王強強，奚士航，王際銘，王 萍

(皖南醫(yī)學院 1.臨床醫(yī)學院;2.微生物學與免疫學教研室，安徽 蕪湖 241002)

外周血CD5+B淋巴細胞與不明原因自然流產(chǎn)的關系性研究

王強強1，奚士航1，王際銘1，王 萍2

(皖南醫(yī)學院 1.臨床醫(yī)學院;2.微生物學與免疫學教研室，安徽 蕪湖 241002)

目的：通過檢測不明原因自然流產(chǎn)患者和正常育齡婦女外周血CD5+B淋巴細胞的含量，探討CD5+B淋巴細胞與不明原因自然流產(chǎn)的關系。方法：選擇自然流產(chǎn)患者5例，正常育齡婦女5例。運用免疫磁珠法分離外周血中B淋巴細胞，采用流式細胞術檢測CD5+B淋巴細胞的含量。結果：正常育齡組外周血中CD5+B淋巴細胞的比例為(0.78±0.40)%；自然流產(chǎn)組為(6.64±4.34)%。自然流產(chǎn)組明顯高于正常育齡組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：CD5+B淋巴細胞可能參與不明原因自然流產(chǎn)的發(fā)病過程。

CD5+B淋巴細胞;自然流產(chǎn);免疫磁珠法;流式細胞術

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2017.01.003

CD5+B細胞是B淋巴細胞一個亞群,是由胚胎或出生后早期的前體細胞發(fā)育而來,主要分布在腹膜、胸膜、腸系膜、大網(wǎng)膜及扁桃體等處?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)CD5+B細胞參與多種自身免疫性疾病的發(fā)病機制，如干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節(jié)炎(RA)等[1-3]，這可能與CD5+B細胞分泌多種自身抗體有關。研究發(fā)現(xiàn)抗心磷脂抗體、抗單鏈DNA抗體[4]與自然流產(chǎn)有著密切的關系，自然流產(chǎn)患者血清中自身抗體可與相應抗原結合形成免疫復合物，沉淀于器官和血管，造成多器官損害，并可引起胎盤功能不全、胚胎發(fā)育障礙而引起妊娠丟失[5]。CD5+B細胞可產(chǎn)生相應抗體，故推測CD5+B細胞與自然流產(chǎn)的發(fā)病有關。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2016年3～6月皖南醫(yī)學院生育專科門診部不明原因自然流產(chǎn)患者 5例，平均年齡(28.4±4.6)歲，平均孕周(8.3±3.0)周。所有患者經(jīng)檢查，夫妻雙方染色體正常，內分泌檢查無異常，排除全身感染性疾病，排除遺傳疾病，在臨床治療前采集患者血樣。另設體檢健康的無自然流產(chǎn)史的育齡婦女5名作為對照組，平均年齡(24.3±3.2)歲。

1.2 主要試劑與儀器 CD19 McroBeads，human(Miltenyi公司)；MACS Buffer(Miltenyi公司)；CD19-PE human(Miltenyi公司)；Anti-Human CD5 APC(eBioscience公司)；Phosphate Buffered Saline(PBS,HyClone公司)；人外周血淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)；2%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)：取2g PFA加入100 mL磷酸緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)中，置于60℃水浴鍋中水浴溶解，調pH為7.2，4℃冰箱貯存。超凈工作臺(型號：Class Ⅱ BSC，新加坡ESCO公司)；磁性細胞分離架(型號：MACS，Miltenyi公司)；冷凍離心機(型號：4K1S，sigma公司)；流式細胞儀(型號：FACS Verse，BD公司)。

1.3 方法

1.3.1 外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的分離,采用密度梯度離心法 ①取新鮮抗凝靜脈血10 mL與等量PBS充分混勻，將混勻后的液體緩慢滴加于10 mL淋巴細胞分離液液面上(抗凝靜脈血∶PBS∶淋巴細胞分離液=1∶1∶1)，2000 r/min×20 min。 ②吸取單個核細胞，加5倍容積的PBS洗滌兩次，1500 r/min×5 min，用PBS調整細胞濃度為1×107/mL。

1.3．2 免疫磁珠分選[6]①用40 μm篩網(wǎng)過濾上述細胞懸液中較大團塊，1500 r/min×5 min，100 μL MACS Buffer定容，取80 μL細胞懸液(余下20 μL作為分選前細胞)加入20 μL CD19 McroBeads,human,4℃放置15 min，加入400 μL緩沖液定容細胞懸液到500 μL，混勻。②組裝美天旎磁珠分選系統(tǒng)，以500 μL MACS Buffer潤洗美天旎分選柱(MS柱)待流空后將分選的細胞上柱，待流空后取500 μL MACS Buffer沖洗分選柱，重復3次。③將MS柱移出磁場，加入1 mL MACS Buffer，迅速推動活塞，使磁性標記的細胞流入收集管中，標記為CD19+細胞。

1.3.3 流式細胞儀檢測 ①用PBS洗滌細胞懸液,將分選前細胞分成四管，空白管1個，補償管2個和檢測管1個。分選后細胞分為兩管，空白管和檢測管。分別用CD19-PE human 和Anti-Human CD5 APC進行細胞表面抗原的熒光染色，放置于4℃冰箱中避光30 min。注意取熒光抗體的移液器頭只能一次性使用，避免熒光抗體交叉污染。要將細胞懸液和熒光抗體加在流式管底部，不應加到管壁上，防止細胞懸液和熒光抗體不能充分接觸。注意避光，以免光亮造成熒光猝滅。②PBS 1 mL洗滌兩遍，加2%PFA 400 μL/管，震蕩混勻待上機檢測。③ FCM分析，上機檢測前應使用BD公司提供的質控微球來設置和調節(jié)各種參數(shù)使儀器處于最佳狀態(tài)。分別作FSC/SSC,CD19/CD5二維點圖；上空白管，調節(jié)FSC/SSC散點圖電壓，使出現(xiàn)的細胞點位于散點圖的適當位置。在FSC/SSC散點圖上圈出淋巴細胞區(qū)域設門,設門要注意把分析的細胞設置在門內，盡量減少其他細胞和細胞碎片摻入，獲取的細胞數(shù)應足夠。上補償管，觀察散點圖上陽性細胞位置，依次調節(jié)各熒光補償。上檢測管，分別統(tǒng)計正常育齡婦女和自然流產(chǎn)患者免疫磁珠分選前后CD19+CD5+細胞所占百分比。見圖1、2。

2 結果

2.1 CD19分選結果 通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)CD19單克隆抗體磁珠用于外周血淋巴細胞分選，分選后的CD19陽性細胞可以達到(78.80±14.57)%，而分選前CD19陽性細胞只占(2.27±2.06)%。

2.2 分選后CD5+B淋巴細胞檢測結果 外周血中CD5+B細胞亞群水平的FCM檢測結果顯示，自然流產(chǎn)組患者外周血CD19+CD5+細胞含量為(6.64±4.34)%，對照組為(0.78±0.40)%，與對照組比較，自然流產(chǎn)組患者CD19+CD5+細胞比例升高，差異有統(tǒng)計學意義(t′=3.005，P<0.05)。

圖1 1例自然流產(chǎn)患者單個核細胞設門

圖2 1例自然流產(chǎn)患者免疫磁珠分選后CD19+CD5+細胞比例

3 討論

近年研究表明CD5+B細胞能產(chǎn)生多種針對自身抗原的抗體,與自身免疫病的發(fā)生有關。Seidi等[7]在多發(fā)性硬化癥中觀察到CD5+B細胞與髓鞘蛋白抗體產(chǎn)生有關，并且也與多發(fā)性硬化癥的活動期有關。李正發(fā)等[8]研究發(fā)現(xiàn)免疫相關性全血細胞減少癥(IRP)患者外周血CD5+B細胞比率顯著高于惡性血液病患者及正常對照組。付蓉等[9]提出IRP患者自身抗體的產(chǎn)生與B淋巴細胞及其亞群數(shù)量異常、功能亢進及凋亡受抑有關，利用流式細胞術檢測骨髓造血細胞自身抗體及B淋巴細胞數(shù)可以為IRP的診斷提供科學可靠的依據(jù)。本實驗結果顯示自然流產(chǎn)患者外周血CD5+B細胞含量較正常育齡者升高(P<0.05)，故推測CD5+B細胞數(shù)量的增多，導致其產(chǎn)生的抗體含量增多，如抗心磷脂抗體、抗單鏈DNA抗體等，導致母體免疫平衡失調，排斥作用增強引起流產(chǎn)。

免疫磁珠分選方法是近幾年發(fā)展起來的一種細胞分選技術,尤其以德國Miltenyi Biotech公司的MACs和MiniMACS應用最多，它的基本原理是通過與磁性顆粒交聯(lián)的特異性單抗結合靶細胞表面標志性抗原，借助磁力的作用，細胞被吸附而滯留在磁場中，將細胞進行分離。流式細胞分選技術(FACS)基本原理是利用流式細胞分選儀，以高能量激光照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強度以達到分選的目的。相比FACS而言，MACS對細胞的刺激較小，操作簡單，穩(wěn)定性高、重復性強，所獲得的細胞活性較高，不會出現(xiàn)像FACS那樣由于機器運行時間長導致參數(shù)漂移故而實際獲取的靶細胞陽性率大大下降的情況，更適用于臨床大批量的細胞分選和大多數(shù)實驗室的細胞分選工作。據(jù)文獻報道，免疫磁珠技術可以用于分離人體各種細胞，如B淋巴細胞、T淋巴細胞、內皮細胞、造血干細胞、單核吞噬細胞、胰島細胞和多種腫瘤細胞等。如今免疫磁珠技術已廣泛應用于臨床，尤其在腫瘤的診斷、分期方面發(fā)揮著重要作用。Ogura等[10]使用免疫磁珠，從外周血中提取出來的CD34+干細胞，將之用于Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗研究，結果顯示這種技術純化出來的干細胞是安全有效的。本實驗運用免疫磁珠聯(lián)合流式細胞儀分選后的CD19+B淋巴細胞可達到(79.48±10.99)%，遠遠大于分選前細胞比例，分離步驟簡便易行，在獲得高純度細胞的同時，對細胞損傷少，細胞丟失少，對臨床大樣本分離較安全、準確。

本實驗表明自然流產(chǎn)患者外周血CD5+B細胞水平升高，但其具體的調節(jié)機制及 病理過程還未明確，今后我們將測定流產(chǎn)患者外周血中特定抗體的含量，探討自身抗體與CD5+B細胞的關系。通過測定CD5+B細胞的基因表達水平進一步探討CD5+B細胞與自然流產(chǎn)的關系，為不明原因自然流產(chǎn)的產(chǎn)前診斷提供一定的參考價值，也為其治療提供思路。

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Peripheral blood CD5+B lymphocytes and spontaneous abortion of unknown origin

WANG Qiangqiang,XI Shihang,WANG Jiming,WANG Ping

School of Clinical Medicine,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective：To investigate the correlation of spontaneous abortion of unknown causes and CD5+B lymphocytes through determination of the CD5 positive B lymphocyte level in the peripheral blood in women with unestablished miscarriage and normal pregnancy.Methods:Five patients with spontaneous abortion were included in the experimental group,and five women of normal pregnancy were recruited as control group.Magnetic activated cell sorting technique was used to(MACS)to isolate the peripheral blood CD5+B lymphocytes for which the level was measured with flow cytometry(FCM).Results:Women of normal pregnancy had higher level of peripheral blood CD5+B lymphocytes than the patients with miscarriage[(6.64±4.34)%vs.(0.78±0.40)%].The difference was significant(P<0.05).Conclusion:CD5+B lymphocytes might be involved in the pathogenesis of the spontaneous abortion of unknown origin.

CD5+B lymphocytes;spontaneous abortion;magnetic activated cell sorting;flow cytometry

1002-0217(2017)01-0008-03

國家級大學生創(chuàng)新訓練項目(201410368033)

2016-09-01

王強強(1995-)，男，2012級臨床醫(yī)學專業(yè)本科生,(電話)15755383969，(電子信箱)1441551658@qq.com； 王 萍，女，副教授，碩士生導師,(電子信箱)418187325@qq.com，通信作者。

R 392.3;R 714.21

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