任婷,楊勝輝,饒春梅,彭霞,孫彥波,吳若霞,陳聰,成細華*,黃政德*（湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208）

加味丹參飲預處理調節(jié)ODC活性抗大鼠心肌缺血再灌注損傷研究

任婷,楊勝輝,饒春梅,彭霞,孫彥波,吳若霞,陳聰,成細華*,黃政德*（湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208）

目的探討加味丹參飲通過調節(jié)鳥氨酸脫羧酶（ODC）活性在抗SD大鼠心肌缺血再灌注損傷（IRI）中的保護機制。方法建立SD大鼠心肌IRI模型，設對照組、假手術組、缺血再灌注損傷（IRI）組、加味丹參飲(JWDSY)+IRI組共4組。酶聯(lián)免疫(ELISA)法測定ODC含量，實時熒光定量PCR（RT-PCR）方法檢測ODC mRNA表達水平，免疫印跡（Western blot）法檢測ODC蛋白表達水平，高效液相色譜檢測心肌組織中多胺的含量。結果與對照組比較，假手術組的ODC含量、ODC mRNA及蛋白表達水平均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與假手術組比較，IRI組的ODC含量顯著增加、ODC mRNA及蛋白表達水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與IRI組比較,JWDSY+IRI組ODC含量顯著減少，ODC mRNA和蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論加味丹參飲可能通過調節(jié)ODC活性，從而發(fā)揮對IRI后心肌的保護作用。

加味丹參飲；心??；缺血再灌注損傷；多胺；鳥氨酸脫羧酶

本文引用：任婷,楊勝輝,饒春梅,彭霞,孫彥波,吳若霞,陳聰,成細華,黃政德.加味丹參飲預處理調節(jié)ODC活性抗大鼠心肌缺血再灌注損傷研究[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（1）：13-17.

心肌缺血再灌注損傷(ishemia reperfusion injury，IRI)機制及心肌保護的研究一直是當今倍受重視的課題,多胺(polyamines,PA)是心肌細胞正常生存不可缺少的一組重要小分子化合物,鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)是多胺合成代謝限速酶。在心肌缺血再灌注損傷時，多胺代謝失衡，ODC活性發(fā)生改變[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，加味丹參飲預處理對IRI心肌細胞具有保護作用，可模擬缺血預適應樣保護作用（拮抗鈣離子超載、保護線粒體結構，抗凋亡，抗氧化）[2-4]，但其保護機制有待深入研究。據此，可以推測加味丹參飲可能通過調節(jié)ODC活性，從而發(fā)揮對心肌缺血后心肌的保護作用。本研究采用SD大鼠IRI模型，研究加味丹參飲預處理對大鼠IRI后ODC活性的影響，從調控多胺的代謝角度深入探討加味丹參飲抗IRI的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD大鼠48只，雌雄各半，體質量220～300 g。購于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心。許可證號：SYXK(湘)2013-0005。

1.2 藥品與試劑

加味丹參飲(由丹參20 g，檀香6 g，赤芍10 g，川芎6 g，當歸6 g，紅花6 g,生地黃12 g，黃芪20 g)含生藥量86 g，購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，浸泡30 min，再按照W/V=1/8量加水煎煮2次（檀香后下），藥液經1 000 r/min離心10 min除雜質，濃縮為含生藥量1 g/mL。

TTC試劑（南京建成科技有限公司,批號：20150622），ELISA試劑盒（SIGMA,批號：E-ELR0694c），Trizol試劑（Invitrogen公司,批號：15596-026），RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Syn thesis Kit（Fermentas公司,批號：K1631），DNase I（Fermentas公司,批號：EN0521），RiboLockTMRibonuclease Inhibitor（Fermentas公司,批號：EO0381），SYBR GreenPCR Master Mix（ABI,批號：4309155），Western blot顯影液（Beyotime公司，批號：P0020)，ODC一抗（Abcam公司,批號:ab193338)，羊抗鼠二抗(南京生興生物技術有限公司，批號：SN133)，腐胺、精脒、精胺(Sigma公司)。

1.3 主要儀器

小動物呼吸機（浙江大學醫(yī)學實驗儀器，DH-8型）；十六導生理記錄儀（Biopac公司，MPl50型）；高速離心機（SIGMA，1-13型）；Realtime-PCR儀（ABI公司,7900型）；水平電泳槽（北京君意東方儀器公司，JY-SPC型）；電泳儀（北京鼎國生物技術發(fā)展中心，170-3930型）；電轉儀及附件（BIO-RAD公司，170-3930型）；NC膜(PIERCE公司，88018型)；濾紙(Whatman公司，3MMCHR型)；高效液相色譜儀(Agilent，1260 infinity型)。

1.4 SD大鼠在體心肌缺血再灌注模型建立

SD大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/ 100 g)。開胸暴露心臟，剪開心包，于冠狀動脈左心室前降支離左心耳下緣約1.5 mm處繞左心室支穿線結扎，缺血30 min后剪開結扎線，再灌注90 min，造成心肌缺血再灌注損傷。假手術組僅做冠狀動脈穿線,不結扎。術中連續(xù)監(jiān)視心電圖Ⅱ導聯(lián)的變化，以ST段抬高、T波高聳、倒置或左心室變?yōu)樯n白色為心肌缺血結扎成功(心肌缺血)的標志，剪開結扎線后ST段下降50%以上、高聳的T波下降或左心室由蒼白變?yōu)榘导t色表示再灌注成功。

1.5 分組與給藥方法

48只SD大鼠隨機分為4組，每組12只。對照組(control)：處理前14 d灌胃與JWDSY等量的生理鹽水2次/d，連續(xù)14 d，末次灌胃1 h后開始試驗，120 min后行開胸取出心臟；假手術組（blank）：開胸左冠狀動脈前降支下穿線不結扎，余同對照組；心肌缺血再灌注損傷組（IRI）：開胸結扎左冠狀動脈前降支30 min后松線，再灌注90 min，余同對照組；JWDSY+IRI組：大鼠造模前14 d予加味丹參飲灌胃，按大鼠與人的體質量及體表面積比值換算公式得到大鼠每天灌胃7.74 g/（kg·d），2次/d，連續(xù)14 d于末次灌胃1 h后行開胸結扎左冠狀動脈前降支30 min后松線，再灌注90 min。

1.6 心肌組織梗死面積的測定

取40只老鼠分為4組，每組10只另行實驗，實驗結束后取下心臟，置于-20℃冰箱冰凍10 min后，沿垂直心臟長軸方向從心尖到結扎線下方切片，每片厚約1.5 mm,放入1%TTC磷酸鹽緩沖液（pH7.4）37℃水浴箱中孵育20 min，然后置于10%甲醛中固定過夜。應用ImagemasterVDS圖像分析儀分析心肌梗死面積占心肌總面積百分比，梗死區(qū)呈灰白色，非梗死區(qū)呈深紅色。心肌梗死面積率=(所有切片梗死面積之和／心肌總面積之和)×100%。

1.7 酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測ODC含量

取心肌組織，參照試劑盒說明檢測大鼠心肌組織ODC含量。具體步驟如下：（1）加樣。分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔，空白孔加標準品和樣品稀釋液100 μL，余孔分別加標準品100 μL，覆膜，37℃孵育90 min；（2）棄液甩干。加入生物素抗體工作液100 μL，覆膜，37℃溫育1 h；（3）洗滌；（4）每孔加酶結合物工作液100 μL，覆膜，37℃溫育30 min；（5）洗滌；（6）每孔加底物(TMB)溶液90 μL，覆膜，37℃避光顯色20 min；（7）每孔加終止溶液50 μL；（8）用酶標儀記錄450 nm處OD值。

1.8 RT-PCR檢測心肌組織ODC mRNA的表達

取心肌組織30 mg，研磨勻漿，加入1 mL Trizol提取心臟總RNA,采用A260/A280鑒定RNA純度及濃度。根據反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄幸姳?。Realtime PCR擴增程序為95℃5 min；隨后進行40次如下循環(huán)：94℃20 s、60℃20 s、72℃20 s。隨后進行融點曲線分析。ABI7900型實時熒光定量RT-PCR儀檢測記錄數(shù)據，結果根據標準曲線由軟件自動計算后得出。每組標本重復3次，取平均值為Ct值，計算目的基因ODC mRNA相對含量2-ΔΔCt。ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt=最低樣本ΔCt值—其它各樣本ΔCt值[5]，用擴增曲線、熔點曲線監(jiān)測各樣本PCR反應的特異性。

表1 ODC和β-actin PCR引物序列

1.9 Western blot檢測心肌組織ODC蛋白表達

取大鼠左心室組織0.5 mg勻漿，加入1 mL蛋白提取液，勻漿20 min，冰上放置20 min，再勻漿20 min，9 000 r/min，離心10 min，取上清進行蛋白質定量。取50 μg總蛋白樣品加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性后于SDS-PAGE電泳，隨后轉印至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉37℃2 h后,用1∶1 000抗ODC抗體1 mL 37℃搖床孵育2 h。加入1∶8000 ODC酶標二抗1 mL 4℃過夜。加入發(fā)光底物試劑顯色，掃描顯影條帶光密度。

1.10 高效液相色譜法測定心肌組織多胺含量

取左心室組織150 mg，加入0.3 mmol／L冷的高氯酸在冰水浴中制成勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清貯存在-20℃直至分析使用。具體操作方法參照趙雅君等的研究[6]。

1.11 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 JWDSY對大鼠缺血再灌注心肌梗死面積率的影響

與control組相比，blank組心肌梗死面積率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），IRI組顯著增加（P＜0.01）。JWDSY預處理IRI模型后，心肌梗死面積率與模型組相比顯著降低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 TTC染色檢測心肌梗死面積

2.2 ELISA法檢測各組ODC含量變化

各組ODC含量變化，與control組相比，blank組無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與blank組相比，IRI組ODC含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；JWDSY預處理IRI模型后，ODC含量與IRI組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2。

2.3 各組ODC mRNA表達的比較

Realtime PCR檢測心肌細胞內ODC mRNA表達。結果顯示：與control組相比，blank組無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與IRI組相比，IRI模型組ODC mRNA表達有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。JWDSY預處理IRI模型后，ODC mRNA表達有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3。

圖2 ELISA檢測ODC含量變化

圖3 Realtime PCR檢測心肌細胞ODC mRNA表達

2.4 Western blot檢測各組ODC蛋白表達的差異

與control組比較,blank組ODC相對表達量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），IRI組ODC蛋白表達有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。JWDSY預處理IRI組ODC蛋白表達與IRI組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖4、圖5。

圖4 Western blot檢測ODC蛋白表達

2.5 各組多胺含量的比較

與對照組比較，IRI組的精胺在缺血再灌注90 min后減少具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而腐胺在缺血再灌注90 min后逐漸增加具有統(tǒng)計學意義(P＜ 0.01)，精脒變化較小，總多胺池減少具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；加味丹參飲預處理后，腐胺逐漸減少具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，精胺和總多胺池含量增加(P＜0.05)，見圖6。

圖5 Western blot檢測ODC蛋白表達條帶

圖6 各組大鼠心肌組織多胺含量變化

3 討論

多胺包括腐胺、精胺和精脒，細胞內多胺的水平主要受多胺合成及逆轉化分解的調節(jié)，ODC作為多胺合成代謝限速酶能精確調控多胺的平衡和代謝[7]。多胺具有廣泛生物學作用，參與著體內多種生理病理過程，與多種疾病關系密切，耗竭細胞內的多胺可誘導細胞凋亡。轉基因小鼠和大鼠ODC過度表達，表現(xiàn)出高水平的腐胺,尤其是在大腦和睪丸，發(fā)作閾值升高，缺血再灌注損傷梗塞出現(xiàn)較慢，體積較小[8]。多胺與胰腺炎，以及炎癥相關疾病也密切相關[9]。精胺介導二氮嗪改善大鼠腦缺血再灌注損傷時的神經功能缺損并減少梗死面積和氧化應激[10]。Sigrist等建立記憶障礙（age-induced memory impairment AMI）模型發(fā)現(xiàn)，亞精胺藥物治療或調節(jié)內源性多胺水平都可以緩解記憶障礙，這種影響嚴格依賴于自噬[7]。研究發(fā)現(xiàn)在心肌缺血再灌注損傷時，多胺代謝失衡，ODC活性改變[11]。ODC的活性在十余分鐘內的短暫缺血階段中與缺血時間呈正相關關系[12]。ODC/多胺系統(tǒng)在心肌缺血再灌注損傷[13]和缺血預適應心肌保護中具有重要地位[14]。中醫(yī)藥是否能促進內源性多胺合成，從而調控ODC活性，目前尚未見報道。

本研究采用整體實驗，造成大鼠心肌缺血再灌注病理模型。研究發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注時，ODC活性增強，ODC mRNA和蛋白表達均顯著升高，與假手術組和對照組相比有統(tǒng)計學意義。同時發(fā)現(xiàn)ODC活性改變后，腐胺顯著增加，總多胺池水平下降，尤其是精胺含量減少。ODC是多胺合成代謝的限速酶，表明了心肌缺血再灌注損傷時，可能誘導ODC活性改變，ODC催化鳥氨酸生成腐胺增加，精胺減少，總多胺池含量減少，可見精胺與心肌缺血再灌注損傷關系密切。

加味丹參飲全方益氣活血，通絡止痛，用于氣虛血瘀的冠心病有良好的治療效果，加味丹參飲預處理對防治心肌IRI具有重要作用[2-4]，本次研究結果顯示，加味丹參飲預處理缺血再灌注損傷模型后，ODC含量顯著減少，ODC mRNA和蛋白表達均顯著降低，與缺血再灌注損傷組有統(tǒng)計學意義，提示加味丹參飲可能通過調節(jié)ODC活性，調控多胺代謝途徑，減少IRI后腐胺生成，增加多胺池總量，從而發(fā)揮對缺血再灌注損傷后心肌的保護作用，其具體的機制有待進一步深入研究。

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（本文編輯 李杰）

Study of Modified Danshen Decoction Pretreatment on Adjusting ODC Activity Against the Rats Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

REN Ting,YANG Shenghui,RAO Chunmei,PENG Xia,SUN Yanbo,WU Ruoxia,CHEN Cong, CHENG Xihua*,HUANG Zhengde*
（Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China）

ObjectiveTo explore the protective mechanism of modified Danshen decoction on SD rats myocardial ischemia-reperfusion injury(IRI)by ornithine decarboxylase(ODC)activity.MethodsThe SD rat models of myocardial IRI were established,the four groups of control group,sham-operation group,ischemia/reperfusion(IRI)group,Jiawei Danshen Decoction (JWDSY)+IRI group were assigned.The content of ODC was determined by ELISA method.The ODC mRNA expression level was detected by fluorescence quantitative RT-PCR method.The ODC protein expression level was detected by Western blot method,and the polyamine content was determined by HPLC.ResultsCompared with the control group,the content of ODC,ODC mRNA and protein expression level in sham-operationa group were increased,the difference had no statistically significant(P＞0.05),while compared with the sham-operation group,the content of ODC,ODC mRNA and protein expression level in IRI group were increased significantlay(P＜0.01).Compared with IRI group,the ODC content in JWDSY+IRI group was significantly reduced,and the ODC mRNA and protein expression level were decreased significantly,the difference was statistically significant(P＜0.01).ConclusionModified Danshen decoction could adjust the ODC activity,and then play a protective effect on myocardium after IRI.

modified Danshen decoction;cardiac muscle;ischemia reperfusion injury;polyamine;orinithine decarboxylase

R285.5；R541.4

A

2016-08-13

國家自然科學基金資助項目（81373576，81503536)；湖南省教育廳項目（14B136，14C0872）；湖南省中醫(yī)藥管理局重點課題(201304）；湖南省科技廳一般項目（2014SK3034）；中西醫(yī)結合防治心腦疾病的相關基礎研究湖南省高?？萍紕?chuàng)新團隊科研項目（5）。

任婷，女，博士研究生，講師，研究方向：心血管疾病的中醫(yī)藥防治研究。

*黃政德，男，教授，博士研究生導師，E-mail:Hzd112@163.com；*成細華，女，教授，碩士研究生導師，E-mail:1357655170@qq.com。