陳 濤，桂 青,2，郭俊陸，王正剛，陳福生,4*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南文昌571339；

3.山西老陳醋集團有限公司，山西太原030013；4.環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室，湖北武漢430070）

傳統(tǒng)工藝山西老陳醋發(fā)酵及熏蒸過程中常規(guī)成分的變化分析

陳 濤1，桂 青1,2，郭俊陸3，王正剛3，陳福生1,4*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南文昌571339；

3.山西老陳醋集團有限公司，山西太原030013；4.環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室，湖北武漢430070）

該研究分析了山西老陳醋在傳統(tǒng)工藝發(fā)酵過程中淀粉酶、糖化酶、酸性和中性蛋白酶酶活變化，并對發(fā)酵及熏蒸過程中淀粉、總糖、酒精度、總酸、有機酸和氨基酸等常規(guī)成分的變化規(guī)律與形成機理進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，酒精發(fā)酵階段，4種酶活力變化不大，醋酸發(fā)酵階段，4種酶活力均有所降低；發(fā)酵及熏蒸過程中淀粉含量由64.05%降至18.88%；酒精發(fā)酵階段，總糖含量從11.88%降至1.12%，醋酸發(fā)酵階段，總糖含量從2.28%增至7.35%，熏蒸階段，總糖含量從7.13%降至5.89%；酒精含量在酒精發(fā)酵過程中從1.3%vol增至5.7%vol，到發(fā)酵22 d時幾乎降為0；總酸含量在1～22 d內(nèi)從1.17%增至10.23%；在發(fā)酵及熏蒸過程中醋酸含量從1.03 mg/g增至76.25 mg/g；酒精發(fā)酵階段，乳酸含量從1.94 mg/g增至60.60 mg/g，隨后含量變化較小。

山西老陳醋；傳統(tǒng)工藝；常規(guī)成分；分析

山西老陳醋是我國傳統(tǒng)的四大名醋之一，其獨特生產(chǎn)工藝的確立已有300多年的歷史，被列為國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，產(chǎn)品具有有機酸組成豐富、氨基酸含量高、品質(zhì)和風(fēng)味優(yōu)良等特點[1]。山西老陳醋的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝，以高粱、麩皮為主要原料，以谷糠為輔料，以大麥、豌豆為原料制作的大曲作為糖化發(fā)酵劑，高粱、大曲、麩皮和谷糠的比例為100:62.5:70:100，生產(chǎn)工藝包括原料處理、拌曲、（糖化）酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、熏蒸（醋醅）、淋醋、陳釀等步驟[1]。整個生產(chǎn)過程，除淋醋和陳釀階段外，歷經(jīng)31 d，其中1～16 d為酒精發(fā)酵，17～25 d為醋酸發(fā)酵，26～31 d為熏蒸。其中熏蒸是傳統(tǒng)山西老陳醋生產(chǎn)中一道特有的工序，在這一過程中醋醅由黃色變?yōu)樯詈稚?，能增加醋的色澤和焦香味，對傳統(tǒng)山西老陳醋色、香、味的形成具有重要的作用[2]。

關(guān)于食醋生產(chǎn)過程中常規(guī)成分的變化分析已有很多報道[3-9]。但對山西老陳醋在發(fā)酵及熏蒸過程中常規(guī)成分的變化研究報道很少。本研究分析了山西老陳醋在發(fā)酵及熏蒸過程中糖化酶、淀粉酶和蛋白酶等酶活變化，并對發(fā)酵及熏蒸過程中淀粉、總糖、還原糖、酒精度、總酸、有機酸和氨基酸態(tài)氮等成分變化規(guī)律與形成機理進(jìn)行了分析。研究結(jié)果對山西老陳醋傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝的改良具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品均取自山西老陳醋集團有限公司傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)車間。在發(fā)酵的第1、3、5、8、11、14、16天（酒精發(fā)酵）采集酒醪樣品；第17天、19～25天（醋酸發(fā)酵）采集醋醅樣品；第27～31天（熏蒸階段）采集熏醅樣品。

NaOH、甲醇、冰醋酸、CHCl3、乙酸乙酯（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙酸、乳酸、檸檬酸（均為優(yōu)級純）：美國Sigma公司；蒽酮（分析純）：上海試劑一廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Z-5000型原子吸收分光光度計：日本日立株式會社；AF-610B型原子熒光分光光度計：北京瑞麗儀器有限公司；L-8000型全自動氨基酸分析儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；Waters 2695型高效液相色譜儀：美國Waters公司；HC-2062型高速離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉酶、糖化酶和蛋白酶活力的測定

淀粉酶活力的測定采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[10]，以1 g物料在40℃，pH 5.6的條件下，每1 min水解得到的還原糖的量為一個總淀粉酶活力單位（U/g）。糖化酶活力的測定參照GB8276—2006《食品添加劑糖化酶制劑》的方法進(jìn)行[11]，并略有改動，以1 g物料在40℃，pH 4.6的條件下，每1 h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖為一個糖化酶活力單位（U/g）。蛋白酶活力的測定參照國標(biāo)GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林比色法[12]，以1 g物料在40℃，pH 3.0或pH 7.2，每1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為一個酸性或中性蛋白酶活力單位（U/g）。

1.3.2 理化指標(biāo)的測定

水分含量的測定參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》中的105℃恒質(zhì)量法[13]；淀粉含量的測定參照GB/T 5514—2008《糧食、油料中淀粉含量測定》中酶水解法[14]；蛋白質(zhì)含量的測定參照GB5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的自動凱氏定氮儀法[15]；脂肪含量的測定參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》中索氏抽提法[16]；總糖的測定采用蒽酮比色法[17]；還原糖、總酸、氨基酸態(tài)氮的測定分別參照GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》中的菲林試劑法[18]、GB/T 5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中的酸堿滴定法[19]和GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》的甲醛滴定法[20]進(jìn)行；酒精度的測定采用酒精計法。

1.3.3 游離氨基酸的測定

游離氨基酸的測定參照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》的方法進(jìn)行[21]。酒醪、醋醅和熏醅樣品經(jīng)蒸餾水浸提后，過濾得到的溶液定容至250 mL，作為待測液。取1 mL待測液用6 mol/L的HCl稀釋一倍，過0.45 μm濾膜后，用于氨基酸自動分析儀測定樣品中的氨基酸含量。

1.3.4 有機酸的分析

有機酸的測定采用GB/T 5009.157—2003《食品中有機酸的測定》中的高效液相色譜法[22]。色譜條件：Spursil C18-EP色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：20 mmol/L的KH2PO4溶液（pH 2.5）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測器：紫外檢測器，檢測波長210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵階段淀粉酶、糖化酶和蛋白酶的活力變化

淀粉酶、糖化酶和蛋白酶是參與谷物食醋釀造的主要酶類，本實驗對酒精和醋酸發(fā)酵過程中這幾種酶的活力進(jìn)行了檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 傳統(tǒng)山西老陳醋發(fā)酵過程中淀粉酶、糖化酶和蛋白酶的活力變化曲線Fig.1 Variation curves of glucoamylase,amylase and protease activity during fermentation process of traditional Shanxi aged vinegar

由圖1可知，山西老陳醋在傳統(tǒng)工藝的酒精發(fā)酵（1～16 d）與醋酸發(fā)酵（17～25 d）過程中，淀粉酶和糖化酶的活力較高，最高分別為438.94 U/g和257.23 U/g，而酸性和中性蛋白酶活力較低，分別只有64.56 U/g和27.40 U/g。4種酶活在酒精和醋酸發(fā)酵階段略有變化但基本穩(wěn)定，且酒精發(fā)酵階段的酶活明顯高于醋酸發(fā)酵階段，這與醋酸發(fā)酵階段加入了麩皮和谷糠的稀釋作用有關(guān)，也可能與此階段大量產(chǎn)生醋酸有關(guān)。

2.2 發(fā)酵及熏蒸過程中的變化

對傳統(tǒng)山西老陳醋發(fā)酵及熏蒸過程中水分、淀粉、總糖、還原糖、酒精度、總酸、氨基態(tài)氮等的變化進(jìn)行了分析，結(jié)果見表1。

表1 傳統(tǒng)山西老陳醋發(fā)酵及熏蒸過程中理化指標(biāo)的分析Table 1 Analysis of physicochemical indexes during fermentation and fumigation process of traditional Shanxi aged vinegar

由表1可知，在酒精發(fā)酵階段（1～16 d），發(fā)酵醪水分含量基本穩(wěn)定在80%左右，淀粉含量從64.05%降至32.91%（干質(zhì)量），總糖含量從11.88%降至1.12%，還原糖含量從9.78%降至0.81%，而酒精度從1.3%vol上升至5.7%vol，總酸從1.17%上升至10.07%。在此階段，主要是大曲中的酶系（圖1）和酵母菌[23]起作用，淀粉被淀粉酶和糖化酶水解為單糖，單糖被酵母菌轉(zhuǎn)化為酒精。同時，由于大曲是自然發(fā)酵而成，除酶和酵母菌外還含有其他微生物，如乳酸菌[23]，所以在酒精發(fā)酵階段，部分糖和酒精可被乳酸菌和其他微生物轉(zhuǎn)化為酸，所以總酸含量一直增加。此外，在此階段，酸性蛋白酶的活力較強（圖1），蛋白質(zhì)水解為氨基酸，因此氨基酸態(tài)氮含量增加明顯。而脂肪含量的增加的原因，可能是原料中結(jié)合態(tài)的脂肪和脂溶性色素等，在淀粉和蛋白質(zhì)等大分子被分解后釋放出來。

在醋酸發(fā)酵階段（17～25 d），水分含量穩(wěn)定在62%～63%，淀粉由35.10%下降至27.48%（干質(zhì)量），總糖含量從2.28%增加至7.35%，還原糖含量從4.70%增加至8.54%，總酸在第22天達(dá)到最高，為10.23%。在此階段，淀粉酶和糖化酶仍有一定活力（圖1），可將淀粉繼續(xù)水解為糖，但醋酸菌是該階段的優(yōu)勢菌種，它能迅速氧化酒精生成乙酸，并降低pH值，抑制其它微生物生長，因此糖類物質(zhì)被利用較少，含量均略有增加。酒精在醋酸菌作用下迅速轉(zhuǎn)化為醋酸，至第22天已檢測不到；對應(yīng)地總酸含量在第22天達(dá)到最高不再增加。由于醋酸發(fā)酵階段蛋白酶的活力很低（圖1），所以蛋白質(zhì)和氨基酸態(tài)氮含量變化很小。

熏蒸（27～31 d）是一個加熱的過程，水分由于蒸發(fā)作用而明顯降低（64.2%～57.2%）；淀粉由于加熱和有機酸存在，由27.65%下降至18.88%（干質(zhì)量）；因美拉德反應(yīng)，還原糖和氨基酸含量分別由7.75%和0.41%下降至2.91%和0.28%；總糖略有減少，脂肪和蛋白質(zhì)含量基本不變，總酸含量增加，但不明顯。

2.3 發(fā)酵及熏蒸過程中氨基酸的變化

20種氨基酸在發(fā)酵及熏蒸過程中的含量變化見表2。

表2 傳統(tǒng)山西老陳醋發(fā)酵及熏蒸過程中氨基酸含量的變化Table 2 Variation of amino acid contents during fermentation and fumigation process of traditional Shanxi aged vinegar mg/100 g

續(xù)表2

由表2可知，在傳統(tǒng)山西老陳醋的在酒精與醋酸發(fā)酵以及熏蒸過程中能檢測到至少20種氨基酸，包括人體必需的8種氨基酸，各種氨基酸含量的變化趨勢大致可以歸納為：酒精發(fā)酵過程中有不同程度的增加，醋酸發(fā)酵過程中變化不大，熏蒸階段有不同程度的降低。

結(jié)合圖1的結(jié)果，在酒精發(fā)酵階段氨基酸的增加主要是蛋白酶分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的，所以除賴氨酸、組氨酸和鳥氨酸外，其他氨基酸含量均有所增加。而賴氨酸、組氨酸和鳥氨酸含量減少，主要是這些氨基酸在高粱等谷物蛋白中總量較少[24]，同時參與微生物（如酵母菌）菌體生長代謝所致。在醋酸發(fā)酵過程中，蛋白酶活力降低，而氨基酸仍需參與微生物（如醋酸菌）菌體的生長代謝，因此，含量較高的氨基酸變化較小，含量較低的氨基酸（如賴氨酸）顯著降低。在熏蒸過程中，由于氨基酸和還原糖的美拉德反應(yīng)，因此，各種氨基酸的含量均有所降低。

2.4 發(fā)酵及熏蒸過程中有機酸的變化分析

酸味物質(zhì)是食醋中的主要組成成分，有機酸是酸味的主要來源，其種類、含量及其相互比例與食醋的質(zhì)量密切相關(guān)[25]。本實驗采用師晶晶[5]建立的山西老陳醋中有機酸的分析方法，對傳統(tǒng)山西老陳醋發(fā)酵及熏蒸過程中醋酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、丙酸、檸檬酸和琥珀酸等有機酸進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，醋酸和乳酸是傳統(tǒng)山西老陳醋生產(chǎn)過程中含量變化最大的兩種有機酸。在酒精發(fā)酵過程中，乳酸是主要的有機酸，醋酸含量在酒精發(fā)酵初期也有所增加（見圖2）。醋酸發(fā)酵前期，醋酸含量增加明顯，后期（22～25 d）基本保持不變，從工藝改良的角度出發(fā)，醋酸發(fā)酵的時間可縮短到第22天，總發(fā)酵時間可縮短4 d。由于酒精發(fā)酵的4～16 d主要是厭氧發(fā)酵，因此乳酸菌能產(chǎn)生大量乳酸。這與吳佳佳[23]從山西老陳醋的發(fā)酵酒醪中分離到了很多乳酸菌，并隨著酒精發(fā)酵時間延長，乳酸菌的種類增多的結(jié)果相吻合。在醋酸發(fā)酵階段，由于麩皮、谷糠添加的稀釋作用，在初期（17 d）醋酸和乳酸含量迅速降低，但由于醋酸菌的接入和通氣量的增加，酒精轉(zhuǎn)化成醋酸，使醋酸的含量快速上升，成為最主要的有機酸（見圖2）。而在熏蒸階段醋酸和乳酸的含量均略有升高。

圖2 傳統(tǒng)山西老陳醋發(fā)酵及熏蒸過程中有機酸的變化Fig.2 Variation of organic acids during fermentation and fumigation process of traditional Shanxi aged vinegar

酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等有機酸，在整個生產(chǎn)過程中，基本呈現(xiàn)先升高，后降低，再升高的趨勢（見圖2）。在醋酸發(fā)酵和熏蒸過程中，酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸的含量增加，這可能與微生物的發(fā)酵和熏蒸過程中水分的蒸發(fā)有關(guān)。丙酸在第3天時含量達(dá)到10.47 mg/g，隨后降低；第17天向酒醪中添加麩皮和谷糠，丙酸含量明顯升高，這可能是因為填充料帶入了一部分丙酸造成的；但第19天其含量突然降低，具體原因仍需進(jìn)一步探討，在熏蒸過程中，丙酸的含量降低。圖2的結(jié)果與表1中總酸的變化趨勢一致。

3 結(jié)論

酒精發(fā)酵階段，淀粉酶、糖化酶、酸性和中性蛋白酶的活力雖然呈現(xiàn)出高-低-高的趨勢，但基本穩(wěn)定。在山西老陳醋的傳統(tǒng)工藝中，曲的用量非常大（高粱與大曲質(zhì)量比為100∶62.5），大曲除了是微生物（霉菌、酵母菌、醋酸菌等）的載體外，也是酶制劑，曲中淀粉酶等水解酶迅速分解淀粉變成糖，總糖和還原糖也在酒精發(fā)酵階段的第1天最高。所以酒精發(fā)酵階段的水解酶主要來自大曲，后期酶活稍有升高，可能是霉菌等微生物生長產(chǎn)生的。在醋酸發(fā)酵階段，由于添加了麩皮和谷糠，酒醪被稀釋，同時醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸，pH降低，酶活受到抑制，因此，各水解酶的活力均有所降低。

由于酵母等微生物生長代謝，總糖、還原糖含量在酒精發(fā)酵階段不斷降低；而在醋酸發(fā)酵階段略有增加的原因，可能是在此階段糖化酶和淀粉酶仍具有一定的活性，可繼續(xù)水解淀粉產(chǎn)生寡糖和單糖，而醋酸菌等微生物較少利用它們；在熏蒸階段又降低，由于還原糖和氨基酸在加熱的情況下，易發(fā)生美拉德反應(yīng)，消耗了糖類。酒精含量在酒精發(fā)酵的第1～11天上升，在酒精發(fā)酵后期（14～16 d）保持穩(wěn)定，在醋酸發(fā)酵第4天時檢測不出，酒精發(fā)酵的時間可縮短2 d?？偹岷繌牡?～22天增加，而從第23～31天其含量變化不明顯。

氨基酸在酒精發(fā)酵過程中含量明顯增加，此階段蛋白酶的活力較強，能分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生小分子肽和游離氨基酸；氨基酸含量在醋酸發(fā)酵過程中變化較小，此階段蛋白酶活力顯著降低，能少量分解蛋白質(zhì)生成氨基酸；熏蒸過程中氨基酸含量有不同程度的降低，由于氨基酸和還原糖在加熱的條件下易發(fā)生美拉德反應(yīng)，消耗了氨基酸。

醋酸是山西老陳醋中的主要成分，在醋酸發(fā)酵前期和熏蒸過程中含量明顯增加，在醋酸發(fā)酵后期（22～25 d）基本保持不變，醋酸發(fā)酵的時間可縮短到第22天，總發(fā)酵時間可縮短6 d。乳酸主要在酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生，在醋酸發(fā)酵和熏蒸過程中變化較小。其他有機酸在發(fā)酵及熏蒸過程中含量較低，變化較小。

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Changes of common conventional components in traditional process of Shanxi aged vinegar during fermentation and fumigation

CHEN Tao1,GUI Qing1,2,GUO Junlu3,WANG Zhenggang3,CHEN Fusheng1,4*(1.College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China;2.Coconut Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Science,Wenchang 571339,China;3.Shanxi Mature Vinegar Group Co.,Ltd.,Taiyuan 030013, China;4.Key Laboratory of Environment Correlative Dietology,Ministry of Education,Wuhan 430070,China)

The changes of amylase,glucoamylase,acid protease and neutral protease activities during traditional fermentation process of Shanxi aged vinegar were analyzed,and the change rules and formation mechanism of conventional compositions including starch,total sugar,alcohol content,total acid,organic acid and amino nitrogen acid and other conventional compositions during fermentation and fumigation process were discussed.The results showed that during alcoholic fermentation process,activities of 4 kinds of enzyme changed little.During acetic fermentation process,activities of 4 kinds of enzymes reduced.During fermentation and fumigation process,starch contents reduced from 64.05%to 18.88%.In alcoholic fermentation process,total sugar contents reduced from 11.88%to 1.12%;in acetic acid fermentation process,it increased from 2.28%to 7.35%,however,in fumigation process,it reduced from 7.13%to 5.89%.In alcoholic fermentation process,alcohol contents increased from 1.3%vol to 5.7%vol,but it almost decreased to 0 on the 22 d.From the 1st to the 22nd day,the contents of total acid increased from 1.17%to 10.23%;acetic acid contents increased obviously from 1.03 mg/g to 76.25 mg/g.In alcoholic fermentation process,the lactic acid contents increased from 1.94 mg/g to 60.60 mg/g, but it changed slightly after alcoholic fermentation.

Shanxi aged vinegar;traditional process;conventional compositions;analysis

TS264

0254-5071（2017）01-0039-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.008

2016-08-11

科技部國際科技合作與交流專項（2014DFG32380）；武漢市國際科技合作計劃（2015030809020368）；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)自主科技創(chuàng)新基金項目（2662014PY034）

陳濤（1979-），男，講師，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。

*通訊作者：陳福生（1965-），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)與安全。