趙佰橋，劉劍華

蛇床子素對腎臟缺血-再灌注損傷的作用研究

趙佰橋，劉劍華*

目的 探討蛇床子素對腎臟缺血-再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury,IRI)的作用及其機制。方法 通過夾閉左側(cè)腎蒂并切除右腎的方法構(gòu)建大鼠IRI模型。觀察各組尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cr)、腎臟病理形態(tài)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)和白細胞介素-6(IL-6)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)的表達，評估蛇床子素對大鼠腎臟缺血-再灌注損傷的作用。結(jié)果 蛇床子素可增加CAT、GPx和SOD表達，減少Cr、BUN、MDA、TNF-α、MCP-1和IL-6的表達以及腎臟病理形態(tài)的改變。結(jié)論 蛇床子素可通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)而減輕腎臟缺血-再灌注損傷。

蛇床子素；腎臟缺血-再灌注損傷；炎癥；氧化應(yīng)激

0 引言

腎臟缺血-再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion,IRI)是臨床上常見的危重癥，嚴重影響腎功能乃至生命。隨著腎臟移植、體外大循環(huán)手術(shù)和心臟移植等手術(shù)的廣泛開展，其發(fā)病率越發(fā)增高，因此,減輕IRI具有重要的臨床現(xiàn)實意義[1-4]。蛇床子素是從蛇床、歐前胡等傳統(tǒng)中草藥植物中提取的香豆素類物質(zhì)[5-6]，最新研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗炎[7]、抗凋亡[8]、抗氧化應(yīng)激[9]、抗腫瘤等生物學活性[10]。本實驗探討了蛇床子素對IRI的作用及機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 蛇床子素(Sigma，USA，經(jīng)HPLC鑒定純度超過99%)、水合氯醛(武漢谷歌)、白介素-6(IL-6)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)，ELISA檢測盒(Ebioscience,USA)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購自美國GeneCopoeia公司，RT-PCR引物由擎科生物技術(shù)有限公司合成。顯微鏡(Olympus BX51)及成像系統(tǒng)(HITMAS-30)和HE染色均為連云港醫(yī)院病理科提供。

1.2 實驗動物分組和模型構(gòu)建 50只雄性SD大鼠，體重(230±20)g，由北京華福康實驗動物中心提供。放置在SPF動物飼養(yǎng)室內(nèi)喂養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,狀態(tài)良好,隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、腎臟缺血-再灌注損傷組(IRI組)和蛇床子素(Osthole)預處理組,每組10只。Osthole組術(shù)前1 h給予蛇床子素腹腔注射(5、10、20 mg/kg)。Sham組和IRI組則給予等量生理鹽水腹腔注射，IRI組和Osthole組施予腎缺血-再灌注手術(shù)。腎缺血-再灌注手術(shù)方式如下:大鼠水合氯醛麻醉狀態(tài)下行腹部正中切口,游離組織，分離暴露腎蒂,用血管夾夾閉左側(cè)腎蒂,紗布覆蓋切口置于37 ℃溫箱45 min,然后松開血管夾,恢復腎臟血流灌注,去除右側(cè)腎臟,縫合腹部,術(shù)畢放回動物房。假手術(shù)組與上述方法類似,僅開腹而不夾閉左側(cè)腎蒂。松開血管夾24 h后處死大鼠,收集血清和腎臟標本。實驗中,動物狀態(tài)較好,蘇醒較快,無死亡動物，術(shù)后給予正常飲食飲水。具體手術(shù)方法參考文獻[11]。

1.3 標本收集 各組大鼠在腎臟再灌注24 h后,行腹主動脈取血,室溫下3 000 r/min離心10 min后，取上清液送仁和醫(yī)院檢驗科檢測血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Cr)。開腹取左腎;三分之一腎置于多聚甲醛做石蠟切片,其余腎組織凍于-80 ℃冰箱保存。

1.4 腎臟病理檢查 左腎蠟塊4 μm切片,脫蠟透明后由病理科實驗室行PAS染色,光鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)并評分。分級評分標準：損傷<10%，病理評分為0分；損傷10%～25%，病理評分為1分；損傷25%～50%，病理評分為2分；損傷50%～75%，病理評分為3分；損傷75%～100%，病理評分為4分，具體評分標準參考文獻[11]。

1.5 RT-PCR檢測腎臟促炎癥細胞因子mRNA水平 采用RT-PCR法檢測腎臟TNF-α、MCP-1和IL-6的mRNA表達水平。稱取適量腎臟組織，于液氮中研磨成粉末狀，提取總RNA，紫外分光光度計測量濃度。引物序列見表1。采用兩步法PCR反應(yīng)，擴增條件95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸1 min。共40個循環(huán)，得到每個樣本的Ct(Cycle threshold)值法，用得到的各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCt計算相對表達量。

表1 基因引物序列

1.6 檢測指標 按照ELISA試劑盒說明書操作步驟，檢測血清中TNF-α、MCP-1和IL-6的蛋白表達水平。利用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid,TBA)法檢測腎組織丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量，按照說明書操作。按照試劑盒說明書，用比色法測定腎組織過氧化氫酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPx)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對腎臟缺血-再灌注損傷的影響 與Sham組比較，IRI組Cr和BUN明顯增加(P<0.05)。與IRI組比較，Osthole組Cr和BUN呈劑量依賴性降低(P<0.05)，提示蛇床子素在5～20mg/kg的范圍內(nèi)，呈劑量依賴性減輕腎臟缺血-再灌注損傷，其最佳劑量為20mg/kg，見表2。

2.2 蛇床子素對腎臟病理改變的影響 與Sham組比較，IRI組腎小管上皮細胞裂解，腫脹，透明管型形成，腎小管擴張以及腎小管壞死明顯增加，其損傷評分為(3.0±0.5)分，而Sham組為(0.5±0.5)分，提示病理改變明顯增加(P<0.05)。

表2 蛇床子素對肌酐和尿素氮的影響

注：與Sham組比較，**P<0.01；與IRI組比較，#P<0.05

Osthole組與IRI組相比,腎小管上皮細胞裂解，腫脹，透明管型形成，腎小管擴張以及腎小管壞死明顯減少，其損傷評分為(1.5±0.5)分，提示蛇床子素可明顯減輕腎臟損傷(P<0.05)。蛇床子素在最佳濃度可明顯減輕IRI導致的腎臟病理改變,見圖1。

圖1 PAS染色檢測蛇床子素對腎臟形態(tài)的影響

2.3 蛇床子素對腎組織促炎癥細胞因子表達的影響 與Sham組比較，IRI組腎臟TNF-α、MCP-1和IL-6 mRNA表達明顯增加(P<0.05)；與IRI組比較，Osthole 20 mg/kg組腎臟TNF-α、MCP-1和IL-6 mRNA表達明顯減少(P<0.05)，提示蛇床子素可減輕腎臟促炎癥細胞因子的表達。見表3。

表3 蛇床子素對腎臟促炎癥細胞因子mRNA表達水平的影響

注：與Sham組比較，**P<0.01；與IRI組比較，#P<0.05

2.4 蛇床子素對血清促炎癥細胞因子分泌的影響 與Sham組比較，IRI組血清中TNF-α、MCP-1和IL-6表達水平明顯增高(P<0.05)。與IRI組比較，Osthole 20 mg/kg組血清TNF-α、MCP-1和IL-6表達水平明顯降低(P<0.05)。提示蛇床子素可減少促炎癥細胞因子的分泌。見表4。

表4 蛇床子素對血清中促炎癥細胞因子表達水平的影響(pg/mL)

注：與Sham組比較，**P<0.01；與IRI組比較，#P<0.05

2.5 蛇床子素對腎臟丙二醛含量的影響 與Sham組比較，IRI組MDA表達水平明顯增高(P<0.05)。與IRI組比較，Osthole組MDA水平明顯降低(P<0.05)。提示蛇床子素可明顯減少促氧化應(yīng)激酶丙二醛的表達，見表5。

表5 蛇床子素對腎臟MDA表達的影響

注：與Sham組比較，**P<0.01；與IRI組比較，#P<0.05

2.6 蛇床子素對腎臟氧化應(yīng)激酶活性的影響 與Sham組比較，IRI組CAT、GPx和SOD活性明顯降低(P<0.05)。與IRI組比較，Osthole組CAT、GPx和SOD活性明顯增高(P<0.05)。提示蛇床子素可增加抗氧化應(yīng)激酶的活性，見表6。

表6 蛇床子素對氧化應(yīng)激酶CAT、GPx和SOD活性的影響(U/mg)

注：與Sham組比較，**P<0.01；與IRI組比較，#P<0.05

3 討論

急性腎功能衰竭是臨床上常見危重疾病,其最主要的致病原因是腎缺血-再灌注損傷。腎缺血-再灌注損傷是指腎臟在缺血的基礎(chǔ)上，重新恢復腎臟血供導致腎臟損傷進一步加重的臨床危象[1-2]。其好發(fā)于心臟移植、心臟體外大循環(huán)手術(shù)、休克患者等[3-4]。目前，對腎缺血-再灌注損傷的病理生理過程已經(jīng)有較多研究,但尚缺乏有效的治療方法。目前，對IRI的藥物干預治療研究主要集中在對動物模型進行實驗研究,包括術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后的藥物干預研究。黃亮等[12]研究顯示，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)術(shù)前給藥，能減輕腎臟缺血-再灌注損傷，保護腎臟功能。此外，姜黃素單體術(shù)前給藥也能減輕腎臟缺血-再灌注損傷[13]。蛇床子素具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗腫瘤作用，可清除體內(nèi)各種活性氧自由基[5]，保護GPx、CAT、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等[6]，對腸[14]、心[15]、腦[16]等器官缺血-再灌注損傷具有保護作用。因此，本研究選用蛇床子素對腎缺血-再灌注損傷大鼠術(shù)前用藥,以探討蛇床子素的保護作用及潛在機制。

既往大量研究顯示，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、鈣超載、中性粒細胞聚集、凋亡等是IRI重要的發(fā)病機制[1-4]。盡管目前構(gòu)建腎臟缺血-再灌注損傷模型有夾閉雙側(cè)腎蒂以及單側(cè)腎蒂兩種方式，因單側(cè)腎蒂夾閉更接近臨床，因此，本研究選擇夾閉左側(cè)腎蒂，并切除右腎構(gòu)建腎臟缺血-再灌注損傷模型。研究顯示，腎臟缺血-再灌注損傷可明顯減少CAT、GPx和SOD表達，但可明顯增加Cr、BUN、MDA、TNF-α、MCP-1和IL-6的表達以及腎臟病理形態(tài)的改變，進一步證實了炎癥和氧化應(yīng)激是導致腎臟損傷的重要致病因素[1-4]。因此，抑制炎癥和氧化應(yīng)激可能是減輕IRI的有效治療途徑之一。本研究顯示，蛇床子素術(shù)前給藥，可明顯增加CAT、GPx和SOD表達，減少Cr、BUN、MDA、TNF-α、MCP-1和IL- 6的表達以及腎臟病理形態(tài)的改變，提示蛇床子素可通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激而減輕IRI。

綜上所述，我們推測蛇床子素術(shù)前給藥，可通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)而減輕IRI。但除抑制炎癥和氧化應(yīng)激外，是否還有其他信號途徑涉及蛇床子素減輕腎臟缺血-再灌注損傷，以及蛇床子素如何調(diào)節(jié)炎癥和氧化應(yīng)激，尚需進一步研究。

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Effect of osthole on renal ischemia reperfusion injury

ZHAO Bai-qiao,LIU Jian-hua*

(Department of Nephrology,Lianyungang First People′s Hospital,Lianyungang 222002,China)

Objective To study the effect of osthole on renal ischemia reperfusion injury(IRI) and its potential mechanism.Methods The model of IRI was induced by clamping the left renal pedicles with right nephrectomy.The effect of osthole on IRI was examined by evaluating the BUN,Cr,the morphology of kidney and the expression of TNF-α,IL-6,MCP-1,MDA,CAT,GPx and SOD.Results Osthole could significantly increase the expression of CAT,GPX and SOD while attenuating the morphological change of kidney and the expression of Cr,BUN,MDA,TNF-α,MCP-1 and IL-6.Conclusion Osthole can suppress renal ischemia reperfusion injury by reducing inflammation and oxidative stress

Osthole;Renal ischemia reperfusion injury;Inflammtion;Oxidative stress

2016-06-11

連云港市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科,江蘇 連云港 222002

連云港市科技基金(A1302-31)

10.14053/j.cnki.ppcr.201701004

*通信作者