陳夢然+高浩澤+周培培+劉俊+李擁軍

摘要：為了探討不同質(zhì)量濃度維生素E和谷氨酰胺（glutamine，Gln）對精子獲能的影響，以及與獲能有關(guān)的關(guān)鍵基因在獲能后相對表達(dá)量的差異，在獲能液中加入不同質(zhì)量濃度的維生素E（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）或Gln（0、5、10、15、20 mg/mL），并分別將其與精子懸液一同培養(yǎng)，以孕酮誘導(dǎo)頂體反應(yīng)，通過涂片染色鏡檢得到頂體發(fā)生率；采用實(shí)時熒光定量PCR得到獲能相關(guān)基因蛋白激酶A催化亞單位β（PRKACB）和ACP6（acid phosphatase 6，lysophosphatidic）在獲能后的表達(dá)。結(jié)果表明，添加質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的維生素E對精子頂體發(fā)生率的影響顯著高于其他組別（P<0.05）；添加質(zhì)量濃度為15 mg/mL的Gln，精子頂體發(fā)生率顯著高于其他組別（P<0.05）；與空白對照組相比，維生素E最佳質(zhì)量濃度處理組（1.0 mg/mL）的PRKACB和[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]基因的相對表達(dá)量顯著性降低（P<0.05）；Gln最佳質(zhì)量濃度處理組（15 mg/mL）處理后，基因[WTBX][STBX]PRKACB、ACP6[WTBZ][STBZ]在獲能后的相對表達(dá)量高于空白對照組，但差異不顯著（P>0.05）?？梢?，獲能液中添加維生素E和Gln對兔精子獲能具有一定影響。

關(guān)鍵詞：維生素E；谷氨酰胺；精子獲能；基因表達(dá)

中圖分類號： S829.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0306-03

隨著哺乳動物胚胎生物工程技術(shù)的深入研究以及商業(yè)性胚胎移植技術(shù)的迅猛發(fā)展，對卵母細(xì)胞和胚胎的需求量日益增加[1]，加強(qiáng)對體外受精技術(shù)的研究十分必要。精子獲能是精卵結(jié)合的重要前提，獲能效果的好壞直接影響受精效果。學(xué)者以小鼠[2]、山羊[3]等為試驗(yàn)材料，對精子獲能機(jī)理、獲能方法等進(jìn)行了大量研究，從而推動了體外受精技術(shù)的發(fā)展。

動物精液中帶有少量的活性氧（ROS），在進(jìn)行孵育的過程中，精子的呼吸代謝也會產(chǎn)生一定量的ROS，正常范圍內(nèi)的ROS有助于精子獲能，但高濃度的ROS會對精子獲能過程造成阻礙。生產(chǎn)中常通過添加抗氧化劑來減少和消除ROS對精子的不利影響[4]。維生素E的主要功能是非特異性的斷鏈抗氧化，因此維生素E能保證細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，也可緩解氧自由基造成的應(yīng)激[5]。谷氨酰胺是一種重要的氨基酸，參與合成谷胱甘肽。谷胱甘肽對維持生物體內(nèi)適宜的氧化還原環(huán)境具有至關(guān)重要的作用。在動物機(jī)體內(nèi)，谷胱甘肽參與對異物和親電代謝物的去毒，是有效的自由基清除劑，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧復(fù)合物的損傷[6]。本試驗(yàn)探討維生素E和谷氨酰胺對兔精子獲能的影響，為進(jìn)一步提高兔的人工授精效率提供理論及實(shí)踐依據(jù)。

研究表明，蛋白酪氨酸磷酸化（PTP）有利于精子獲能，精子中可能存在4種PTP信號傳導(dǎo)途徑，其中最為重要的是可溶性AC/cAMP/PKA途徑。該信號傳遞路徑為：Ca2+、HCO-3等信號離子→可溶性腺苷酸環(huán)化（adenylatecyclase，AC）被激活→環(huán)磷酸腺苷（cAMP）含量增加→PKA被活化→PKA底物磷酸化→蛋白酪氨酸磷酸化→精子獲能[7]。PKA是可溶性AC/cAMP/PKA信號途徑中最為重要的關(guān)鍵信號節(jié)點(diǎn)，由2個具有調(diào)節(jié)功能的亞基單位（R）和2個具有催化功能的亞基單位（C）組成，在cAMP的作用下調(diào)節(jié)亞基并催化亞基分離，使PKA激活，誘發(fā)PKA底物磷酸化以及最終的蛋白酪氨酸磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)精子發(fā)生獲能變化。目前已有5個不同的人類C亞單位基因被鑒定，即PRKACA、PRKACB、PRKACG、PRKX、PRKY。PRKACA、PRKACB、PRKX人類C亞單位基因被轉(zhuǎn)錄和翻譯為功能性蛋白激酶，分別被稱為PKA Ca、PKA Cb、PRKX[8]。隨著獲能進(jìn)程的推進(jìn)，精子AC、頂體酶、神經(jīng)氨酸苷酶等相繼被激活。膽固醇流失引起的Ca2+、HCO-3內(nèi)流激活了AC[9]，最終胞漿內(nèi)Ca2+緩慢降低，頂體酶原逐漸活化變?yōu)轫旙w酶，激活的頂體酶作用于膜上和膜內(nèi)相關(guān)成分，觸發(fā)了后續(xù)的一系列獲能相關(guān)反應(yīng)[10]。其中，酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）是精子獲能過程中變化最為劇烈的一種頂體酶類[11]，磷酸酶的激活提高了膜脂代謝率，產(chǎn)生大量溶血磷脂，這些溶血磷脂代謝產(chǎn)生的甘油二脂可激活蛋白激酶，通過調(diào)控PTP影響精子獲能[12]。溶血磷脂酸性磷酸酶6型（lysphosphatidic acid phosphatase type 6）是一種由基因[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]（acid phosphatase 6，lysophosphatidic）編碼在人類基因中的酸性磷酸酶，該基因的表達(dá)與溶血磷脂酸性磷酸酶及酸性磷酸酶的活性相關(guān)[13]。本試驗(yàn)通過對PRKACB和[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]相對表達(dá)量的測定，從而分析維生素E和Gln對精子獲能的影響。[LM]

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動物

選用體況相近的新西蘭大白兔公兔（購自江蘇省南京市金陵種兔場）進(jìn)行籠養(yǎng)，飼喂顆粒飼料，自由飲水，定期補(bǔ)充適量青綠飼料。

1.2主要試劑

維生素E（純度≥50%）購自上海源葉生物科技有限公司，L-谷氨酸鈉（含量≥98.0%）購自北京索萊寶科技有限公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司。FastQuant RT Kit（cDNA第一條鏈合成試劑盒）、SuperReal PreMix Plus均購自天根生化科技（北京）有限公司。氯化鈉、氯化鉀、NaH2PO4·H2O、MgCl2·6H2O、氯化鈣、葡萄糖、0.2%酚紅、青霉素、鏈霉素、碳酸氫鈉、丙酮酸鈉、肝素、BSA、孕酮、考馬斯亮藍(lán)染液（CBB）、10×PBS。

1.3精液的采集及頂體反應(yīng)的誘導(dǎo)

選用體況相近的新西蘭大白兔公兔，采用假陰道法進(jìn)行精液采集。先將采集到的精液進(jìn)行鏡檢，保證精子活力在06以上；將精液與獲能液按1 ∶[KG-3]（2～3）比例混勻，離心去上清液后在下層精子沉淀中加入1 mL獲能液，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～30 min；吸取上清液離心后去上清，分別加入含不同質(zhì)量濃度維生素E（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）、Gln（0、5、10、15、20 mg/mL）的獲能液稀釋2～5倍，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h；向培養(yǎng)后的精液中加入孕酮，使其在培養(yǎng)液中的質(zhì)量濃度為 1 μg/mL，并繼續(xù)培養(yǎng)30 min。

1.4考馬斯亮藍(lán)法判斷頂體反應(yīng)

精子完成頂體反應(yīng)后，精子懸液以1 000 r/min離心5 min，沉淀以固定液固定10 min，離心去上清，用10×PBS洗滌2遍。采用適量10×PBS懸浮沉淀，將CBB染色液滴于玻片上染色30 min，采用CBB脫色液沖洗玻片并晾干。采用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，隨機(jī)觀察不同視野中的200個精子，并計算其頂體反應(yīng)率。

2結(jié)果與分析

2.1兔頂體反應(yīng)誘導(dǎo)與維生素E的關(guān)系

由圖1可知，隨著維生素E質(zhì)量濃度的上升，精子的頂體發(fā)生率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)維生素E的質(zhì)量濃度為 1.0 mg/mL 時，精子的頂體發(fā)生率最高，與其他組相比具有顯著性差異（P<0.05）。質(zhì)量濃度為0.5、1.5 mg/mL的處理組與空白組相比，精子的頂體發(fā)生率均有所提高，但差異不顯著（P>0.05）。質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的處理組與空白組相比，精子的頂體發(fā)生率有所下降，但差異不顯著（P>005），

[FK（W11][TPCMR1.tif；S+4mm][FK）]

而與其他試驗(yàn)組相比差異性顯著（P<005），可能是由于質(zhì)量濃度過高的維生素E不利于精子的獲能反應(yīng)。

由圖1得出最佳質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，該質(zhì)量濃度的處理組與空白組相比，精子獲能后PRKACB和[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]基因的相對表達(dá)量均有所下降，且差異性顯著（P<0.05）。PRKACB與[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]基因的相對表達(dá)量相比較，二者之間不具有顯著性差異（P>0.05）（圖2）。

2.2谷氨酰胺對兔精子獲能和頂體反應(yīng)的影響

由圖3可知，隨著Gln質(zhì)量濃度的上升，精子的頂體發(fā)生率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)Gln質(zhì)量濃度為15 mg/mL時，精子的頂體發(fā)生率最高，與其他組相比具有顯著性差異（P<0.05）。質(zhì)量濃度為5、10、20 mg/mL的處理組與空白組相比，精子的頂體發(fā)生率差異性均不顯著（P>0.05）?？梢姡?5 mg/mL 為最佳處理濃度。

由圖3得出最佳質(zhì)量濃度為15 mg/mL，該質(zhì)量濃度的處

理組與空白組相比，精子獲能后PRKACB和[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]基因的相對表達(dá)量均有所上升，但差異性不顯著（P>0.05）。PRKACB與[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]基因的相對表達(dá)量相比較，二者之間不具有顯著性差異（P>0.05）（圖4）。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用考馬斯亮藍(lán)染色法研究添加不同質(zhì)量濃度的維生素E、Gln對精子獲能的影響，結(jié)果表明，獲能液中維生素E添加量為0.5、1.5 mg/mL時，精子頂體發(fā)生率有所提高，但差異不顯著（P>0.05）；當(dāng)添加量為1.0 mg/mL時，頂體發(fā)生率顯著提高（P<0.05）；當(dāng)添加量為2.0 mg/mL時，頂體發(fā)生率下降。頂體發(fā)生率整體呈先上升后下降的趨勢，表明維生素E的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)對精子的頂體發(fā)生率具有正向調(diào)控作用；當(dāng)維生素E的質(zhì)量濃度達(dá)到一定量時，精子的頂體發(fā)生率會受到一定程度的抑制。試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量濃度維生素E處理后的精子死亡率明顯高于其他處理組，表明高質(zhì)量濃度維生素E對精子具有一定傷害作用。添加Gln的試驗(yàn)結(jié)果相似，總體呈先上升后下降的趨勢。獲能液中Gln添加量為5 mg/mL時，精子頂體率有所提高，但差異不顯著（P>0.05）；當(dāng)添加量為15 mg/mL時，頂體反應(yīng)率顯著提高（P<0.05）?？梢姡砑右欢ㄙ|(zhì)量濃度的維生素E或谷氨酰胺可有效清除獲能過程中過多產(chǎn)生的ROS，防止精子細(xì)胞膜損傷、脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)磷酸化，從而影響獲能，這與Shiva等的研究結(jié)論[14]一致。

本試驗(yàn)還采用實(shí)時熒光定量PCR得到獲能相關(guān)基因PRKACB和[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]的相對表達(dá)量，結(jié)果表明，與空白對照組相比，維生素E最佳質(zhì)量濃度處理組（1.0 mg/mL）PRKACB和[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]基因的相對表達(dá)量顯著性降低（P<0.05）?？梢?，雖然宏觀上最佳處理質(zhì)量濃度對于精子的頂體發(fā)生率具有顯著提高作用，但由于機(jī)體內(nèi)部存在反饋機(jī)制，過多的基因表達(dá)開啟了負(fù)反饋機(jī)制，從而導(dǎo)致相應(yīng)基因的表達(dá)量下調(diào)。與維生素E相比，Gln最佳質(zhì)量濃度處理組PRKACB和[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]基因在獲能后的相對表達(dá)量高于空白對照組，但差異不顯著（P>0.05）?？梢?，Gln在精子獲能過程中可促進(jìn)蛋白激酶A和磷酸激酶的活性，與宏觀上Gln最佳質(zhì)量濃度促進(jìn)精子的頂體發(fā)生率相一致。在獲能液中添加1.0 mg/mL維生素E或 15 mg/mL 谷氨酰胺，對兔精子獲能具有顯著性影響。

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