鄭學(xué)嵩 王 映 蒙以良 謝有科

·基礎(chǔ)研究·

腫瘤囊泡包裝的甲氨蝶呤對(duì)肺癌A549細(xì)胞放療增敏作用的體外研究

鄭學(xué)嵩 王 映 蒙以良 謝有科

目的 探討腫瘤囊泡(tumor cell-derived microparticles,T-MP)包裝的甲氨蝶呤(MTX)對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549放療增敏作用及其機(jī)制。方法 MTT法檢測(cè)T-MP MTX對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、劃痕法、Western blot等方法檢測(cè)T-MP MTX聯(lián)合放療對(duì)A549細(xì)胞凋亡、遷移能力以及MMP-2、Nanog、Sox-2等蛋白表達(dá)變化。結(jié)果

甲氨蝶呤；腫瘤囊泡；放療增敏；細(xì)胞周期；同步化；凋亡

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:001～004)

放療是肺癌治療的重要手段，特別適合于無法手術(shù)、復(fù)發(fā)或存在多發(fā)轉(zhuǎn)移灶的患者，但至今放療效果仍不理想。為此，尋找高效的放療增敏藥物成為國(guó)內(nèi)外的研究人員的重要任務(wù)。已知處于M期和G2期細(xì)胞對(duì)放射最為敏感，甲氨蝶呤(MTX)、阿霉素、順鉑等許多化療藥物均可使腫瘤細(xì)胞阻斷于特定細(xì)胞周期而使腫瘤細(xì)胞同步化，從而提高放療敏感性。但這些藥物在損傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)也不同程度地?fù)p害正常細(xì)胞，其特異性有待提高。腫瘤細(xì)胞來源的微顆粒(通俗稱為腫瘤囊泡)是腫瘤細(xì)胞在發(fā)生凋亡或受到不同信號(hào)刺激時(shí)釋放出來的直徑為0.1～1.0 μm 的膜狀囊泡，在惡性腫瘤細(xì)胞中起著傳遞細(xì)胞間生物信息的作用[1-3]。近年來發(fā)現(xiàn)腫瘤囊泡可有效地包裝多種化療藥物或病毒等，且對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較高的特異性，對(duì)正常組織細(xì)胞無明顯副毒作用，可作為一種高效的天然藥物載體[4]。腫瘤囊泡包裝的化療藥物能否提高放療敏感性而減少化療損傷呢？本研究探討來源于非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的腫瘤囊泡包裝的MTX(tumor cell-derived microparticles methotrexate，T-MP MTX)聯(lián)合放療對(duì)A549 細(xì)胞放射效果的影響及其機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株和支氣管上皮細(xì)胞株16HBE等購(gòu)自中科院上海細(xì)胞中心。

1.2 藥物與試劑

MTX注射液購(gòu)自山西普德藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：5.0 mg/5.0 mL，使用時(shí)以無血清1640 培養(yǎng)液調(diào)整濃度至1.0 mmol/L，密封保存于4 ℃冰箱，使用前取適量以細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整至所需終濃度。Nanog、Sox-2、MMP-2小鼠抗人單抗購(gòu)于美國(guó)cellsignal公司。細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)試劑盒、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、內(nèi)參GAPDH抗體、兔抗小鼠HRP抗體、ECL 發(fā)光劑等購(gòu)于鼎國(guó)生物公司。醫(yī)用直線加速器購(gòu)自美國(guó)瓦里安公司，流式細(xì)胞儀(BD FACS ARIA)購(gòu)于美國(guó)BD公司，酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Biotek公司，垂直電泳儀購(gòu)自美國(guó)GE 公司，硝酸纖維素膜(NC膜)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3 T-MP MTX的制備

A549細(xì)胞均勻接種于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿(細(xì)胞密度10～20%)，常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至70～80%匯合度后，常規(guī)更換培養(yǎng)液，加入高劑量MTX，終濃度為10 μg/ml，置于紫外燈下照射1 h，放回恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。12 h后收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，室溫下離心10 min，600 rpm。棄沉淀，將上清液進(jìn)行離心，15 ℃，2 min，14 000 rpm，棄沉淀，上清液離心，15 ℃，60 min，14 000 rpm，將沉淀以0.5 ml PBS溶解。再次離心，15 ℃，60 min，14 000 rpm。反復(fù)洗滌沉淀3次。將沉淀以0.5 ml PBS溶解，取少量樣品檢測(cè)在600 nm波長(zhǎng)下OD值，調(diào)整T-MP MTX濃度在OD值在1～2之間，15 ℃下保存?zhèn)溆?。使用時(shí)以細(xì)胞培養(yǎng)液按一定比例稀釋。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 照射方法 采用西門子ONCER直線加速器，劑量率為400 cGy/min(6 MV)X線照射1次。射線由細(xì)胞貼壁面垂直經(jīng)有機(jī)玻璃板(厚度1.0 cm)入射，處理后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)12或24 h。

1.4.2 MTT法檢測(cè)T-MP MTX對(duì)A549細(xì)胞增殖影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞和16HBE，分別培養(yǎng)于96孔板，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度(稀釋倍數(shù)按1∶50、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000、1∶2000)T-MP MTX，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，MTT 法測(cè)定2種細(xì)胞存活率，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定吸光度(A)值，重復(fù)3 次。計(jì)算平均值，根據(jù)A 值測(cè)定細(xì)胞存活率。存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)(FACs)檢測(cè)T-MP MTX聯(lián)合放療對(duì)A549細(xì)胞凋亡影響 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞培養(yǎng)至30%～40%匯合度時(shí)更換含一定濃度的T-MP MTX，繼續(xù)培養(yǎng)10 h后，細(xì)胞分為4組：對(duì)照組、2 Gy放療組、4 Gy 放療組、6 Gy放療組，分別進(jìn)行放射照射處理。對(duì)照組不進(jìn)行放射照射。另設(shè)空白組，細(xì)胞不予藥物及放射照射處理，處理后細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。作為陰性對(duì)照。經(jīng)以上處理后以胰酶消化細(xì)胞，制備為單細(xì)胞懸液，PBS稀釋，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105/mL，離心去上清，PBS洗3次，75%預(yù)冷乙醇固定，4 ℃過夜。PBS洗3次并重懸，移入流式細(xì)胞儀離心管中，加入500 μL碘化丙啶染液，在37 ℃水浴孵育30 min后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.4.4 劃痕法檢測(cè)T-MP MTX聯(lián)合放療對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響 A549細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板內(nèi)培養(yǎng)至50%～60%匯合度時(shí)，細(xì)胞分組及處理同1.4.3，放療照射后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各組細(xì)胞用10 μL規(guī)格的槍頭比著直尺，垂直于6孔板背后的橫線劃痕，細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次后，加入無血清培養(yǎng)基，在顯微鏡下拍照并測(cè)量細(xì)胞邊緣相對(duì)距離(A值)。放入37度5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)，12 h后觀察劃痕情況并拍照，并測(cè)量劃痕邊緣相對(duì)距離(B值)。遷移距離=(A值-B值)。

1.4.5 Western blot檢測(cè)T-MP MTX聯(lián)合放療對(duì)A549細(xì)胞MMP-2、Nanog和Sox-2蛋白表達(dá)水平 A549細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)皿，細(xì)胞分組及處理同1.4.3，收集處理后常規(guī)培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，變性后取一定量蛋白樣本，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，封閉液封閉1 h，分別加入MMP-2、Nanog、Sox-2一抗，4 ℃孵育過夜。用TBST 洗4 次，每次5 min。加入二抗，37 ℃孵育40 min。在數(shù)字顯影系統(tǒng)中檢測(cè)目的蛋白信號(hào)。以GAPDH為內(nèi)參，利用灰度分析法檢測(cè)蛋白條帶的相對(duì)蛋白含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示并進(jìn)行單因素組間方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T-MP MTX抑制A549細(xì)胞增殖

MTT法檢測(cè)不同稀釋濃度的T-MP MTX對(duì)A549細(xì)胞增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各濃度組的細(xì)胞增殖能力均受到不同程度的影響，稀釋比例<1∶1000時(shí)，細(xì)胞存活率明顯下降(圖1)。相反，T-MP MTX對(duì)支氣管上皮細(xì)胞株16HBE細(xì)胞增殖的影響較弱，當(dāng)較高濃度時(shí)(>1∶200)時(shí)可輕度地抑制細(xì)胞增殖(圖1)。

圖1 T-MP MTX對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響(MTT法)

2.2 T-MP MTX聯(lián)合放療促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡

T-MP MTX(稀釋比例為1∶1000)處理聯(lián)合不同劑量放療處理后，F(xiàn)ACS檢測(cè)顯示各組均形成明顯的亞二倍體凋亡峰(sub-G1峰)，空白組、對(duì)照組、2 Gy組、4 Gy組、6 Gy組的亞二倍體細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(細(xì)胞凋亡率)分別為(0.83±0.14)%、(7.47±0.69)%及(46.12±5.23)%、(54.64±0.71)%及(69.86±1.63)%。與空白組比較，對(duì)照組凋亡率明顯增高(>9倍)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，提示T-MP MTX有較強(qiáng)的促凋亡作用。聯(lián)合放療的各組細(xì)胞凋亡率隨著放療劑量增高而上升。與空白組比較，2 Gy組、4 Gy組、6 Gy組的細(xì)胞凋亡率明顯增高(>54～84倍)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明T-MP MTX能與放療協(xié)同作用，明顯提高細(xì)胞凋亡率。

2.3 T-MP MTX聯(lián)合放療抑制A549細(xì)胞遷移能力

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以空白組為參考(1.00)，對(duì)照組、2 Gy組、4 Gy組及6 Gy組的遷移距離分別為(0.86±0.09)、(0.59±0.05)、(0.27±0.03)和(0.11±0.03)倍;以空白組或?qū)φ战M比較，2 Gy組、4 Gy組及6 Gy組的遷移距離均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

2.4 T-MP MTX聯(lián)合放療抑制A549細(xì)胞MMP-2、Nanog和Sox-2蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，以空白組表達(dá)量為1.00，對(duì)照組、2 Gy組、4 Gy組及6 Gy組經(jīng)處理24 h后MMP-2、Nanog、Sox-2蛋白表達(dá)水平均有不同程度下降(表1及圖3)。與空白組比較，對(duì)照組、2 Gy組、4 Gy組及6 Gy組細(xì)胞MMP-2、Nanog、Sox-2蛋白顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，2 Gy組、4 Gy組及6 Gy組細(xì)胞以上蛋白也有顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而且下降幅度與放療劑量相關(guān)。

3 討論

本研究表明，T-MP MTX可明顯抑制肺癌A549細(xì)胞增殖，這種效應(yīng)與T-MP MTX處理濃度存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，且在較低的稀釋濃度下即有明顯的抑制作用。同時(shí)T-MP MTX對(duì)支氣管上皮細(xì)胞的增殖無明顯抑制作用，即使在較高的濃度下也僅有輕微的抑制作用，說明T-MP MTX具有較高細(xì)胞靶向作用，即只對(duì)其起源的腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抑制作用，與以往報(bào)道一致[4]。本研究選擇在半數(shù)抑制率濃度附近的稀釋濃度進(jìn)行后續(xù)研究(在此濃度下對(duì)支氣管上皮細(xì)胞無抑制作用)。從細(xì)胞凋亡結(jié)果看，T-MP MTX聯(lián)合不同劑量。

放療，其凋亡率隨著劑量的增加而提高。A549細(xì)胞是一種高度惡性潛能的肺腺癌細(xì)胞，具有較強(qiáng)的抗輻射性，對(duì)亞致死性放射損傷有較強(qiáng)的修復(fù)能力[5]。從細(xì)胞凋亡結(jié)果看，T-MP MTX聯(lián)合不同劑量放療，其凋亡率隨著劑量的增加而提高。MTX是抗葉酸類抗腫瘤藥，主要通過對(duì)二氫葉酸還原酶的抑制而達(dá)到阻礙腫瘤細(xì)胞的合成，阻斷腫瘤細(xì)胞在S期，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。從凋亡檢測(cè)結(jié)果來看，未進(jìn)行放療的對(duì)照組經(jīng)T-MP MTX處理的A549細(xì)胞凋亡率較其空白組明顯提高(>9倍)，而聯(lián)合放療后凋亡率得到更大的提高(>54～84倍)，且隨放療劑量增加而增高。本

指標(biāo)對(duì)照組2Gy組4Gy組6Gy組tPMMP-20.43±0.090.15±0.040.09±0.020.03±0.01-39.610.000Nanog0.54±0.110.16±0.030.06±0.010.02±0.00-88.970.000Sox-20.71±0.080.49±0.060.12±0.030.05±0.01-54.110.000

圖3 T-MP MTX聯(lián)合放療對(duì)MMP-2、Nanog和Sox-2蛋白表達(dá)的影響(western blot)

課題組推測(cè)，T-MP MTX可能通過特異性靶向作用于A549細(xì)胞，提高目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，使細(xì)胞周期同步化提高，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)X射線的敏感性。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是抗腫瘤治療失敗的主要原因之一，而放療劑量不足所致放射損傷是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移潛能增高的重要因素。已知MMP-2與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，T-MP MTX可抑制A549細(xì)胞的遷移能力，下調(diào)MMP-2蛋白表達(dá)水平。當(dāng)T-MP MTX聯(lián)合放療時(shí)這種抑制作用隨著放療劑量增加而加強(qiáng)。這說明T-MP MTX聯(lián)合放療對(duì)A549細(xì)胞的放療增敏作用全面，不僅抑制腫瘤細(xì)胞增殖，還能抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力。最近一項(xiàng)研究也提示口服或靜注鈉米微粒包裝的阿霉素-MTX可通過下調(diào)MMP-2的表達(dá)，抑制口腔癌的進(jìn)展，其機(jī)制可能與抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的促動(dòng)基因有關(guān)[6]。MTX抑制MMP-2基因表達(dá)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

腫瘤干細(xì)胞假說認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞是惡性腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根本原因，而針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的治療是治療腫瘤的關(guān)鍵。肺癌干細(xì)胞的干性標(biāo)記物包括Nanog、Sox-2、CD133、Oct4、Klf4、β-catenin等，它們?cè)谀[瘤干細(xì)胞自物更新和增殖方面具有重要的調(diào)控作用[7-9]。近年研究表明[4]，腫瘤囊泡不僅對(duì)相應(yīng)的起源細(xì)胞有較高親和性，對(duì)腫瘤干細(xì)胞的親和性更高，可作為一種靶向腫瘤干細(xì)胞的藥物載體工具。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示T-MP MTX明顯下調(diào)腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因Nanog和Sox-2表達(dá)水平，與放療聯(lián)合使用可顯著加強(qiáng)這種調(diào)控效應(yīng)。這說明T-MP MTX有效影響肺癌干細(xì)胞的干性特征，增強(qiáng)放療效果，但其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。有研究認(rèn)為腫瘤囊泡所攜帶的化療藥物或生物信號(hào)可經(jīng)細(xì)胞溶酶體，到達(dá)細(xì)胞核膜內(nèi)部，直接作用于核內(nèi)相應(yīng)靶點(diǎn)[4,10]。本課題組推測(cè)A549來源的T-MP所攜帶的MTX和細(xì)胞凋亡應(yīng)急產(chǎn)生的信使進(jìn)入腫瘤干細(xì)胞后擾亂腫瘤干細(xì)胞的低代謝狀態(tài)，進(jìn)入高代謝狀態(tài)，而高代謝狀態(tài)細(xì)胞對(duì)放射射線較為敏感。因此T-MP MTX可能促進(jìn)低代謝狀態(tài)的腫瘤干細(xì)胞活化，具有較強(qiáng)的放療增敏作用，更有效地減少腫瘤復(fù)發(fā)。

此外，來源于凋亡腫瘤細(xì)胞的腫瘤囊泡被證實(shí)有一定的誘導(dǎo)機(jī)體腫瘤免疫的作用，其內(nèi)含的DNA片段及腫瘤抗原經(jīng)樹突狀細(xì)胞吞噬后活化樹突狀細(xì)胞并呈遞到細(xì)胞表面，從而激活特異性細(xì)胞免疫[11-13]。而本研究證實(shí)，T-MP MTX聯(lián)合放療特異地抑制A549細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提高放療敏感性，其機(jī)制可能與T-MP MTX誘導(dǎo)細(xì)胞周期同步化，以及干擾腫瘤干細(xì)胞低代謝狀態(tài)有關(guān)。因此，T-MP MTX抗腫瘤機(jī)制是多通路多靶點(diǎn)的，與聯(lián)合放療可能具有較高的抗腫瘤效應(yīng)，值得進(jìn)一步研究及臨床推廣。

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(編輯：甘 艷)

Radiosensitization Effect of Methotrexate Packaged by Tumor Derived Microparticles on Lung Cancer A549 Cells in Vitro

ZHENGXuesong,WANGYing,MENGYiliang,etal.

BaisePeople’sHospital,Baise,533000

Objective To explore the radiosensitization effect and mechanism of methotrexate packaged by tumor derived microparticles(T-MP MTX)on non-small cell lung cancer A549 cells.Methods The effect of T-MP MTX on A549 cells proliferation was assayed by MTT method;Cell apoptosis and migration capability of cells were detected by fluorescence activated cell sorting(FACS)and cell detachment test;The expression of MMP-2,Nanog and Sox-2 was measured by Western blot.Results MTT assay showed that T-MP MTX dose-dependently suppressed the proliferation of A549 cells,and played a role of antitumor in low concentration.The effect of T-MP MTX on the proliferation of bronchial epithelial cells line 16HBE was weak,but it slightly suppressed cell proliferation in high concentration.The result of FACS implied that T-MP MTX combined with radiation enhanced the apoptosis on A549 cells，in which the effect was relied on radiation dosage(P<0.05).T-MP MTX combined with radiation efficiently eliminated the migration ability of A549 cells in cell detachment test,and its effect was similar to the change of cell apoptosis(P<0.05);The expression of MMP-2,Nanog and Sox-2 notably decreased when A549 cells was treated with T-MP MTX combined with radiation,during which the effect was negative to radiation dosage(P<0.05).Conclusion T-MP MTX combined with radiation specially enhanced cell apoptosis,suppressed cell migration,and reinforced sensitization of radiation in A549 cells through increasing of cell cycle synchronization and obstructing low metabolic state of cancer stem cells by T-MP MTX.

Methotrexate;Radiosensitization;Tumor derived microparticles;Cell cycle;Synchronization;Apoptosis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：81560476)；八桂學(xué)者建設(shè)工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助

533000 廣西百色市人民醫(yī)院(鄭學(xué)嵩，蒙以良)；533000 右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院(王 映)；530011 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院(謝有科)

謝有科

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.01.001

R734.2

A

1001-5930(2017)01-0001-04

2016-01-20

2016-06-12)

MTT法檢測(cè)提示T-MP MTX濃度依賴性地抑制A549細(xì)胞增殖，并且在較低濃度下即發(fā)揮抑癌作用。T-MP MTX對(duì)支氣管上皮細(xì)胞株16HBE細(xì)胞增殖的影響較弱，在較高濃度可輕度地抑制細(xì)胞增殖。細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)T-MP MTX聯(lián)合放療擴(kuò)大A549細(xì)胞凋亡，其作用與放療劑量有關(guān)(P<0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)提示T-MP MTX聯(lián)合放療有效抑制A549細(xì)胞遷移能力，其作用與放療劑量有關(guān)(P<0.05)；Western blot檢測(cè)表明T-MP MTX聯(lián)合放療顯著下調(diào)A549細(xì)胞MMP-2、Nanog和Sox-2蛋白表達(dá)水平，此作用與放療劑量有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 T-MP MTX聯(lián)合放療特異地抑制A549細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提高放療敏感性，其機(jī)制可能與T-MP MTX誘導(dǎo)細(xì)胞周期同步化，以及干擾腫瘤干細(xì)胞低代謝狀態(tài)有關(guān)。