梁 勇 顏麗萍 蘇 林 李 弘 閆玉棟

(桂林市第二人民醫(yī)院消化內科，廣西 桂林 541000)

枯草桿菌二聯(lián)活菌對潰瘍性結腸炎大鼠的作用及機制

梁 勇 顏麗萍 蘇 林 李 弘 閆玉棟

(桂林市第二人民醫(yī)院消化內科，廣西 桂林 541000)

目的 探討枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊(美常安)對潰瘍性結腸炎(UC)大鼠結腸促炎癥性細胞因子白細胞介素(IL)-1β和細胞黏附分子CD44表達的影響及其作用機制。方法 采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇法灌腸建立UC大鼠模型。將SD大鼠隨機分成正常對照組、模型組、美常安治療組。觀察各組疾病活動指數(shù)(DAI)、結腸組織病理學評分(HPS)。造模及美常安干預7 d后處死大鼠，取結腸行HE染色，觀察鏡下結腸病理變化。RT-PCR 法檢測各組大鼠腸黏膜細胞因子IL-1β mRNA表達，流式細胞儀檢測各組大鼠結腸組織中黏附分子CD44的含量。結果 模型組較正常對照組大鼠結腸黏膜可見膿性分泌物、糜爛及潰瘍，美常安干預后顯著改善UC大鼠結腸黏膜的病理變化，DAI和HPS評分下降顯著，并明顯降低UC大鼠IL-1β mRNA和CD44的表達(P<0.05)。結論 枯草桿菌二聯(lián)活菌可能通過下調UC大鼠IL-1β mRNA和CD44的表達而發(fā)揮干預作用。

潰瘍性結腸炎；枯草桿菌二聯(lián)活菌(美常安)；白細胞介素-1β；黏附因子CD44

潰瘍性結腸炎(UC)作為腸道炎癥性疾病其病因和發(fā)病機制尚不明確，病變主要始于左側結腸，以連續(xù)方式向結腸近端乃至全結腸逐漸發(fā)展，臨床主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛和黏液膿血便〔1〕。研究指出，細胞因子和黏附分子與UC的發(fā)病息息相關，可作為檢測UC發(fā)展程度的重要指標〔2〕。同時有研究報道，UC的發(fā)生與腸道菌群具有顯著相關性〔3〕。雖然枯草桿菌二聯(lián)活菌治療UC的療效已得到充分肯定，但機制并未完全闡明。本研究采用枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊(美常安)治療UC大鼠，檢測腸黏膜組織中細胞因子白細胞介素(IL)-1β和黏附分子CD44的變化，旨在從細胞水平探討枯草桿菌二聯(lián)活菌對UC的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 美腸安購于北京韓美藥品有限公司，主要成分為枯草桿菌和糞腸球菌；流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)；RT-PCR儀器及其相關酶和緩沖液(美國Roche公司)。

1.2 藥物劑量 將1粒美腸安膠囊去殼后用16 ml生理鹽水溶解，配成溶液用于后續(xù)試驗。

1.3 動物模型的制備與分組 用經(jīng)典的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇法制作模型，造模結束后，挑取5只大鼠處死，當觀察到結腸黏膜充血水腫后，對其作病理切片，驗證結腸黏模發(fā)生損傷、糜爛，說明造模成功。將SD大鼠隨機分成正常對照組20只，其余40只大鼠按上述方法造模，證造模成功后，第20天開始將造模成功的大鼠隨機分為模型組(n=18)和美常安治療組(n=17)。正常對照組大鼠以2 ml生理鹽水灌腸，其余兩組用5%乙酸1.0 ml灌腸。2 d后，正常對照組和模型組每日用生理鹽水2 ml灌胃；美常安治療組用美常安溶液2.5 ml灌胃1次/d，12.5 g/kg；7 d后禁食24 h，處死大鼠，剖開腹部，于病變最嚴重的部位剪取約1 cm的結腸組織，剖開，固定于10%甲醛溶液中，分別采用80%、90%、95%、100% 乙醇進行梯度洗脫，加入二甲苯進行透明處理后，進行石蠟包埋切片。

1.4 結腸組織中黏附分子CD44含量測定 UC大鼠取病變組織1 cm置于0.9%生理鹽水中，-25℃冰箱保存?zhèn)溆?。取出解凍，將鹽水沖洗干凈的結腸組織使用勻漿組織破碎儀粉碎至勻漿狀。接著加入20 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，用槍打散勻漿后，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到潔凈EP管內。2 500 r/min離心沉淀3～5 min，再用PBS沖洗3次，3次低速離心(500～800 r/min)去除細胞碎片，然后用30目尼龍網(wǎng)將絮狀團塊過濾掉，獲得澄澈細胞懸液。采用流式細胞術，嚴格按照規(guī)定的操作方法和步驟檢測CD44含量。

1.5 RT-PCR檢測結腸組織中IL-1β mRNA的表達 采用mRNA提取試劑盒提取細胞中的總mRNA，儲存于-80℃低溫冰箱。取總mRNA，利用RT-PCR將其反轉錄為cDNA。通過基因庫查詢出IL-1β的引物序列：上游5′-ACC TTCCAGGATGAGGACATGA-3′，下游5′-GATTCTTTCCTTTGAGGCCCA-3′。采用經(jīng)典的PCR技術行基因擴增，檢測各組IL-1β mRNA相對含量。

1.6 癥狀和體征觀察及評分 造模過程中，每天定時觀察各組小鼠的體重變化、大便狀態(tài)以及便血情況，參照Cooper的經(jīng)典評分系統(tǒng)，根據(jù)每組小鼠各種癥狀和體征變化進行評分計算，作為DAI。

1.7 結腸組織病理學評分(HPS) 選取距肛門2.0 cm以上的結腸100倍顯微鏡下觀察。根據(jù)炎癥和潰瘍對結腸黏膜損傷情況進行大致評分。潰瘍形成及炎癥：無癥狀為0分，輕微充血無潰瘍形成為1分，輕微潰瘍?yōu)?分，潰瘍合并炎癥為3分，嚴重潰瘍合并炎癥為4分，5分是>2處潰瘍和炎癥>1 cm，6～8分為潰瘍和炎癥>2 cm。留取結腸標本分別用于蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行分析行方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1 各組大鼠DAI評分情況 UC模型組大鼠開始出現(xiàn)逐漸加重的黏液狀稀便；飼養(yǎng)1 d后，大便次數(shù)開始增多，發(fā)現(xiàn)大便末端有黏液或膿點等現(xiàn)象；造模3 d后，大鼠的糞便全部變成了稀便，有部分大鼠出現(xiàn)便中帶血；5 d左右模型大鼠飲食明顯減少，體重下降顯著，精神萎靡。正常對照組大鼠大便、體重、毛發(fā)光澤度和活力等均正常。美常安治療組大鼠與模型組同期相比，食欲不振、便血和毛發(fā)干枯等癥狀都有不同程度的緩解。造模第7天。模型組的DAI(6.80±2.33)明顯高于對照組(0.38±0.14)，而美常安干預后DAI明顯緩解(4.13±1.80)。

圖1 各組大鼠結腸黏膜病理表現(xiàn)(HE，×100)

2.2 各組大鼠HPS評分情況 見圖1。顯微鏡下，模型組大鼠結腸黏膜損傷明顯，黏膜充血水腫清晰可見，潰瘍和炎癥范圍擴大，黏膜糜爛和膿腫形成，腺管排列紊亂，HPS評分(3.54±0.35)分明顯高于對照組(0.66±0.79)(P<0.05)。美常安干預后，HPS評分(1.05±0.49)較模型組下降明顯。

2.3 各組結腸組織中IL-1β mRNA及CD44表達比較 與正常對照組(0.04±0.02，8.64±1.81)相比，模型組IL-1β(0.24±0.06)和CD44(14.74±1.41)的表達明顯升高(P<0.05)，而美常安干預后兩者表達量下降顯著(0.07±0.03，10.23±1.37，P<0.05)。

3 討 論

細菌在腸道炎癥發(fā)生發(fā)展中起到了極為關鍵的作用。有文獻報道，結腸的微生物濃集區(qū)域恰好是UC患者發(fā)生炎癥常見的部位〔4〕。因此，腸道共生菌群的作用逐漸引起大家重視并在此方面尋求突破，設想以枯草桿菌二聯(lián)球菌為代表的益生菌及其產(chǎn)物治療UC的策略順勢而生。

IL-1β是一種主要由單核細胞產(chǎn)生的具有多種生物活性并能作用于體內多種組織和器官的多肽類細胞因子，在炎癥和免疫應答中發(fā)揮關鍵作用，是UC 發(fā)病的重要原因之一〔5〕，因其可趨化炎癥因子進入結腸組織，引起腸道部位發(fā)生諸如結腸上皮組織損傷、小血管炎、隱窩膿腫等的病變，還能反饋性地促進淋巴細胞產(chǎn)生IL-2等進而加速炎癥進程，協(xié)同促進炎癥反應，最終造成UC的發(fā)病〔6〕。有文獻報道從UC患者結腸黏膜中檢測到吞噬細胞中IL-1β表達異常升高，且與臨床癥狀嚴重程度基本一致〔7〕。

細胞黏附分子作為一類位于細胞膜表面的糖蛋白分子，其與UC的關系同樣引起大家的重視。它能介導細胞黏附、趨化淋巴細胞歸巢等參與炎癥和免疫反應〔8〕。細胞表面黏附分子CD44又被稱為吞噬細胞膜糖蛋白，在淋巴細胞成熟和歸巢過程中起重要作用，并在正常淋巴細胞、巨噬細胞、成纖維細胞中均有表達，在內皮細胞弱表達，但在結腸及上皮細胞中不表達〔9〕。有研究報道，在正常生理情況下，炎癥反應開始時伴隨CD44表達的升高，炎癥細胞與靶細胞黏附增加，而當炎癥反應結束后，二者黏附性隨即減弱，使損傷的組織逐漸恢復正?！?0〕。然而當發(fā)生潰瘍性結腸炎時，CD44的表達不隨炎癥反應結束而減少，導致炎癥細胞與靶細胞的黏附無法正常終止，炎癥消退減慢或炎癥的持續(xù)存在，最終表現(xiàn)為持續(xù)的組織損傷〔11〕。

美常安是含有枯草桿菌和糞腸球菌的益生菌制劑，具有顯著的生物奪氧功能。枯草桿菌能夠暫時定植于腸內部位，降低局部組織的氧濃度和氧還原電位，營造出適合厭氧的正常腸道優(yōu)勢菌群生長的環(huán)境。糞腸球菌與枯草桿菌的結合可使前者在消化系統(tǒng)的存活率顯著提高，進而發(fā)揮最大的生物學效應〔12〕。本研究說明美常安干預顯著改善了UC模型大鼠的臨床癥狀和結腸炎癥反應，效果顯著。RT-PCR和流式細胞術檢測結果提示，在UC發(fā)病機制中可能是促炎因子IL-1β表達增多、作用增強,再加上黏附分子CD44的活性持續(xù)存在，二者協(xié)同產(chǎn)生一個異常的免疫應答反應,最終導致UC發(fā)病。IL-1β和CD44很可能是發(fā)病機制中的關鍵環(huán)節(jié)，美腸安通過提高腸道減少的有益菌群，增強腸道黏膜屏障，抑制腸黏膜中促炎因子IL-1β和黏附分子CD44的表達,從而減輕腸黏膜的炎癥反應，起到治療UC的作用。

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〔2016-04-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費科研課題(No.Z2014269)

梁 勇(1968-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)疾病研究。

R57

A

1005-9202(2017)01-0027-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.011