的穩(wěn)定性,這與包埋法提供的溫和環(huán)境、以及MWCNTs的吸附性、生物相容性有關(guān)。

圖5 制備的乙醇生物傳感器在7周內(nèi)對(duì)2 mmol/L乙醇的電流響應(yīng)

3 結(jié)論

本文采用超聲方法制備了MWCNTs-PtNPs復(fù)合材料,所制備的納米復(fù)合材料表現(xiàn)出良好的電化學(xué)活性,提高了乙醇生物傳感器的性能,所制備的傳感器表現(xiàn)出良好的線性范圍和檢測(cè)限,由于復(fù)合材料的制備方法簡(jiǎn)單,有望在乙醇的檢測(cè)中得到實(shí)際應(yīng)用。

[1] Peng M,Wu S,Jiang X,et al. Long-Term Alcohol Consumption is An Independent Risk Factor of Hypertension Development in Northern China:Evidence from Kailuan Study[J]. J Hypertens,2013,31(12):2342-2347.

[2] Chalier P,Ghommidh C,Ragazzo-Sanchez J A. Coupling Gas Chromatography and Electronic Nose for Dehydration and Desalcoholization of Alcoholized Beverages-Application to off-Flavour Detection in Wine[J]. Sensors and Actuators B:Chemical,2005,106(1):253-257.

[3] Jones A W. Measuring Alcohol in Blood and Breath for Forensic Purposes—A Historical Review[J]. Forensic Science Review,2000,12(1/2):151-182.

[4] 陳珠麗,郭希山,朱松明. 基于納米金修飾絲網(wǎng)印刷電極的乙醇生物傳感器[J]. 傳感技術(shù)學(xué)報(bào),2009,22(12):1686-1689.

[5] Li L,Lu H,Deng L. A Sensitive NADH and Ethanol Biosensor Based on Graphene-Au Nanorods Nanocomposites[J]. Talanta,2013,113:1-6.

[6] Das M,Goswami P. Direct Electrochemistry of Alcohol Oxidase Using Multiwalled Carbon Nanotube As Electroactive Matrix for Biosensor Application[J]. Bioelectrochemistry,2013,89:19-25.

[7] Narang J,Chauhan N,Jain P,et al. Silver Nanoparticles/Multiwalled Carbon Nanotube/Polyaniline Film for Amperometric Glutathione Biosensor[J]. Int J Biol Macromol,2012,50(3):672-678.

[8] 馬莉萍,左顯維,王艷鳳,等. 基于Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料固定化酶的葡萄糖生物傳感器[J]. 傳感技術(shù)學(xué)報(bào),2013,26(5):606-610.

[9] Dalmasso P R,Pedano M L,Rivas G A. Supramolecular Architecture Based on the Self-Assembling of Multiwall Carbon Nanotubes Dispersed in Polyhistidine and Glucose Oxidase:Characterization and Analytical Applications for Glucose Biosensing[J]. Biosens Bioelectron,2013,39(1):76-81.

[10] Lata S,Pundir C S. L-Amino Acid Biosensor Based on L-Amino Acid Oxidase Immobilized Onto NiHCNFe/c-MWCNT/PPy/GC Electrode[J]. Int J Biol Macromol,2013,54:250-257.

[11] Miao Z,Zhang D,Chen Q. Non-Enzymatic Hydrogen Peroxide Sensors Based on Multi-Wall Carbon Nanotube/Pt Nanoparticle Nanohybrids[J]. Materials,2014,7(4):2945-2955.

[12] Benvidi A,Rajabzadeh N,Mazloum-Ardakani M,et al. Comparison of Impedimetric Detection of DNA Hybridization on Chemically and Electrochemically Functionalized Multi-Wall Carbon Nanotubes Modified Electrode[J]. Sensors and Actuators B Chemical,2015,207:673-682.

[13] 陳守文. 酶工程[M]. 北京:科學(xué)出版社,2008:208-216.

[14] Saiki T H. Kuwazawa Hoshi. Selective Permeation of Hydrogen Peroxide Through Polyelectrolyte Multilayer Films and Its Use for Amperometric Biosensors[J]. Analytical chemistry,2011,73(21):5310-5315.

Alcohol Biosensor Based on Multi-Walled Carbon Nanotubes/Platinum Nanoparticles Nanocomposite*

MIAOZhiying1,NIANChen2,SHAOXueguang3,CHENQiang4*

(1.School of Basic Medical Sciences,North China University of Science and Technology,Tangshan Hebei 063000,China;2.Hainan Medical College,Haikou 571101,China;3.State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology,Nankai University,Tianjin 300071,China;4.Key Laboratory of Bioactive Materials,Ministry of Education,NankaiUniversity,Tianjin 300071,China)

MWCNTs-PtNPs nano composite was prepared by ultrasonic method,and its modified to ethanol biosensor showed good performance. The experimental results show that the minimum detection limit of the sensor is 0.02 mmol/L,the linear range is 0.25 mmol/L～3.0 mmol/L,the sensitivity is 0.923 32 μA/(mmol/L),and has high stability and good reproducibility.

biosensor;ethanol;MWCNTs-PtNPs;nanocomposite

苗智穎(1980-),男,博士,博士后,畢業(yè)于南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,主要從事生物傳感器相關(guān)研究工作,miaozhiying@ncst.edu.cn;陳 強(qiáng)(1962-)男,博士,博士后,教授,畢業(yè)于日本東北大學(xué)藥學(xué)部,目前從事生物分子可控有序自組裝、光電化學(xué)納米生物傳感技術(shù)、生物分子識(shí)別分析技術(shù)等分析化學(xué)和生命科學(xué)的前沿交叉學(xué)科研究工作,qiangchen@nankai.edu.cn。

項(xiàng)目來(lái)源:國(guó)家自然科學(xué)基金(81273993)

2016-05-11 修改日期:2016-09-21

TP212.2

A

1004-1699(2017)01-0016-04

C:7230J

10.3969/j.issn.1004-1699.2017.01.003