金曄華 徐劃萍 金國琴 蔣嘉曄 龔張斌

(上海中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生化教研室，上海 201203)

補腎健脾方對地塞米松誘導大鼠骨骼肌萎縮的影響

金曄華 徐劃萍 金國琴 蔣嘉曄1龔張斌

(上海中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生化教研室，上海 201203)

目的 探討補腎健脾方對地塞米松誘導的骨骼肌萎縮的保護作用機制。方法 將24只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、中藥組、美雄酮組。在預設(shè)時間節(jié)點進行體質(zhì)量稱量，第14天測試大鼠跑臺能力，第15天采用多功能生理儀檢測大鼠肌張力，光鏡檢測肌纖維橫截面；采用Western印跡方法檢測骨骼肌肌球蛋白重鏈(Myhc)、肌肉環(huán)狀指基因(MuRF)-1蛋白表達變化。結(jié)果 與正常組比較，模型組的體重、有氧運動能力、肌張力、Myhc表達顯著下降，MuRF-1表達顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組、美雄酮組的體重、有氧運動能力、肌張力、Myhc表達顯著升高，MuRF-1表達顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 補腎健脾方能有效抑制蛋白質(zhì)的分解代謝，從而延緩地塞米松誘導的骨骼肌萎縮。

骨骼肌萎縮；糖皮質(zhì)激素；補腎健脾；泛素化

80歲以上人群中，超過50%患有衰老性骨骼肌萎縮〔1〕，嚴重影響生活質(zhì)量，并可誘發(fā)其他系統(tǒng)的衰退。研究表明，增齡性的糖皮質(zhì)激素(GC)水平異常升高與骨骼肌萎縮呈正相關(guān)。骨骼肌蛋白降解增加和(或)合成減少是骨骼肌萎縮的主要原因〔2〕。泛素-蛋白酶體通路(UPS)激活可導致靶蛋白泛素化水平增高〔3〕，是GC誘導骨骼肌蛋白降解的主要機制之一。骨骼肌萎縮在中醫(yī)學中歸為“痿證”，病機多為脾腎虧虛，臨床上應用補腎健脾法延緩肌肉萎縮常獲良效〔4〕，但其具體分子機制尚待進一步研究。本研究探討中藥補腎健脾方是否能通過調(diào)控蛋白質(zhì)泛素化水平從而延緩GC誘導的骨骼肌萎縮。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性Sprauge-Dawley(SD)大鼠24只，清潔級，體質(zhì)量(300±20)g，上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(滬)2012-0002。飼養(yǎng)條件：溫度18℃～22℃，光暗周期12 h∶12 h。

1.1.2 主要藥物與試劑 補腎益氣方：熟地黃(河南)、炙黃芪(內(nèi)蒙古)、潞黨參(山西)、淫羊藿(河南)、炒白術(shù)(浙江)，購自上?？禈蛩帢I(yè)有限公司。水煎2次，濃縮成劑，終濃度為2 mg生藥/ml，-20℃保存。小鼠抗大鼠Myhc等購自Millipore公司，兔抗大鼠MuRF-1單克隆抗體等購自Abacm公司。

1.1.3 主要儀器 XR-PT-10A小動物跑臺，上海欣軟信息科技有限公司；RM6240多道生理記錄儀，成都儀器廠；BIO-RAD電泳儀及轉(zhuǎn)膜槽，美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 適應性飼養(yǎng)1 w后，采用組間比較法隨機分組：①正常對照組(正常組)，②地塞米松模型組(模型組)，③模型+補腎益氣組(中藥組)，④模型+美雄酮組(美雄酮組)，每組6只。模型組、中藥組、美雄酮組大鼠按1 mg·kg-1·d-1腹腔注射地塞米松注射液，連續(xù)14 d。正常組予生理鹽水腹腔注射。

1.2.2 動物給藥及稱重 中藥組按臨床成人每公斤體質(zhì)量劑量的7倍計算，進行灌胃；美雄酮組按每天1 ml/100 g劑量進行美雄酮灌胃，連續(xù)14 d。正常組及模型組予以生理鹽水灌胃。分別在第1，7，11天稱量各大鼠的體質(zhì)量。

1.2.3 動物腓腸肌最大收縮力測試 造模結(jié)束后24 h內(nèi)，4%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，連接RM6240多道生理記錄儀，以強度遞增刺激模式檢測大鼠右下肢腓腸肌最大收縮力。

1.2.4 大鼠腓腸肌蘇木素-伊紅(HE)染色形態(tài)學檢測及肌纖維橫截面積的測量 分離大鼠左下肢腓腸肌，切取1 cm3大小的腓腸肌組織，浸入4%多聚甲醛中固定，用于制作石蠟切片。HE染色后，采用LEICA圖像采集系統(tǒng)選取4個視野進行拍片，放大倍數(shù)為400倍。每個視野選取20個肌纖維，應用SPOT軟件計算出每個肌纖維的橫截面積。

1.2.5 Western印跡法檢測肌肉環(huán)狀指基因(MuRF)-1、骨骼肌肌球蛋白重鏈(Myhc)蛋白表達 稱取100 mg腓腸肌組織放入無菌Eppendorf管中，低溫下超聲勻漿，12 000 r/min×10 min離心取上清，以BCA法測定蛋白濃度。配8%膠，行十二烷基硫酸鈉-聚乙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟丙烯(PVDF)膜，封閉，加一抗，4℃過夜，化學增強發(fā)光法(PBST)漂洗4次，二抗孵育，37℃搖床45 min，PBST漂洗4次?；瘜W增強發(fā)光法(ECL)檢測目標條帶。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，每個樣本重復6次。一抗工作濃度：抗MuRF-1及抗Myhc均為1∶2 000。Western條帶應用灰度分析軟件進行光密度計算。以目的蛋白/GAPDH灰度值比值作為目的蛋白的表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件行One way anova檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠在不同檢測時間點體重的變化 造模結(jié)束時，各組大鼠均未出現(xiàn)死亡。正常組大鼠體重穩(wěn)定增加；與正常組〔(19.25±1.605)g〕比較，模型組大鼠在各檢測時間點的體重明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，中藥組和美雄酮組在各檢測時間點的體重差異不明顯(P>0.05)，也呈持續(xù)下降狀態(tài)。見圖1。

2.2 各組大鼠右下肢骨骼肌最大收縮力的變化 與正常組〔(19.75±1.605)g〕比較，模型組大鼠的最大收縮力〔(11.95±1.377)g〕明顯降低；與模型組比較，中藥組〔(18.50±2.618)g〕與美雄酮組〔(19.17±1.033)g〕大鼠肌張力顯著提高(P<0.05)。

2.3 各組大鼠腓腸肌形態(tài)學檢測及肌纖維橫截面積的變化 模型組大鼠骨骼肌肌纖維橫截面積〔(2 279±468)μm2〕明顯低于正常組〔(2 895±524)μm2〕，與模型組比較，中藥組〔(2 477±451)μm2〕、美雄酮組〔(2 532±510)μm2〕大鼠骨骼肌肌纖維橫截面積顯著增粗。見圖2。

與正常組比較：1)P<0.01圖1 大鼠體重變化圖

圖2 各組大鼠骨骼肌肌纖維橫截面積(HE，×400)

2.4 各組大鼠Myhc、MuRF-1蛋白表達變化 與正常組Myhc、MuRF-1蛋白表達(0.821 6±0.112 50,0.619 2±0.081 62)比較，模型組大鼠Myhc表達(0.494 9±0.082 90)顯著下降，MuRF-1(1.053 0±0.148 4)顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組Myhc的表達(0.725 4±0.070 38)與美雄酮組(0.932 2±0.160 00)顯著增高，MuRF-1表達顯著下降(0.683 7±0.100 9，0.627 8±0.007 26，P<0.05)。見圖3。

圖3 Western印跡檢測各組大鼠組織目的蛋白表達

3 討 論

骨骼肌衰老是指隨增齡出現(xiàn)的骨骼肌萎縮，體現(xiàn)為肌肉面積指數(shù)〔肌肉面積(kg)/身高(m2)〕降低〔5〕。在70歲以上人群中，骨骼肌萎縮程度與GC濃度的增齡性升高呈正相關(guān)。GC能通過UPS通路加速骨骼肌蛋白的降解進程，致使骨骼肌萎縮。UPS是生物體內(nèi)主要的蛋白降解系統(tǒng)，主要包括泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素耦合酶(E2)、泛素蛋白連接酶(E3)、蛋白酶體和去泛素化蛋白〔6〕。MuRF-1是重要的E3家族成員，能夠結(jié)合特異性的靶蛋白序列并誘導靶蛋白發(fā)生泛素化降解〔7〕。本研究采用Noh等〔8〕方法并進行改良，建立地塞米松誘導大鼠骨骼肌萎縮模型。與既往研究結(jié)果一致，本結(jié)果表明：地塞米松通過誘導MuRF-1表達增高，促使Myhc的蛋白降解增高。Myhc是收縮蛋白-肌動蛋白的生物活性區(qū)，在肌肉收縮過程中有著重要作用。Myhc過度降解產(chǎn)生的生物學功能體現(xiàn)為大鼠體重減輕，腓腸肌纖維橫截面積下降，即出現(xiàn)骨骼肌丟失現(xiàn)象，最終導致骨骼肌功能衰退，肌肉最大收縮力減弱。雄性激素如睪酮(T)能部分對抗GC對骨骼肌的損傷，促進肌肉核酸及蛋白質(zhì)合成代謝，這也是老年人尤其是男性在50歲之后由于T水平增齡性下降而出現(xiàn)骨骼肌衰老的重要原因。合理的外源性T替代療法可有效增強肌肉功能〔9〕。但T依賴劑量、合成代謝效應并不清楚，長期使用易致前列腺癌變等副作用〔10〕，嚴重限制其臨床應用。骨骼肌萎縮以其癥狀表現(xiàn)歸為中醫(yī)“痿證”。痿證由精氣虧虛而起，與脾胃之氣直接關(guān)聯(lián)，但在根本上受到腎中精氣的調(diào)控。腎“先天之氣”與脾“后天之氣”互為關(guān)聯(lián)作用。腎陽不足累及脾陽虧虛，后天之精生成匱乏，進而損及腎精，形成惡性循環(huán)。本研究結(jié)果表明：補腎健脾方并不能有效回升地塞米松注射導致的體重下降，但能有效保護骨骼肌功能，并增大骨骼肌肌纖維橫截面積，抑制骨骼肌萎縮，提示補腎健脾方能有效對抗地塞米松對骨骼肌蛋白的降解作用。服用補腎健脾方能拮抗地塞米松誘導的MuRF-1過度表達，進而阻斷UPS信號通路，是其抑制骨骼肌蛋白降解、緩解骨骼肌萎縮、改善骨骼肌質(zhì)量的機制之一。

綜上所述，骨骼肌萎縮受到復雜的信號網(wǎng)絡控制，其機制除了MuRF通路等〔11〕介導的肌蛋白降解之外，也可能由于肌蛋白合成下降。以往的研究發(fā)現(xiàn)，補腎方藥具有雙向、多靶點調(diào)節(jié)的特點〔12〕，值得進一步研究。

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〔2016-04-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

國家自然科學基金(81001565，81473583，81403279)；上海市自然科學基金(No.16ZR1437400)；上海市博士學位點建設(shè)科研重點項目(No.B201506)；上海中醫(yī)藥大學預算內(nèi)項目(No.2014YSN04)

龔張斌(1977-)，男，副教授，博士，碩士生導師，主要從事中醫(yī)藥延緩衰老與防治老年病的機制研究。

金曄華(1991-)，女，碩士，主要從事中醫(yī)藥延緩衰老與防治老年病的機制研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)01-0013-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.005

1 上海中醫(yī)藥大學教學實驗中心