張 燦，崔涵雨，韓玉鳳，王現(xiàn)平，何 銘，陳 波，劉 源

基于多克隆抗體包被磁性納米粒子的ELISA法檢測(cè)西維因

張 燦1，崔涵雨1，韓玉鳳1，王現(xiàn)平1，何 銘1，陳 波2，劉 源2

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.鎮(zhèn)江藥品檢驗(yàn)所，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

建立一種基于抗體包被氨基化Fe3O4磁性納米粒子，建立免疫磁珠酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法用于檢測(cè)氨基甲酸酯農(nóng)藥西維因。結(jié)果表明：在最佳條件下，西維因質(zhì)量濃度在1×10－3～10 mg/L范圍內(nèi)，建立的免疫磁珠ELISA法具有較好的線性關(guān)系（y=8.87lnx＋72.77，R2=0.994），抑制率最高可達(dá)90.6%；測(cè)得的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.077 mg/L，檢出限（IC15）為1.48×10－3mg/L。以質(zhì)量濃度1 mg/L的西維因在相同條件下重復(fù)檢測(cè)3 次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.67%。以大米和卷心菜為實(shí)際樣品進(jìn)行西維因加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，通過(guò)免疫磁珠ELISA法測(cè)得的回收率為70.5%～123.1%，同時(shí)采用高效液相色譜法進(jìn)行相關(guān)性驗(yàn)證，結(jié)果表明，2 種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性較好（R2=0.91）。通過(guò)一系列分析表明，所建立的抗體包被磁性納米粒子ELISA法可用于快速檢測(cè)西維因。

西維因；免疫磁珠；酶標(biāo)記免疫分析；檢測(cè)；相關(guān)性

西維因，1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯，屬于氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，20世紀(jì)50年代以其相對(duì)低毒、高效進(jìn)入市場(chǎng)，成為繼有機(jī)磷農(nóng)藥后應(yīng)用最廣泛的農(nóng)藥[1-3]。目前，西維因的檢測(cè)方法主要包括儀器分析[4-6]，以生物抗體為識(shí)別元件的免疫分析[7-9]和傳感器技術(shù)[10-12]。其中基于抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的免疫分析檢測(cè)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)快速便捷的優(yōu)點(diǎn)，主要的檢測(cè)形式有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法[13-14]和試紙快速檢測(cè)技術(shù)[15-16]。

免疫磁珠（immune magnetic beads，IMB）作為一種新型免疫分析方法，具備固相化試劑的特有優(yōu)點(diǎn)和免疫學(xué)高度專一性的特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、微生物檢測(cè)等方面得到了廣泛的應(yīng)用與發(fā)展[17-20]。IMB對(duì)物質(zhì)的檢測(cè)有2 種方式：直接法和間接法。直接IMB法具有檢測(cè)流程簡(jiǎn)單，步驟簡(jiǎn)化，有效縮短檢測(cè)時(shí)間，適合應(yīng)用于食品安全快速檢測(cè)領(lǐng)域[21-22]。

本研究通過(guò)合成西維因半抗原，將其與載體蛋白偶聯(lián)形成完全抗原免疫動(dòng)物制備西維因多克隆抗體。采用一步水熱法制備氨基功能化四氧化三鐵磁性納米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs），以戊二醛為偶聯(lián)劑將西維因抗體與四氧化三鐵MNPs結(jié)合作為IMB識(shí)別元件，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記西維因半抗原制備酶標(biāo)抗原為信號(hào)放大器，通過(guò)直接競(jìng)爭(zhēng)實(shí)現(xiàn)對(duì)西維因的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程如圖1所示。

圖1 IMB的制備及檢測(cè)過(guò)程Fig. 1 Schematic illustration of the preparation of IMB

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米、卷心菜 市購(gòu)；西維因、克百威、異丙威、速滅威、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysulfosuccinimide，NHS）、N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、對(duì)硝基苯氯甲酸酯、二氯甲烷、吡啶、四氫呋喃、乙二醇、己二胺、無(wú)水醋酸鈉、FeCl3·6H2O、25%戊二醛（均為分析純）上海百靈威化工科技有限公司；血藍(lán)蛋白、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）上海西格瑪試劑公司；α-萘酚、6-氨基己酸、無(wú)水硫酸鈉、甲醇、乙醇乙酸乙酯、石油醚、Na2HPO4?12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl（均為分析純） 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

W2-100SP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；XSeries Ⅱ電感耦合等離子體質(zhì)譜、傅里葉變換紅外分光光度計(jì) 美國(guó)賽默飛世爾公司；Cary 100-Bio紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司；HH-A恒溫磁力攪拌器江蘇金壇市中大儀器廠；FA1004電子天平 上海浦東榮豐科技儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Inf nite 200多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；JEM-2100透射電子顯微鏡 日本JEOL公司；1100高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 西維因抗原的合成

西維因半抗原的合成參照文獻(xiàn)[23]，合成目標(biāo)化合物6-（1-萘氧基甲酰胺基）己酸。將目標(biāo)物6-（1-萘氧基甲酰胺基）己酸和1.5 mmol/L NHS溶液，溶于5 mL N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）中，冰浴磁力攪拌條件下逐滴加入1.5 mmol/L DCC溶液，攪拌過(guò)程中有混濁物產(chǎn)生，反應(yīng)6 h后，轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱過(guò)夜。次日取出離心去除沉淀，將上層活化酯液加入到10 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL BSA溶液（溶于0.01 mol/mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS））中，放于4 ℃攪拌反應(yīng)5 h后裝入透析袋，4 ℃條件下PBS透析3 d，分裝備用，得到完全抗原。

1.3.2 抗體制備

西維因多克隆抗體為實(shí)驗(yàn)室自制，選擇雄性新西蘭大耳白兔，體質(zhì)量約2 kg，月齡3 個(gè)月，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，連續(xù)觀察7 d，確定身體狀況正常后開(kāi)始免疫。初次免疫劑量為1 mg完全抗原溶解于0.9% NaCl溶液0.5 mL，加入等量的弗氏完全佐劑充分混合乳化，采取背部皮下多點(diǎn)注射免疫。加強(qiáng)免疫時(shí)用不完全佐劑，免疫原劑量減半，每隔2 周加強(qiáng)免疫一次，4 次加強(qiáng)免疫后，血清效價(jià)達(dá)到平臺(tái)期進(jìn)行頸動(dòng)脈采全血。離心分離得到的血清采用Protein A-Sepharose 4B作親和層析介質(zhì)純化得到抗體蛋白，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度經(jīng)計(jì)算質(zhì)量濃度為5 mg/mL。

1.3.3 IMB的制備

IMB的制備方法參照文獻(xiàn)[24]，第1步合成表面氨基功能化Fe3O4磁性納米材料，第2步以戊二醛為交聯(lián)劑將氨基化Fe3O4磁性納米材料與西維因抗體偶聯(lián)制備IMB。將10 mg氨基化，MNPs溶于10 mL PBS中，加入25%戊二醛溶液2.5 mL，于25 ℃條件下攪拌反應(yīng)2 h。PBS洗滌3 次后用磁石收集，定容至10 mL，加入5 μmol/L抗體于37 ℃條件下攪拌2 h。PBS洗滌3 次后用磁石收集，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的IMB，于4 ℃貯存。

1.3.4 酶標(biāo)抗原稀釋比例

西維因酶標(biāo)抗原的制備步驟同1.3.1節(jié)，將活化酯溶液與載體蛋白HRP進(jìn)行偶聯(lián)，得到西維因的酶標(biāo)抗原。將150 μL制得的IMB加入1.5 mL離心管，將西維因酶標(biāo)抗原用PBS稀釋成不同比例（1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000），分別加入離心管，每個(gè)100 μL，37 ℃條件下振蕩反應(yīng)一定時(shí)間，PBS洗滌，加入底物顯色。1.25 mol/L硫酸溶液終止后，通過(guò)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

1.3.5 反應(yīng)平衡時(shí)間

將150 μL制得的IMB加入1.5 mL離心管，選取反應(yīng)時(shí)間5、10、20、30、40、50、60、70、80 min，將西維因酶標(biāo)抗原與1 mg/L西維因標(biāo)準(zhǔn)液各50 μL加入管中，37 ℃條件下振蕩反應(yīng)，PBS洗滌，加入底物顯色。1.25 mol/L硫酸溶液終止后，通過(guò)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

1.3.6 IMB檢測(cè)農(nóng)藥西維因

酶標(biāo)抗原稀釋比例及反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化后，建立IMB檢測(cè)農(nóng)藥西維因，通過(guò)測(cè)定得到吸光度計(jì)算抑制率，并繪制抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)物質(zhì)量濃度與抑制率呈正比關(guān)系，通過(guò)測(cè)定吸光度，計(jì)算得到抑制率帶入抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定待測(cè)物質(zhì)量濃度。吸光度測(cè)定條件為：檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，參比波長(zhǎng)650 nm。抑制率按下式計(jì)算。

式中：ABlank、AControl、A[C]分別為空白、不含西維因和含有西維因的吸光度；[C]為西維因的質(zhì)量濃度/（mg/L）。

1.3.7 交叉反應(yīng)

選取速滅威、克百威和異丙威3 種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥為結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。將150 μL制得的IMB加入1.5 mL離心管，將優(yōu)化質(zhì)量濃度后的西維因酶標(biāo)抗原與一系列不同質(zhì)量濃度的西維因、速滅威、克百威和異丙威標(biāo)準(zhǔn)溶液各50 μL加入孔中，PBS洗滌2 次，加入150 μL TMB底物顯色，再加入50 μL 1.25 mol/L硫酸溶液終止后，通過(guò)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，并計(jì)算抑制率。

1.3.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)不含西維因的大米和卷心菜樣品進(jìn)行添加回收率的測(cè)定。將樣品剪切成細(xì)碎狀，各稱取2 g，樣品添加西維因含量分別為0.05、0.5、1 mg/kg。用6 mL甲醇溶液浸沒(méi)，200 r/min條件下振蕩30 min，上清液過(guò)膜稀釋后與酶標(biāo)抗原各50 μL加入裝有IMB的1.5 mL離心管，按優(yōu)化的反應(yīng)條件，結(jié)果通過(guò)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定。

同時(shí)采用高效液相色譜法作為對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的驗(yàn)證，高效液相色譜的檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[25]，采用C18柱，以乙腈-水（2∶3，V/V）溶液為流動(dòng)相，流速為1 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)機(jī)理的研究

通過(guò)對(duì)西維因半抗原的合成目標(biāo)化合物6-（1-萘氧基甲酰胺基）己酸進(jìn)行質(zhì)譜分析，m/z 324.35是M＋Na峰，m/z 625.00為2M＋Na峰，質(zhì)譜結(jié)果顯示合成的物質(zhì)與目標(biāo)半抗原分子質(zhì)量一致，表明半抗原目標(biāo)化合物合成成功。采用直接競(jìng)爭(zhēng)法，將西維因待測(cè)液與西維因酶標(biāo)抗原同時(shí)與IMB上西維因抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，形成待測(cè)液-酶標(biāo)抗原-抗體-IMB復(fù)合物，在外加磁場(chǎng)的作用下，復(fù)合物集聚在離心管底部，目標(biāo)物質(zhì)量濃度越高，酶標(biāo)抗原結(jié)合越少，在底物作用下，顏色越淺，顯現(xiàn)出不同深淺的變化，如圖2所示，通過(guò)多功能酶標(biāo)儀測(cè)得吸光度，繪制質(zhì)量濃度-抑制曲線，達(dá)到定量檢測(cè)西維因。以未結(jié)合抗體的MNPs為參照，與IMB同時(shí)檢測(cè)西維因，結(jié)果如圖3所示，未結(jié)合抗體的MNPs對(duì)西維因沒(méi)有特異性吸附，不具有規(guī)律性的抑制率變化，而IMB對(duì)西維因具有規(guī)律性變化表明IMB對(duì)西維因的特異性吸附是由MNPs表面結(jié)合的抗體造成。

圖2 IMB檢測(cè)不同質(zhì)量濃度西維因的結(jié)果示意圖Fig. 2 Results of IMB detection of different concentrations of carbaryl

圖3 MNPs和IMB檢測(cè)西維因的抑制率變化Fig. 3 Inhibition rates of MNPs and IMB for carbaryl detection

2.2 氨基化Fe3O4磁性納米材料的表征

選取一步水熱法制得的氨基化MNPs，采用傅里葉紅外分光光度計(jì)及透射電鏡對(duì)其進(jìn)行表征，如圖4所示。從圖4a可以看出，氨基化MNPs的特征峰：756 cm－1處的強(qiáng)峰表明Fe—O官能團(tuán)的存在；1 701、1 402 cm－1和1 118 cm－1分別是N—H的彎曲振動(dòng)和C—N的伸縮振動(dòng)，以上說(shuō)明成功合成出帶有氨基功能基團(tuán)的MNPs；從圖4b可以看出，氨基化MNPs具有較好的分散性且形態(tài)較完整。

圖4 磁性納米材料的傅里葉紅外光譜圖（a）和透射電鏡圖（b）Fig. 4 FT-IR spectrum (a) and transmittance electron microscopy (TEM) (b) images of MNPs

2.3 酶標(biāo)抗原稀釋比例的優(yōu)化

通過(guò)多功能酶標(biāo)儀讀數(shù)，選取吸光度處于0.8～1.0之間所對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)抗原稀釋比例。本實(shí)驗(yàn)中酶標(biāo)抗原稀釋比例為1∶4 000時(shí)吸光度為0.912 6，故選取1∶4 000為反應(yīng)的最佳酶標(biāo)抗原稀釋比例。

2.4 反應(yīng)平衡時(shí)間的優(yōu)化

采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定不同吸附時(shí)間條件下IMB的吸光度變化。在0～40 min，吸光度逐漸升高，說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)逐漸達(dá)到平衡，40 min后，吸光度變化趨于平緩，表明40 min時(shí)反應(yīng)基本達(dá)到平衡。故選取40 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.5 交叉反應(yīng)測(cè)定

選擇速滅威、克百威和異丙威3 種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥進(jìn)行交叉反應(yīng)，如圖5所示，IMB對(duì)目標(biāo)物西維因的抑制率變化明顯高于其他3 種結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，說(shuō)明制備的IMB對(duì)西維因具有較高的特異識(shí)別性。

圖5 IMB對(duì)西維因、速滅威、克百威和異丙威的交叉反應(yīng)Fig. 5 Cross-reactivity of IMB for the detection of carbaryl, metolcarb, carbfuran and isoprocarb

2.6 IMB檢測(cè)農(nóng)藥西維因

在本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的最佳條件下，IMB測(cè)得西維因質(zhì)量濃度在1×10－3～10 mg/L范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系（y=8.87lnx＋72.77，R2=0.994），抑制率最高可達(dá)到90.6%，如圖6所示，測(cè)得的西維因半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.077 mg/L，檢出限（IC15）為1.48×10－3mg/L。選取1 mg/L質(zhì)量濃度的西維因在相同條件下重復(fù)3 次檢測(cè)，測(cè)得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.67%。

圖6 IMB檢測(cè)不同質(zhì)量濃度西維因的抑制率變化Fig. 6 Inhibition rates of different concentrations of carbaryl detected by IMB

2.7 實(shí)際樣品中的應(yīng)用

為了評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)建立的方法的精確性，采用高效液相色譜方法作為對(duì)照，進(jìn)行加標(biāo)測(cè)定回收率實(shí)驗(yàn)。如表1所示，IMB回收率在70.5%～123.1%之間。與高效液相色譜法具有較好的相關(guān)性（R2=0.91），如圖7所示。表明IMB方法可以用于大米和卷心菜樣中西維因的檢測(cè)。

表1 大米和卷心菜樣品中西維因的加標(biāo)回收率結(jié)果（n==33）Table1 Spiked recoveries for carbaryl in rice and Chinese cabbage (n == 33))

圖7 IMB和HPLC檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性Fig. 7 Correlation curve between IMB and HPLC

3 結(jié) 論

人工合成西維因半抗原，將其與載體蛋白偶聯(lián)免疫新西蘭大耳白兔得到西維因多克隆抗體，純化得到質(zhì)量濃度為5 mg/mL的抗體。一步水熱法制得的氨基化MNPs，通過(guò)透射電鏡和傅里葉紅外分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行表征。采用戊二醛法偶聯(lián)抗體和氨基功能化MNPs，以未包被抗體的MNPs為對(duì)照，檢測(cè)不同質(zhì)量濃度西維因，包被有抗體的IMB顯現(xiàn)出有規(guī)律的變化且具有較好的抑制率而未包被抗體的MNPs未顯現(xiàn)一定規(guī)律，表明成功合成具有特異性吸附能力的IMB，且對(duì)西維因的檢測(cè)是由MNPs上包被的抗體所實(shí)現(xiàn)的。

通過(guò)優(yōu)化酶標(biāo)抗原稀釋比例、反應(yīng)平衡時(shí)間等條件，建立的IMB-ELISA法測(cè)得西維因質(zhì)量濃度在1×10－3～ 10 mg/L范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系（y=8.87lnx＋72.77，R2=0.994），抑制率最高可達(dá)到90.6%，IC50為0.077 mg/L，檢出限（IC15）為1.48×10－3mg/L。以1 mg/L質(zhì)量濃度的西維因在相同條件下重復(fù)3 次檢測(cè)，測(cè)得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.67%。另外，以大米和卷心菜為實(shí)際樣品進(jìn)行加標(biāo)測(cè)定回收率實(shí)驗(yàn)。采用高效液相色譜法為對(duì)照，建立的IMB-ELISA法測(cè)得的回收率在70.5%～123.1%之間，與高效液相色譜法得到的結(jié)果具有較好的相關(guān)性（R2=0.91）。通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)，得出結(jié)論：所建立的IMB-ELISA法能夠有效實(shí)現(xiàn)對(duì)西維因的快速檢測(cè)且該方法操作簡(jiǎn)便快捷。

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Development of Immunoagnetic Bead-Based ELISA for the Detection of Carbaryl

ZHANG Can1, CUI Hanyu1, HAN Yufeng1, WANG Xianping1, HE Ming1, CHEN Bo2, LIU Yuan2
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China; 2. Zhenjiang Institute for Drug Control, Zhenjiang 212000, China)

This paper develops an immunomagnetic bead-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of carbaryl. Under optimum conditions, the method exhibited a good linear relationship in the range of 1 × 10-3-10 mg/L, with a correlation coefficient (R2) of 0.994. The maximum inhibition rate reached 90.6%, and the halfmaximum inhibitory concentration (IC50) was 0.077 mg/L. The detection limit (LOD) of this method was 1.48 × 10-3mg/L. The precision for three replicate detections of carbaryl (1 mg/L) was 1.67% (relative standard deviation, RSD). The recovery of rice and Chinese cabbage spiked with carbaryl was between 70.5% and 123.1%. Also, it was found that the detection results were highly correlated with those obtained by high performance liquid chromatography (R2= 0.91). In conclusion, the immunomagnetic bead-based ELISA can be used for rapid detection of carbaryl.

carbaryl; immunomagnetic beads; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); detection; correlation

10.7506/spkx1002-6630-201702046

TS201.6

A

1002-6630（2017）02-0296-05

張燦, 崔涵雨, 韓玉鳳, 等. 基于多克隆抗體包被磁性納米粒子的ELISA法檢測(cè)西維因[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 296-300. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702046. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Can, CUI Hanyu, HAN Yufeng, et al. Development of immunoagnetic bead-based ELISA for the detection of carbaryl[J]. Food Science, 2017, 38(2): 296-300. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702046. http://www.spkx.net.cn

2016-06-01

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31000783）；鎮(zhèn)江市科技支撐項(xiàng)目（SH2014019）；江蘇大學(xué)2016年大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新項(xiàng)目（136）

張燦（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：zhangcan@mail.ujs.edu.cn