郭婧瀾，譚蓓蓓，葉婷

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.核醫(yī)學(xué)科，四川瀘州646000）

臨床論著

MicroRNA-300在膽管癌患者血清中的表達(dá)及其臨床意義*

郭婧瀾1，譚蓓蓓2，葉婷1

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.核醫(yī)學(xué)科，四川瀘州646000）

目的探討microRNA-300（miR-300）在膽管癌患者及健康對(duì)照血清中的表達(dá)及其在診斷和判斷預(yù)后方面的臨床價(jià)值。方法選取107例膽管癌患者和107例健康對(duì)照的血清標(biāo)本，提取血清總RNA，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血清miR-300的表達(dá)水平，并繪制ROC曲線檢測(cè)miR-300在膽管癌中的診斷價(jià)值；采用χ2檢驗(yàn)、Kaplan-Meier法分析miR-300的表達(dá)水平與膽管癌患者臨床特征及患者5年總體生存率之間的關(guān)系。結(jié)果膽管癌患者血清中miR-300的表達(dá)水平高于健康對(duì)照者（P＜0.05），且在術(shù)后降低；miR-300為膽管癌有效的診斷指標(biāo)；血清miR-300的表達(dá)與膽管癌患者的臨床分期密切相關(guān)（P=0.010），而與年齡、性別及分化程度無相關(guān)；血清miR-300高表達(dá)的膽管癌患者5年總體生存率低于血清miR-300低表達(dá)患者。結(jié)論膽管癌患者血清中miR-300表達(dá)增高，是膽管癌臨床診斷和判斷預(yù)后的有效分子指標(biāo)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

miR-300；診斷；預(yù)后；膽管癌

膽管細(xì)胞癌是起源于肝內(nèi)或肝外膽管的一組異質(zhì)性的并以膽管分化為主要病理特征的癌癥[1-2]。膽管細(xì)胞癌發(fā)病率在肝膽系統(tǒng)腫瘤中高居第2位，且在近幾十年來呈逐年上升趨勢(shì)[3]。膽管癌對(duì)放、化療等傳統(tǒng)治療手段敏感性極低，且早期易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移，5年生存率僅5％～10％[4-5]。目前根治性切除術(shù)是膽管癌的首要治療方法，但由于缺少有效的早期診斷方法，大部分患者初次就診時(shí)腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移而失去手術(shù)機(jī)會(huì)。因此，尋找膽管癌早期診斷和判斷預(yù)后的分子對(duì)提高膽管癌患者的術(shù)后生存期及生存質(zhì)量有著至關(guān)重要的作用。

MicroRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸大小，進(jìn)化上相對(duì)保守的非編碼小分子RNA，主要通過與靶基因的3’-UTR區(qū)域結(jié)合抑制靶基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控其下游信號(hào)通路而參與多種生理進(jìn)程[6-8]。研究表明[9-10]，miRNA在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中同樣發(fā)揮著重要的作用，多種miRNA可通過影響膽管癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移能力而調(diào)控膽管癌的進(jìn)展。此外，新的研究結(jié)果顯示[11-14]多種miRNA在膽管癌患者血清或膽汁中可穩(wěn)定表達(dá)，并可作為膽管癌患者早期診斷指標(biāo)。本研究將檢測(cè)膽管癌患者血清中miR-300的表達(dá)并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析miR-300在膽管癌中的診斷及判斷預(yù)后的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對(duì)象選取2007年7月-2010年12月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的膽管癌患者107例以及同期健康對(duì)照者107例。所有入選者的臨床資料完整。病例納入標(biāo)準(zhǔn)如下：膽管癌患者均經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)確診為膽管癌，且均為初診初治患者；入組患者術(shù)前均未接受任何放、化療和生物治療；入組患者肝腎功能未見顯著異常；未合并其他腫瘤或嚴(yán)重心腦血管疾病。入組患者術(shù)前、術(shù)后空腹各采血5ml，真空干燥管中保存，1 500 r/min離心10 min，置入-80℃冰箱冷凍保存待測(cè)。本研究經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選者均同意使用其血清標(biāo)本用于科學(xué)研究并簽署知情同意書。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器MicroRNA-300（miR-300）和內(nèi)參U6引物購(gòu)自上海吉瑪科技有限公司，Trizol細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)Initrogen公司，miRcute miRNA提取分離試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，miRNA逆轉(zhuǎn)錄引物及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，SYBR Premix試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，糖類抗原19-9定量測(cè)定試劑盒（電化學(xué)發(fā)光法）購(gòu)自瑞士羅氏公司。主要儀器如下：美國(guó)羅氏Cobas e 601電化學(xué)發(fā)光分析儀，美國(guó)ABI公司7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）儀，美國(guó)Thermo公司-80℃冰箱，美國(guó)Eppendorf公司臺(tái)式低溫高速離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 miR-300的提取及逆轉(zhuǎn)錄參照miRcute miRNA提取分離試劑盒所述步驟提取血清miR-300。具體步驟如下：200μl血清中加入等體積裂解液，12 000 r/min離心10 min后加入氯仿。震蕩后12 000 r/min離心30 s，取水相層轉(zhuǎn)移至新的EP管中。加入轉(zhuǎn)移液體積1/3的無水乙醇，轉(zhuǎn)入吸附柱，12 000 r/min離心30 s。重復(fù)過柱離心后，加入500μl去蛋白液，12 000 r/min離心30 s。而后加入漂洗液，12 000 r/min離心2 min。向吸附柱中加入30μl去離子水，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min，所得即為提取的miRNA。紫外分光儀檢測(cè)RNA濃度及純度。應(yīng)用特異性miRNA逆轉(zhuǎn)錄引物，并將miRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，每個(gè)逆轉(zhuǎn)錄體系中含有10 ng的RNA模板。逆轉(zhuǎn)錄的條件：15℃20 min，42℃30min，85℃5min。

1.2.2 qRT-PCR反應(yīng)條件為95℃10 s，95℃20 s，62℃40 s，共設(shè)40個(gè)循環(huán)。采用的相對(duì)定量法計(jì)算miR-300的相對(duì)表達(dá)量（F），F(xiàn)=2-Δct，Δct=ctmiR-300-ctU6，其中ct為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.2.3 血清CA19-9含量檢測(cè)血清稀釋后，使用電化學(xué)發(fā)光分析儀及配套CA19-9檢測(cè)試劑盒對(duì)膽管癌患者血清CA19-9進(jìn)行檢測(cè)，參考值為0～34 u/ml。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，膽管癌患者及健康對(duì)照者血清miR-300組間比較用t檢驗(yàn)，血清miR-300與膽管癌患者臨床特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，繪制受試者工作曲線（ROC），評(píng)估血清miR-300及CA19-9在膽管癌患者中的診斷價(jià)值，采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗(yàn)分析膽管癌患者各組間生存差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-300在膽管癌患者和健康對(duì)照者血清中的表達(dá)水平

通過qRT-PCR檢測(cè)膽管癌患者和健康對(duì)照者血清中miR-300的表達(dá)，結(jié)果顯示，膽管癌患者血清中miR-300的表達(dá)量為（4.071±1.625），健康對(duì)照血清中miR-300的表達(dá)量為（2.171±1.055）。膽管癌患者血清中miR-300的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.237，P=0.014），見圖1。

圖1 膽管癌患者及健康對(duì)照血清中miR-300的表達(dá)量

2.2 miR-300在膽管癌患者術(shù)前及術(shù)后血清中的表達(dá)

通過qRT-PCR檢測(cè)膽管癌患者術(shù)前和術(shù)后血清中miR-300的表達(dá)，結(jié)果顯示，膽管癌患者術(shù)前血清中miR-300的表達(dá)量為（4.071±1.625），術(shù)后血清中miR-300的表達(dá)量為（1.689±1.074）。膽管癌患者術(shù)后血清miR-300的表達(dá)低于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.198，P=0.021），見圖2。

2.3 miR-300在膽管癌中的診斷價(jià)值

根據(jù)血清miR-300的表達(dá)水平，建立miR-300和膽管癌篩查指標(biāo)CA19-9的ROC曲線，利用ROC曲線評(píng)價(jià)兩者在膽管癌中的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示，miR-300 ROC曲線下面積0.933（95％CI：0.903，0.964），敏感性為87.8％，特異性為84.1％；CA19-9 ROC曲線下面積為0.871（95％CI：0.826，0.917），敏感性為81.3％，特異性為85.9％，見圖3。血清miR-300和CA19-9在膽管癌中均具有較高的診斷價(jià)值。

2.4 miR-300與膽管癌患者臨床相關(guān)特征的關(guān)系

分析血清miR-300表達(dá)與膽管癌患者臨床特征（年齡、性別、臨床分期、分化程度）的關(guān)系。根據(jù)血清miR-300的表達(dá)水平，將膽管癌患者分為高表達(dá)組（n=61）與低表達(dá)組（n=46）。結(jié)果顯示，血清miR-300的表達(dá)水平與膽管癌患者的臨床分期密切相關(guān)，隨著膽管癌患者臨床分期的進(jìn)展，血清miR-300的表達(dá)亦逐漸升高，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.147，P=0.010）。血清miR-300的表達(dá)與膽管癌其他臨床特征，包括年齡、性別、分化程度均無相關(guān)性，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見附表。

2.5 miR-300與膽管癌患者5年生存率之間的關(guān)系

Kplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-300高表達(dá)組術(shù)后5年總體生存率低于血清miR-300低表達(dá)組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rank test：P=0.022）。見圖4。

圖2 膽管癌患者術(shù)前及術(shù)后血清中miR-300的表達(dá)

圖3 血清miR-300及CA19-9診斷膽管癌的ROC曲線

圖4 血清miR-300與膽管癌患者術(shù)后5年總體生存率之間的關(guān)系

附表血清miR-300表達(dá)與膽管癌患者臨床相關(guān)資料的關(guān)系例

3 討論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNA可穩(wěn)定存在于血液、尿液和膽汁等生理液體中，更為重要的是血清中游離miRNA被證實(shí)為包括膽管癌在內(nèi)的多種腫瘤的有效診斷指標(biāo)之一，能夠穩(wěn)定地被檢測(cè)到并且在一定程度上提示腫瘤的狀態(tài)，是非常有前景的腫瘤標(biāo)志物[15-16]。本研究通過檢測(cè)膽管癌患者和健康對(duì)照者血清中miR-300的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照者比較，miR-300在膽管癌患者血清中表達(dá)上調(diào)。更為重要的是，在膽管癌患者術(shù)后，血清miR-300的表達(dá)下調(diào)，這說明miR-300為膽管癌特異性的miRNA，血清中miR-300的表達(dá)水平可在一定程度上反應(yīng)膽管癌的進(jìn)展情況。因此本研究進(jìn)一步分析血清miR-300在膽管癌中的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)血清miR-300可作為膽管癌有效的診斷指標(biāo)，具有較高的敏感性和特異性。本研究分析血清miR-300的表達(dá)與膽管癌患者臨床特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，隨著膽管癌患者臨床分期的進(jìn)展，血清miR-300的表達(dá)亦逐漸升高，但是miR-300的表達(dá)與膽管癌其他臨床特征，包括年齡、性別、分化程度均無相關(guān)性。本研究分析血清miR-300的表達(dá)與膽管癌患者術(shù)后5年生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示，血清miR-300高表達(dá)組的術(shù)后5年生存率較miR-300低表達(dá)組下降。

miR-300是長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，與多種腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。miR-300的功能具有組織和空間特異性，在不同腫瘤中可作為癌基因或抑癌基因而發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)[17]骨肉瘤組織中miR-300表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并與骨肉瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)[18]，在骨腫瘤中miR-300促進(jìn)細(xì)胞的增殖及侵襲，并通過潛在分子機(jī)制為靶向抑制BRD7分子表達(dá)。此外，在乳腺癌中miR-300可通過靶向抑制P53的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌的增殖。然而，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中，研究發(fā)現(xiàn)[19]miR-300可通過調(diào)控Twist的表達(dá)而抑制EMT和腫瘤的轉(zhuǎn)移。新近研究發(fā)現(xiàn)[20]，miR-300可穩(wěn)定存在于卵巢癌患者血清中，并可作為卵巢癌診斷的分子指標(biāo)。本研究探討miR-300在膽管癌患者血清中的表達(dá)及其在膽管癌中的診斷和預(yù)后方面的臨床價(jià)值，結(jié)果提示，血清miR-300的表達(dá)在膽管癌中顯著上調(diào)，且具有一定的特異性。此外，膽管癌患者術(shù)后血清miR-300的表達(dá)水平較術(shù)前降低，這說明隨著膽管癌組織的切除，血清miR-300的表達(dá)水平下降，血清miR-300的表達(dá)水平可在一定程度上反應(yīng)膽管癌組織中miR-300的表達(dá)水平，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)明確血清miR-300在膽管癌早期診斷中的特異性。更為重要的是，血清miR-300的表達(dá)與膽管癌患者臨床分析呈正相關(guān)，并具有較高的診斷和判斷預(yù)后的臨床價(jià)值。本研究結(jié)果提示miR-300在膽管癌中可能作為癌基因發(fā)揮作用。綜合既往研究和本研究，進(jìn)一步明確了miR-300的表達(dá)及功能具有組織和空間特異性，需進(jìn)一步的機(jī)制研究明確其在膽管癌中發(fā)揮癌基因作用的分子機(jī)制。

綜上所述，本研究證實(shí)膽管癌患者血清中miR-300表達(dá)高于健康對(duì)照組；膽管癌患者術(shù)后miR-300的表達(dá)水平下降；血清中miR-300為膽管癌有效的診斷指標(biāo)；膽管癌患者血清miR-300的表達(dá)水平與膽管癌患者的臨床分期密切相關(guān)；血清中miR-300高表達(dá)的膽管癌患者5年生存率低于血清miR-300低表達(dá)組。本研究為膽管癌發(fā)生及進(jìn)展的機(jī)制研究奠定了一定的前期基礎(chǔ)，為膽管癌的早期診斷及預(yù)后判斷提供了潛在靶點(diǎn)。

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（張蕾 編輯）

Expression of serum miR-300 in cholangiocarcinoma patients and clinical significance*

Jing-lan Guo1,Bei-bei Tan2,Ting Ye1
(1.Clinical Laboratory,2.Department of Nuclear Medicine,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveTo detect the expression of serum miR-300 in cholangiocarcinoma patients and discuss its clinical significance．MethodsSerum samples of 107 cholangiocarcinoma patients and 107 normal control patients were collected.Quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR)was used to detect the expression of serum miR-300.Diagnostic value of serum miR-300 in cholangiocarcinoma was analyzed by the receiver operating characteristic(ROC)curve.Associations between serum miR-300 expression and clinicopathologic features of cholangiocarcinoma patients were analyzed by χ2test.Association of serum miR-300 expression and 5-years overall survival of cholangiocarcinoma patients were analyzed by Kaplan-Meier methods．ResultsThe expression of serum miR-300 in the cholangiocarcinoma patients was statistically higher than that of the normal controls(P＜0.05), moreover,the expression of serum miR-300 was significantly down-regulated after surgery.The expression of serum miR-300 in the cholangiocarcinoma patients was significantly associated with clinical stage(P=0.010),but had no significant association with age,gender or differentiation status of cholangiocarcinoma.Cholangiocarcinoma patients with high serum miR-300 expression had a significantly lower 5-year overall survival rate compared to those with low serum miR-300 expression.ConclusionsThe expression of serum miR-300 is significantly up-regulated incholangiocarcinoma,and serum miR-300 is a promising diagnostic and prognostic biomarker in cholangiocarcinoma.

:miR-300;diagnosis;prognosis;cholangiocarcinoma

R735.8

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.007

1005-8982（2017）02-0042-05

2016-07-20

瀘州醫(yī)學(xué)院科研課題青年基金（No：2012QN-50）