王明芳 張文劍 王新紅 邢海青 趙園園

三氧化二砷對人子宮內膜癌細胞裸鼠模型中Caspase-3表達的影響

王明芳 張文劍 王新紅 邢海青 趙園園

目的 通過建立人子宮內膜癌細胞HEC-1-B裸鼠模型，檢測不同濃度三氧化二砷(As2O3)對移植瘤細胞Caspase-3表達的影響，并探討As2O3的作用機制。方法 建立人子宮內膜癌HEC-1-B細胞皮下移植瘤模型，按編號隨機分為實驗組即As2O3低(1.0 mg/kg)、中(2.5 mg/kg)、高(5.0 mg/kg)劑量組、空白對照生理鹽水(NS)組及陽性對照順鉑組(5.0 mg/kg)，連續(xù)腹腔給藥8天后，通過流式細胞儀及實時熒光定量RT-PCR 檢測移植瘤內Caspase-3相對表達量。結果 與生理鹽水組比較，低、中濃度As2O3及順鉑均可上調Caspase-3的表達(P<0.05)，但高濃度組上調不明顯(P>0.05)。與順鉑組比較，As2O3低劑量組作用最明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但與中、高濃度組比較，差異無統(tǒng)計學意義。結論 低濃度As2O3能上調人子宮內膜癌細胞內Capase-3的表達，且優(yōu)于順鉑，可能是三氧化二砷誘導細胞凋亡的作用機制之一。

三氧化二砷；子宮內膜癌；Caspase-3

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:009～011)

三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)俗稱砒霜，治療血液病效果顯著，而且對于某些實體瘤尤其是肝癌的治療亦見療效[1]，其抗腫瘤作用及其機制日益受到廣大學者的廣泛關注[2]。我們已在前期實驗中證實了As2O3對子宮內膜癌細胞的抑制增殖作用，本實驗旨在探討As2O3在體內抗腫瘤的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及實驗動物 人子宮內膜癌細胞株HEC-1-B細胞株，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。Balb/c-nu裸小鼠，40 只，4～6 周齡，雌性，體質量15～18 g，購自蘇州貝爾達實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于SPF(specific pathogen free condition)級動物實驗室。

1.1.2 藥物與試劑 As2O3購自哈爾濱伊達藥業(yè)有限公司，順鉑注射液購自豪森藥業(yè)股份有限公司，多克隆活性Caspase-3抗體購自BD公司，引物及熒光探針由上海生物公司合成，Trizol試劑盒購自In-vitrogen公司，Real-Time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與動物實驗模型的建立 將HEC-1-B細胞株貼壁培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、雙抗(青霉素100 u/mL，鏈霉素100 u/mL)的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2溫箱中，2天更換1次培養(yǎng)液，當細胞80%融合時傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化，制備成濃度3×107單細胞懸液0.2 mL，在超凈工作臺內接種于裸鼠的腋下，8天后均形成直徑0.5 cm以上的移植瘤。

1.2.2 裸鼠分組及給藥 將其按編號隨機分為5組，分別設為生理鹽水組，順鉑組(5.0 mg/kg)，As2O3低劑量組(1 mg/kg)、As2O3中劑量組(2.5 mg/kg)、As2O3高劑量組(5.0 mg/kg)。將As2O3和順鉑按比例(1∶100)在無菌條件下配成目標濃度，用無菌注射器抽取0.2 mL注入裸鼠腹腔，共給藥8天。24 h時后將裸鼠稱重后用摘眼球取血法處死，剝離腫瘤切塊后分別用無水乙醇、液氮速凍備用。

1.2.3 流式細胞測定 將經70%冰乙醇固定的部分腫瘤標本，在超凈工作臺內用研磨棒研碎，用400目濾網過濾，低速離心(800 r/min)去除碎片，PBS洗滌后，制成單細胞懸液，采用triton細胞打孔后加入PE標記的活性Caspase-3抗體，同時設立空白染色對照組，染色半小時后通過流式細胞儀進行Caspase-3活性的測定。采用Cellquest3.1f收集細胞，用ModfitLTV2.0軟件系統(tǒng)分析結果。

1.2.4 實時熒光定量PCR(Real-time PCR) 將液氮凍存腫瘤標本，剪成小塊并研磨成碎片，按照RNA提取說明書方式提取RNA，分光光度計檢測所提RNA260/280吸光值，選取比值在1.8～2.0之間的RNA樣本，按照TaKaRa反轉錄體系要求(反應條件為37° 15 min反轉錄反應，85° 5 s 失活反應)合成cDNA，以GDPT為管家基因，應用Rotor-Gene 3000 熒光定量PCR儀(Corbett Research 公司)進行PCR反應。用Roche Light Cycler probe design software 2.0軟件設計引物及探針，由上海生工公司合成。Caspase-3前引物序列：5’-AAATACCAGTGGAGGCCCGACTT-3’，后引物序列：5’-AAGCTTGTCGGCATACTGTTTCA-3’;Taq探針序列：5’-TGGCTCCTGGTT CATCCAGTCGCGCTT-3。GDPH前引物序列：5’-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3’，后引物序列：5’-GGCCATCCACAGTCTTCT-3’；Taq探針序列：5’-AAGA TCATCA GCA A TGCCTCCTGC-3’。按TAKARA說明書進行PCR熒光定量反應，PCR反應條件：預變性95°10 s，1cycle，PCR反應95° 5 s，60° 20 s，45cycle。測定CT值，采用2-△△CT法進行Caspase-3基因表達相對定量分析，CT值為熒光信號達到閾值時的循環(huán)數(shù)，△CT為同一樣本達到閾值時靶基因Caspase-3與對照基因GDPH擴增所需的循環(huán)數(shù)差值即△CT=CT(Caspase-3)-CT(GDPH)，2-△△CT值代表經GDPH校正后的靶mRNA的數(shù)目。公式：F=2-[(對照組目的基因平均Ct值-對照組管家基因平均Ct值)-(待測樣品目的基因平均Ct值-待測樣品管家基因平均Ct值)]

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測移植瘤內Caspase-3活性結果

前期實驗中應用流式細胞儀檢測到低濃度As2O3組和順鉑組均出現(xiàn)典型的細胞凋亡表現(xiàn)——亞G1峰，證實As2O3有誘導子宮內膜癌細胞凋亡的作用。本實驗進一步測定Caspase-3活性，發(fā)現(xiàn)與空白對照組比較，不同濃度的As2O3作用強度不同，其中低劑量As2O3組的熒光強度最強，說明其Caspase-3活性最大，順鉑組次之，生理鹽水組強度最小，說明Caspase-3活性最小。

2.2 Real-time PCR 檢測移植瘤內Caspase-3的表達

根據熒光定量曲線(圖1)，測定CT值，規(guī)定生理鹽水組基因表達量為1，則得順鉑組及低、中、高劑量As2O3組基因表達相對量，通過表1可見低、中劑量As2O3組和順鉑組Caspase-3基因表達量明顯高于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但高劑量組與生理鹽水組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，雖然數(shù)值上高于生理鹽水組。與順鉑組比較，As2O3低劑量組作用最高，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；而中、高劑量組與順鉑組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。說明As2O3低劑量組對Caspase-3表達的影響強于順鉑。

3 討論

子宮內膜癌(endometrial cancer，EC)近年發(fā)病率呈明顯上升和年輕化趨勢，死亡率高，危害性大。多個

表1 移植瘤內Caspase-3相對定量分析

注：a指與生理鹽水組比較，P<0.05；b指與順鉑組比較，P<0.05。

圖1 Caspase-3熒光定量曲線

實驗證實在子宮內膜癌中半胱氨酸蛋白酶Caspase-3的表達很低甚至無表達，明顯低于正常子宮內膜，而且表達水平越低，分化越差，提示子宮內膜癌凋亡失控與Caspase-3表達減少有密切關系[3]。三氧化二砷是一種細胞原漿毒物質，可以通過多種機制多靶點誘導細胞凋亡，其中三氧化二砷可以破壞線粒體跨膜電位，在線粒體損傷應答刺激下激活細胞內的Caspase-3，活化的Caspase-3再瀑布式激活Caspase-2，6，8，10等，最終水解核酸及細胞骨架蛋白，引起細胞凋亡[4]，Caspase-3被認為是凋亡事件的真正執(zhí)行者[2]。

本實驗中通過建立裸鼠模型，通過2種不同的檢測方法，均發(fā)現(xiàn)NS組Caspase-3的表達最低，經過三氧化二砷和順鉑處理后Caspase-3的表達均有所增加，其中低濃度組效果最明顯，中濃度組次之，有統(tǒng)計學意義，證實三氧化二砷能上調Caspase-3的表達。說明三氧化二砷上調Caspase-3可能是誘導子宮內膜癌細胞的凋亡的作用機制之一。多數(shù)研究表明，三氧化二砷抗腫瘤作用具有濃度、時間依賴關系，在低劑量時具有抑制細胞增殖、誘導凋亡的作用，高劑量時起細胞毒作用，造成病理性死亡[5]。這種效應的強度和細胞型別依賴性與ROS的水平不同有關，最終不同水平的ROS通過影響Caspase-3激活的活性及ATP水平決定細胞命運，出現(xiàn)不同的死亡方式[6]。本研究中發(fā)現(xiàn)三氧化二砷和順鉑均可影響Caspase-3的活性，但發(fā)現(xiàn)不同濃度的三氧化二砷對Caspase-3的影響不同，其中低濃度

三氧化二砷的作用最明顯，并高于順鉑對Caspase-3表達的影響，而高濃度組作用效果最差，進一步證實，三氧化二砷調節(jié)Caspase-3的作用與濃度相關，以低濃度最適宜。但與體外實驗不同的是，本實驗中三氧化二砷的抗子宮內膜癌作用不存在典型的濃度依賴關系。由于三氧化二砷治療劑量與中毒劑量接近，增加藥物劑量，就有增加毒性和副作用的可能。因此探索合適的劑量，達到最大效度的抑瘤作用而不增加毒副作用，有待于進一步的深入研究。

綜上所述，三氧化二砷可以上調Caspase-3的表達，可能是誘導子宮內膜癌細胞凋亡的機制。但三氧化二砷誘導細胞凋亡的機制是多通路、多靶點的，需要進一步深入研究并尋找最佳作用劑量。

[1] 邱從坤，陳國碩，王忠富.三氧化二砷治療肝癌的研究進展〔J〕.中華介入放射科電子雜志，2015，3(1):52-55.

[2] Fulda S.Targeting apoptosis for anticancer therapy〔J〕.Semin Cancer Biol，2015，31(4):84-88.

[3] 孫 炯，楊留才，李仕紅.Livin與Caspase-3在子宮內膜癌組織中的表達水平及相關性研究〔J〕.醫(yī)學綜述，2014，20 (9):1708-1710.

[4] Matos AJ，Santos AA.Advances in the understanding of the clinically relevant genetic pathway and molecular aspects of canine mammary tumours;part Ⅰ proliferation apoptosis and DNA repair〔J〕.Vet J，2015，205(2):136-143.

[5] 尹衛(wèi)華，胡小雄，范惠珍，等.不同劑量三氧化二砷靜滴聯(lián)合適形放療治療中晚期原發(fā)性肝癌〔J〕.山東醫(yī)藥，2014，54(3):32-34.

[6] Ghaffari SH，Momeny M，Bashash D，et al.Cytotoxic effect of arsenic trioxide on acute promyelocytic leukemia cells through suppression of NF-κβ-dependent induction of hTERT due to down-regulation of pin 1 transcription〔J〕.Hemaology，2012，17(4):198-206.

(編輯：甘 艷)

EFFECT of Arsenic Trioxide on Caspase-3 in Nude Mice Models of Human Endometrial Carcinoma Cell Lines(Hec-1B)

WANGMingfang，ZHANGWenjian，WANGXinhong，etal.

TheAffiliatedYiduCentralHospitalofWeifangMedicalUniversity，Qingzhou，262500

Objective To study the effect of arsenic trioxide(As2O3)on expression of Caspase-3 in nude mice models of human endometrial carcinoma cell lines(Hec-1B).Methods The nude mice models of endometrial carcinoma cell lines(Hec-1B)were randomized into 5 groups via number，then they were treated with NS，DDP，increasing concentrations of As2O3(1.0 mg/kg，2.5 mg/kg，5.0 mg/kg)by intraperitoneal injection.The Caspase-3 expression was detected by flow cytometry and real-time PCR.Results Compared with NS group，the As2O3(1 mg/kg、2.5 mg/kg)groups and DDP group increased significantly the expression of Caspase-3(P<0.05).But As2O3(5 mg/kg)group hadn’t distinguished effection.Compared with DDP group，the As2O3(1 mg/kg)group was statistically significant(P<0.05)，but the As2O3(2.5 mg/kg、5 mg/kg)groups weren’t.Conclusion(1 mg/kg)As2O3can increase the expression of Caspase-3，and was superior to DDP，the action may be one of mechanisms of arsenic trioxide inducing apoptosis.

Arsenic trioxide(As2O3);Endometrial carcinoma;Caspase-3

山東省衛(wèi)生廳青年基金資助項目(編號：2001CA2CKB6)

262500 山東省濰坊市益都中心醫(yī)院(王明芳，張文劍，王新紅，邢海青)；266005 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院(趙園園)

趙園園

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.01.003

R737.33

A

1001-5930(2017)01-0009-03

2016-09-30

2016-12-08)