董合玲，徐曉陽，趙軍

DONG He-ling1，XU Xiao-yang2，ZHAO Jun1

谷氨酰胺補(bǔ)充和電刺激對(duì)C2C12肌管蛋白合成通路的影響

董合玲1，徐曉陽2，趙軍1

DONG He-ling1，XU Xiao-yang2，ZHAO Jun1

骨骼肌占整個(gè)機(jī)體質(zhì)量的40%～50%，對(duì)生命質(zhì)量的維持具有非常重要的作用。蛋白質(zhì)更新可以增加骨骼肌質(zhì)量［29］，而運(yùn)動(dòng)時(shí)蛋白質(zhì)代謝呈現(xiàn)出復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，與機(jī)體運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)量、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、營(yíng)養(yǎng)的補(bǔ)充劑量及時(shí)間等有關(guān)。谷氨酰胺（Glutame，Gln）是人體含量最多的條件性必需氨基酸，主要在骨骼肌中合成。在運(yùn)動(dòng)機(jī)體中，谷氨酰胺可以通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成代謝和降低肌肉蛋白質(zhì)的降解，增長(zhǎng)肌肉力量，維持機(jī)體的生理功能［1］。因此，運(yùn)動(dòng)員在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中，合理補(bǔ)充一定量的谷氨酰胺對(duì)運(yùn)動(dòng)機(jī)能的提高是非常重要的。但是，機(jī)體對(duì)谷氨酰胺的需要量有一定的限度，過量補(bǔ)充只能造成谷氨酰胺的過代謝，增加肝臟代謝負(fù)擔(dān)。目前，補(bǔ)充谷氨酰胺的研究關(guān)鍵是確定在不同情況下、不同時(shí)間段的所需劑量。

細(xì)胞內(nèi)有多條蛋白代謝調(diào)控通路，如Ras/MAPK通路、AMPK通路、PI3K/Akt/mTOR通路、Calcineurin/NFAT通路、MEK/ERK/p90RSK等，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)部構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜有序的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，其中起核心作用的是mTOR通路［26，29］。mTOR，即哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白，在細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和分化過程中起中心調(diào)控作用［23］，參與蛋白質(zhì)合成代謝。mTOR經(jīng)上游因子作用激活后，主要通過4E-BP1、S6K1兩個(gè)下游因子的磷酸化，進(jìn)一步調(diào)控機(jī)體蛋白的代謝及細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。mTOR通路在骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育尤其是運(yùn)動(dòng)性骨骼肌肥大中發(fā)揮重要的作用，而S6K1則是運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致mTOR激活的直接反映因子和蛋白質(zhì)合成增加的標(biāo)志因子［19］。研究證明，對(duì)mTOR通路的抑制能阻斷95%的肌肉肥大效應(yīng)［7］。目前，mTOR通路與運(yùn)動(dòng)關(guān)系的研究主要集中在3種類型的運(yùn)動(dòng)練習(xí)中，分別為急性的一次性抗阻運(yùn)動(dòng)、高頻電刺激模擬抗阻運(yùn)動(dòng)和低頻電刺激模擬耐力運(yùn)動(dòng)，而相關(guān)長(zhǎng)時(shí)間系統(tǒng)性運(yùn)動(dòng)類型的研究相對(duì)較少。此外，大部分研究是關(guān)于mTOR通路在運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)早期中作用的研究，而在恢復(fù)后期mTOR通路影響的研究相對(duì)較少。而且，運(yùn)動(dòng)時(shí)肌肉收縮激活mTOR信號(hào)通路的具體機(jī)制還不清楚。比較普遍的看法是，類似耐力訓(xùn)練形式的運(yùn)動(dòng)可激活骨骼肌細(xì)胞AMPK通路，抑制mTOR信號(hào)通路，而類似抗阻訓(xùn)練形式的運(yùn)動(dòng)則激活mTOR通路［4，27］。

本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象為C2C12（Mouse C3H muscle myoblast）細(xì)胞，分化的C2C12肌管可完成與在體骨骼肌細(xì)胞同樣的收縮［5］，同時(shí)避免了在體實(shí)驗(yàn)中其他器官、組織、細(xì)胞和激素的影響，能更實(shí)時(shí)的研究運(yùn)動(dòng)刺激和谷氨酰胺補(bǔ)充對(duì)骨骼肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的影響。適宜的運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，谷氨酰胺的適量補(bǔ)充也可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，但其機(jī)制仍不完全清楚。mTOR通路是骨骼肌蛋白質(zhì)合成代謝的主要調(diào)控通路，而關(guān)于谷氨酰胺補(bǔ)充與mTOR通路關(guān)系的研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過采用電刺激模擬運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案（15 V，30 ms，3 Hz，90 min）以及補(bǔ)充谷氨酰胺（10 mmol/L，48 h）方案，測(cè)定肌管的蛋白質(zhì)含量，以及mTOR通路中mTOR mRNA和S6K1 mRNA的相對(duì)表達(dá)率，研究電刺激模擬運(yùn)動(dòng)與谷氨酰胺補(bǔ)充對(duì)蛋白質(zhì)含量及mTOR通路的影響，為運(yùn)動(dòng)損傷及恢復(fù)提供理論依據(jù)。

1 研究材料與方法

1.1 研究材料

C2C12細(xì)胞（小鼠骨骼肌肌母細(xì)胞株，購自南方醫(yī)科大學(xué)解剖教研室）；DMSO、DEPC、L-谷氨酰胺（美國sigma公司）；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，MBCHEM公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；DMEM培養(yǎng)基、馬血清（美國GIBCO公司）；Primer、引物合成（美國Invitrogen公司）；RIPA裂解液、BCA試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；SYBR premix Ex TaqⅡ（TaKaRa公司）。

1.2 谷氨酰胺孵育及電刺激方案

C2C12細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞傳代于35 cm的6孔板培養(yǎng)皿中，加入4 mmol/L谷胺酰胺含10%胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿皿底面積的90%以上時(shí)，加入含2%馬血清的分化培養(yǎng)基分化5天。谷氨酰胺孵育組在10 mmol/L谷氨酰胺分化培養(yǎng)基中孵育48 h，其他組繼續(xù)分化，待所有組細(xì)胞分化7天時(shí)，開始進(jìn)行電刺激或無刺激實(shí)驗(yàn)。采用GRASS S48 Stimulator型電刺激器電刺激共分化7天的C2C12肌管，強(qiáng)度為15 V，30 ms，3 Hz，90 min。電刺激后0 h、6 h、18 h、24 h收樣。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組：

單獨(dú)對(duì)照組（Con）；單獨(dú)谷氨酰胺組（Gln）；根據(jù)電刺激的收樣時(shí)間，單獨(dú)電刺激組分為：?jiǎn)为?dú)電刺激后0 h收樣組（Es0）、單獨(dú)電刺激后6 h收樣組（Es6）、單獨(dú)電刺激后18 h收樣組（Es18）、單獨(dú)電刺激后24 h收樣組（Es24）；谷氨酰胺孵育+電刺激組分為：谷氨酰胺孵育加電刺激后0 h收樣組（Gln+Es0）、谷氨酰胺孵育加電刺激后6 h收樣組（Gln+ Es6）、谷氨酰胺孵育加電刺激后18 h收樣組（Gln+Es18）、谷氨酰胺孵育加電刺激后24 h收樣組（Gln+Es24）。共計(jì)10組。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 C2C12肌管總蛋白濃度測(cè)定

采用碧云天研究所提供的二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒。將待測(cè)樣品上清棄去，用預(yù)冷的PBS洗2次。加入RIPA裂解液（200μL/皿），冰上裂解30 min，4℃離心（12 000 g，10 min），吸取上清。依照試劑盒說明書測(cè)定蛋白含量，同時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。C2C12細(xì)胞蛋白量單位用每平方厘米皿底面積含有的蛋白微克數(shù)來表示（g/ cm2）。

1.4.2 測(cè)定C2C12肌管中mTOR mRNA和S6K1 mRNA表達(dá)

1.提取細(xì)胞內(nèi)總RNA

用Trizol裂解液裂解C2C12肌管，按常規(guī)方法提取純化總RNA，溶于適量DEPC水后分裝，取適量測(cè)其純度和總量，其余于－80℃冰箱保存。

2.RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA

按試劑說明書配RT反應(yīng)液，總體積10μL：5×Prime-Script Buffer 2μL；PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 0.5μL；Random 6mers（100μmol/L）0.5μL；Oligo dT Primer（50 μmol/L）0.5μL；Total RNA 2μL；DEPC水4.5μL。使用反轉(zhuǎn)錄儀將RT反應(yīng)液中的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件如下：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃，30 min。將反轉(zhuǎn)錄好的cDNA于－80℃冰箱保存。

3.定量PCR

按照說明書配制PCR反應(yīng)液，總體積25μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）12.5μL；引物混合液/內(nèi)參引物2μL；RT反應(yīng)液2μL；DEPC水8.5μL。引物序列：mTOR上游5'-ATGGCGGATGATCTAAAGCGA-3'；mTOR下游5'-GGCACTGTCGTTAGCCACT-3'，S6K1上游5'-CCATCACACACCACGTCAAG-3'，S6K1下游5'-TTGCGTACCAGGAAGACTTTG-3'。PCR反應(yīng)液混勻后在熒光PCR儀上擴(kuò)增目的基因：95℃預(yù)變性30 s一個(gè)循環(huán)，然后執(zhí)行（95℃變性5 s，60℃退火25 s，72℃延伸30s）45個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸5min，反應(yīng)結(jié)束后，采用55℃～95℃間隔1℃2s進(jìn)行融解曲線分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

研究數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，并用單因素方差分析進(jìn)行各組間的差異顯著性檢驗(yàn)。P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 C2C12分化過程中總蛋白含量的變化

由表1數(shù)據(jù)可知，C2C12細(xì)胞分化前6天總蛋白含量變化呈上升趨勢(shì)，且每天的總蛋白含量與前一天比較均有極顯著差異（P＜0.01），六天后總蛋白含量變化趨于穩(wěn)定，無顯著差異（P＞0.05）。

表1 本研究不同分化天數(shù)后C2C12肌管總蛋白含量的變化結(jié)果（g/cm2，±SD）Table 1 Protein Content of Different Differentiation Time in C2C12

表1 本研究不同分化天數(shù)后C2C12肌管總蛋白含量的變化結(jié)果（g/cm2，±SD）Table 1 Protein Content of Different Differentiation Time in C2C12

注：@表示與前一天細(xì)胞總蛋白比較，有顯著差異（P＜0.05）；@@表示與前一天細(xì)胞總蛋白比較，有極顯著差異（P＜0.01）。

43.30±0.10 46.49±0.01@@47.52±0.13@48.95±0.10@@53.81±0.32@@55.47±0.74@@54.96±0.60 55.19±1.01 54.28±0.92 54.99±0.24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0

2.2 不同濃度谷氨酰胺孵育后C2C12肌管總蛋白含量變化由表2數(shù)據(jù)可知，與4 mmol/L組相比，0 mmol/L組、2 mmol/L組C2C12肌管總蛋白含量極顯著降低（P＜0.01），10 mmol/L組C2C12肌管總蛋白含量極顯著升高（P＜0.01）。因此，谷氨酰胺的補(bǔ)充濃度為10 mmol/L。

2.3 谷氨酰胺孵育加電刺激后C2C12肌管總蛋白含量變化

由表3數(shù)據(jù)可知，與Con組蛋白含量相比，Gln、Es18和

Es24組極顯著升高（P＜0.01），Es6組極顯著降低（P＜0.01），

Es0組無顯著變化（P＞0.05）。與Gln相比，Gln+Es18、Gln+ Es24組蛋白含量均極顯著升高（P＜0.01），Gln+Es6組蛋白含量極顯著降低（P＜0.01），Gln+Es0組無顯著變化（P＞0.05）。Gln+Es組各收樣時(shí)間點(diǎn)的蛋白含量變化趨勢(shì)與Es組相似，但整體水平上升，且Gln+Es6組的蛋白含量顯著高于Es6組（P＜0.05）。

表2 不同濃度谷氨酰胺孵育后C2C12肌管總蛋白含量變化（±SD）Table 2 Total Protein Content with Different Concentration of Glutamine

表2 不同濃度谷氨酰胺孵育后C2C12肌管總蛋白含量變化（±SD）Table 2 Total Protein Content with Different Concentration of Glutamine

注：與4 mmol/L組（正常培養(yǎng)組）比較，#表示有顯著差異（P＜0.05）；##表示有極顯著差異（P＜0.01）。

蛋白含量（g/cm2）34.37±0.96##36.59±0.83##38.87±0.20 38.63±0.34 38.25±0.01 41.93±0.43##39.20±0.86 39.17±0.45 39.30±0.11 GLN濃度（mmol/L）0 2 4 6 8 1 0 12 16 20

表3 谷氨酰胺孵育加電刺激后C2C12肌管總蛋白含量的變化（g/cm2、±SD）Table 3 Effects of Glutamine and Electrical Stimulation on the Protein Content

表3 谷氨酰胺孵育加電刺激后C2C12肌管總蛋白含量的變化（g/cm2、±SD）Table 3 Effects of Glutamine and Electrical Stimulation on the Protein Content

70.86±1.23##74.62±0.40＄＄##分組Con Gln Es Gln+Es 0 h 55.7±0.79 58.6±1.10##56.8±0.55 59.1±0.67##6 h 18 h 24 h 48.89±1.43##*53.76±0.85＄＄##68.36±1.67##72.90±1.50＄＄##

2.4 谷氨酰胺孵育加電刺激后C2C12肌管mTOR mRNA表達(dá)變化

由表4數(shù)據(jù)可知，Gln組mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)率顯著高于Con組（P＜0.05）。Es0組mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)率略低于Con組（P＞0.05），Es6組略高于Con組（P＞0.05），但顯著高于Es0組（P＜0.05）；Es18組極顯著高于Con組（P＜0.01）。Gln+Es組與Es組相比，mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)率大體趨勢(shì)相同，先上升后下降，但Es組是在電刺激后18 h達(dá)到高峰，而Gln+Es組是在電刺激后6 h達(dá)到高峰。說明，谷氨酰胺促進(jìn)電刺激后肌管mTOR的提前激活。

2.5 谷氨酰胺孵育加電刺激后C2C12肌管S6K1 mRNA表達(dá)變化

由表5數(shù)據(jù)可知，Gln組S6K1 mRNA相對(duì)表達(dá)率顯著高于Con組（P＜0.05）。Es0組S6K1 mRNA相對(duì)表達(dá)率略低于Con組（P＞0.05），Es6組顯著高于Con組（P＜0.05），Es18組略高于Con組（P＞0.05），但仍顯著高于Es0組（P＜0.05）。Gln+Es組與Es組相比，S6K1 mRNA相對(duì)表達(dá)率大體趨勢(shì)相同，先上升后下降，但整體表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05）。此外，Gln+Es中各組與Gln組相比，均無顯著差異（P＞0.05），說明，電刺激對(duì)谷氨酰胺孵育的C2C12肌管S6K1 mRNA表達(dá)無顯著影響。

表5 谷氨酰胺孵育加電刺激后C2C12肌管S6K1 mRNA相對(duì)表達(dá)率比較Table 5 Expression of mTOR mRNA in C2C12 Myotubes

3 分析與討論

谷氨酰胺是人體含量最多的條件性必需氨基酸，主要在骨骼肌中合成，是增長(zhǎng)肌肉力量的必需營(yíng)養(yǎng)素，與運(yùn)動(dòng)能力有密切的聯(lián)系。關(guān)于運(yùn)動(dòng)中谷氨酰胺的代謝，需根據(jù)運(yùn)動(dòng)類型分析。1）短時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)（＜l h）后血漿谷氨酰胺水平普遍上升。一方面原因是大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生大量氨，促使谷氨酸與氨合成增加，血漿谷氨酰胺水平上升；另一方面，運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致體內(nèi)水分丟失、循環(huán)血量減少，亦是其上升的原因。2）長(zhǎng)時(shí)間（≥1 h）運(yùn)動(dòng)后血漿谷氨酰胺水平普遍下降。其原因是機(jī)體對(duì)谷氨酰胺的利用率上升，同時(shí)，谷氨酰胺合成酶的最大活性下降。3）在超長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)中，機(jī)體開始適應(yīng)運(yùn)動(dòng)，且糖原得到及時(shí)補(bǔ)充，因此，谷氨酰胺消耗和生成接近平衡，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)后無明顯變化。運(yùn)動(dòng)機(jī)體中骨骼肌大量消耗能量物質(zhì)的同時(shí)，蛋白質(zhì)降解大于合成，機(jī)體處于負(fù)氮平衡。而谷氨酰胺是氮流動(dòng)的重要載體和蛋白合成前體，當(dāng)機(jī)體合成的谷氨酰胺不能滿足其自身需求時(shí)，需適時(shí)的補(bǔ)充外源性谷氨酰胺［1，3］。因此，補(bǔ)充外源性谷氨酰胺對(duì)運(yùn)動(dòng)機(jī)體維持正常功能起到非常重要的作用。補(bǔ)充谷氨酰胺可促進(jìn)蛋白合成，抑制蛋白降解，這與國內(nèi)、外許多實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符合［2，31］。

氨基酸不但是蛋白質(zhì)合成的必需前體物質(zhì)，也可作為信號(hào)因子和調(diào)節(jié)因子參與蛋白質(zhì)代謝。作為調(diào)控因子的氨基酸可以調(diào)控代謝通路中細(xì)胞內(nèi)蛋白合成酶的活性，如某些成分的mRNA表達(dá)［22］。研究證明，mTORC1是核內(nèi)體和溶酶體的表面調(diào)控因子，mTORC1一旦激活，繼而調(diào)控下游蛋白翻譯起始和/或翻譯延伸因子的磷酸化和活性，mTORC1主要下游因子有4E-BP1、S6K1、eIF2a等［7］。HeLa細(xì)胞模型的研究證明，谷氨酰胺可通過激活mTOR而促進(jìn)細(xì)胞蛋白合成，mTOR激活主要依賴做為必需氨基酸的谷氨酰胺的吸收和快速流出［13，15，25］。然而，谷氨酰胺調(diào)控骨骼肌質(zhì)量的具體機(jī)制尚不完全清楚，肌肉收縮如何影響mTOR通路的機(jī)制也存有疑問，激素的變化、鈣離子含量的高低、機(jī)械收縮-電變化、組織細(xì)胞局部低氧、營(yíng)養(yǎng)狀況等均可能與之相關(guān)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，S6K1在運(yùn)動(dòng)后發(fā)生顯著變化的時(shí)間點(diǎn)不同，但共同點(diǎn)是S6K1在運(yùn)動(dòng)結(jié)束后的變化具有延遲性［20，25］。另外，有研究證明，骨骼肌S6K1激活與上游因子mTOR激活并不一定存在絕對(duì)一致性［6］，在mTOR激活的情況下，S6K1并不一定激活［16］。

圖1 谷氨酰胺孵育加電刺激后C2C12肌管蛋白含量及mTOR信號(hào)通路的指標(biāo)變化柱狀圖Figure 1.Effects of Glutamine and Electrical Stimulation on mTOR and S6K1 Protein

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Gln組蛋白含量極顯著高于Con組，可見，谷氨酰胺可促進(jìn)蛋白合成，抑制蛋白降解。與Con組蛋白含量相比，Es6組極顯著下降，Es18、Es24組蛋白含量極顯著上升，說明，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的電刺激方案，電刺激后6 h可引起骨骼肌蛋白降解，總蛋白含量下降，而電刺激后18 h合成大于降解，蛋白含量上升。機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)，骨骼肌中能量物質(zhì)大量被消耗，引起蛋白質(zhì)降解大于合成，機(jī)體處于負(fù)氮平衡，表現(xiàn)為骨骼肌總蛋白含量的下降。運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，蛋白質(zhì)的降解和合成之間新的平衡被重新建立［6］，骨骼肌總蛋白含量不再處于下降趨勢(shì)［8，10］，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，總蛋白含量上升。Gln+Es組各時(shí)間點(diǎn)的蛋白含量變化趨勢(shì)與Es組相似，但整體水平有所上升，且Gln+Es6組的蛋白含量顯著高于Es6組，說明，谷氨酰胺補(bǔ)充有利于電刺激后C2C12肌管蛋白含量的維持和升高。

與蛋白含量的結(jié)果相似，谷氨酰胺可促進(jìn)C2C12肌管mTOR mRNA表達(dá)。氨基酸不但是蛋白質(zhì)合成的必需前體物質(zhì)，也可作為信號(hào)因子和調(diào)節(jié)因子參與蛋白質(zhì)代謝。單獨(dú)電刺激后即刻，C2C12肌管mTOR mRNA未大量表達(dá)，而是從電刺激后6 h開始表達(dá)上升，電刺激后18 h已大量表達(dá)。肌肉收縮影響mTOR通路機(jī)制目前還不清楚，激素的變化、鈣離子含量的高低、機(jī)械收縮-電變化、組織細(xì)胞局部低氧、營(yíng)養(yǎng)狀況等均可能與之相關(guān)。Gln+Es組與Es組相比，mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)率大體趨勢(shì)相同，先上升后下降，但Es組是在電刺激后18 h達(dá)到峰值，而Gln+Es組是在電刺激后6 h達(dá)到峰值，說明，谷氨酰胺可以使電刺激后C2C12肌管mTORmRNA表達(dá)提前。有研究顯示，在運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期攝入富含亮氨酸的EAA+CHO混合溶液時(shí)，mTOR信號(hào)通路進(jìn)一步增強(qiáng)，可引起更大的肌肉蛋白質(zhì)合成［9，21］?？梢?，營(yíng)養(yǎng)與運(yùn)動(dòng)結(jié)合具有增強(qiáng)mTOR通路的作用。

與mTOR mRNA表達(dá)相似，Gln組與Es6組的S6K1 mRNA相對(duì)表達(dá)率顯著高于Con組。Gln+Es組與Es組相比，S6K1 mRNA相對(duì)表達(dá)率大體趨勢(shì)相同，呈現(xiàn)先上升后下降，但整體表達(dá)水平顯著上升。單獨(dú)谷氨酰胺或電刺激均通過mTOR通路影響mTOR mRNA表達(dá)，繼而影響S6K1 mRNA表達(dá)，谷氨酰胺補(bǔ)充使電刺激后C2C12肌管S6K1 mRNA表達(dá)上升進(jìn)一步增加。有研究發(fā)現(xiàn)，S6K1在運(yùn)動(dòng)后發(fā)生顯著變化的時(shí)間點(diǎn)不同，但共同點(diǎn)是S6K1在運(yùn)動(dòng)結(jié)束后的變化具有延遲性［12，18，30］。此外，Gln+Es中各組與Gln組相比，均無顯著差異，說明，電刺激對(duì)谷氨酰胺孵育的C2C12肌管S6K1 mRNA表達(dá)無顯著影響。

總之，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中合理補(bǔ)充一定量的谷氨酰胺對(duì)運(yùn)動(dòng)員非常重要，但過量補(bǔ)充只能造成谷氨酰胺的過分代謝，增加肝臟代謝負(fù)擔(dān)［11，17，24，28］。雖然，谷氨酰胺可增加運(yùn)動(dòng)后機(jī)體的蛋白代謝，但仍無可靠數(shù)據(jù)證實(shí)谷氨酰胺可減輕運(yùn)動(dòng)損傷造成的疼痛。雖然，谷氨酰胺是運(yùn)動(dòng)員營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑之一，但仍無充足數(shù)據(jù)支持關(guān)于谷氨酰胺補(bǔ)充的營(yíng)養(yǎng)處方制定。因此，補(bǔ)充谷氨酰胺的關(guān)鍵所在是確定不同情況下補(bǔ)充谷氨酰胺的劑量和時(shí)間。此外，mTOR mRNA與S6K1 mRNA的表達(dá)并不完全一致，因此，谷氨酰胺是否會(huì)通過其他通路或因子影響蛋白合成仍需更多研究證實(shí)。

4 結(jié)論

1.單獨(dú)補(bǔ)充谷氨酰胺和單獨(dú)電刺激均可增加C2C12肌管中蛋白質(zhì)含量、mTORm RNA和S6K1 mRNA的表達(dá)。推斷谷氨酰胺和電刺激可通過mTOR通路促進(jìn)C2C12肌管蛋白合成，進(jìn)而促進(jìn)肌管恢復(fù)。

2.單獨(dú)電刺激后，C2C12肌管mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)率在電刺激后6 h達(dá)高峰，而S6K1 mRNA相對(duì)表達(dá)率在電刺激后18 h達(dá)高峰?？梢?，mTOR通路中mTOR mRNA表達(dá)和S6K1 mRNA表達(dá)在時(shí)間上不同步。

3.谷氨酰胺與電刺激聯(lián)合作用后，肌管蛋白含量進(jìn)一步增加，且mTOR mRNA表達(dá)提前達(dá)到峰值，S6K1 mRNA穩(wěn)定表達(dá)在高水平。谷氨酰胺聯(lián)合電刺激通過mTOR信號(hào)通路促進(jìn)mTOR mRNA的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)下游因子S6K1 mRNA表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)C2C12肌管蛋白合成和肌管恢復(fù)。

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Effects of Glutamine and Electrical Stimulation on Protein Content Pathway in C2C12

目的： CC 22 CC1122肌管為細(xì)胞模型，探討電刺激模擬運(yùn)動(dòng)與谷氨酰胺補(bǔ)充對(duì) CC 22 CC1122肌管蛋白質(zhì)含量及mmTTOORR通路的影響，進(jìn)一步探明谷氨酰胺補(bǔ)充與蛋白質(zhì)代謝之間的關(guān)系。方法：谷氨酰胺孵育分化 55天的肌管4488 hh后，給予一次電刺激（1155 VV，3300 mmss， 33 HHzz，9900 mmiinn）。分別在電刺激后 00 hh、 66 hh、1188 hh和2244 hh收樣。實(shí)驗(yàn)共1100組，單獨(dú)對(duì)照組（CCoonn）；單獨(dú)谷氨酰胺組（GGllnn）；單獨(dú)電刺激后不同時(shí)間點(diǎn)取樣組（EEss 00、EEss 66、EEss1188、EEss2244）；谷氨酰胺孵育加電刺激后不同時(shí)間點(diǎn)取樣組（Gllnn++EEss 00、Gllnn++EEss 66、Gllnn++EEss1188、Gllnn++EEss2244）。BBCCAA法測(cè)定各組肌管蛋白含量；RTT--PPCCRR法測(cè)定各組mTOR mmRRNNAA表達(dá)量及其下游因子 SS 66 KK 11 mmRRNNAA表達(dá)量。結(jié)果： 11）與CCoonn相比，GGllnn組的蛋白含量、mmTTOORR及 SS 66 KK 11 mmRRNNAA均顯著升高（ PP＜ 00..0055）。 22）單獨(dú)電刺激（EEss）后，隨收樣時(shí)間延長(zhǎng)，肌管蛋白含量呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)。EEss 66極顯著下降（ PP＜ 00..0011），EEss1188極顯著上升（ PP＜ 00..0011）。而mmTTOORR和 SS 66 KK 11 mmRRNNAA的表達(dá)沒有下降，呈現(xiàn)先上升后恢復(fù)正常的趨勢(shì)。 33）谷氨酰胺和電刺激（Gllnn++EEss）聯(lián)合作用后，無論是蛋白含量，還是mmTTOORR及 SS 66 KK 11 mmRRNNAA表達(dá)，具有與單獨(dú)電刺激相似的作用趨勢(shì)，且Gllnn++EEss各組數(shù)值均高于EEss各組（ PP＜ 00..0055）。此外，EEss組mmTTOORR表達(dá)在電刺激后1188 hh達(dá)高峰，而Gllnn++EEss組在 66 hh達(dá)高峰。結(jié)論： 11）單獨(dú)電刺激、單獨(dú)補(bǔ)充谷氨酰胺、兩者的聯(lián)合作用，均可通過mmTTOORR通路中mTOR mmRRNNAA和 SS 66 KK 11 mmRRNNAA表達(dá)上升，增加蛋白合成，促進(jìn)蛋白含量上升及肌管恢復(fù)。 22）谷氨酰胺使電刺激后 CC 22 CC1122肌管mTOR mmRRNNAA表達(dá)提前， SS 66 KK 11 mmRRNNAA表達(dá)穩(wěn)定處于高水平。

谷氨酰胺補(bǔ)充，mmTTOORR，電刺激， CC 22 CC1122肌管

Objective：This paper discusses the effects of glutamine and electrical stimulation on protein content and mTOR pathway in C2C12，and provides theoretical reference for how glutamine improving sports performance and recovery.Method：After 5 days of differentiation，C2C12 myotubes were incubated in 4mM or 10mM dose of glutamine for 48 hours，and then myotubes were stimulated to contract 90mins at 15v，3Hz，30ms.Samples were colllected in 0h，6h，18h，and 24h respectively after electrical stimulation.Therefore，there were 10 groups，including control group（Con），glutamine group（Gln），electrical stimulation group of different time point（sEs0 Es6，Es18，Es24），glutamine plus electrical stimulation of different time points（Gln+Es0，Gln+Es6，Gln+Es18，Gln+ Es24）.BCAProteinAssay Kit was used to measure total protein conten（tμg/cm2）.mTOR mRNAand S6K1 mRNA were measured by RT-PCR.The expression of each transcript was measured by the 2-ΔΔCt method using the threshold cycle（Ct）value.Results：1）Total protein content，mTORmRNA and S6K1mRNA expression of Gln was greater than that of Con（P＜0.05）.2）With the extension of collecting time after electrical stimulation（Es），muscle protein content showed a trend of decline followed by rise.That of Es6 decreased significantly（P＜0.01），but that of Es18 increased significantly（P＜0.01）.The expression of mTOR and S6K1 mRNArose first，and then came back to normal level.3）The trends of protein content，mTORmRNA and S6K1mRNA of Es was similar with Gln+Es，but the overall level rose（P＜0.05）.And the mTOR mRNA expression of Es reached the peak happened in 18 hour，while Gln+Es reached the peak in 6 hour.Conclusion：1）Electrical stimulation，glutamine can promote expression of mTOR mRNAand S6K1 mRNAthrough mTOR pathway，increase protein synthesis，and promote the rise of protein content and recovery.2）Glutamine can make the expression of mTORmRNA advance in C2C12 muscle tube after electrical stimulation，and the expressionof S6K1mRNAstableinahighlevel.

glutamine；mTOR；electricalstimulation；C2C12muscletube

1002-9826（2017）01-0104-07

10.16470/j.csst.201701013

G804.7

：A

2016-05-05；

：2016-10-31

董合玲，女，講師，博士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)生化及信號(hào)通路傳導(dǎo)。

1.暨南大學(xué)體育學(xué)院，廣東廣州510632；2.華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510631 1.Jinan University，Guangzhou 510632，China；2.South China Normal University，Guangzhou 510631，China.