王蔭蔭，王 苗，錢聲艷，呂玉紅，保玉心，胡永林，岳昌武*

（1.遵義市第一人民醫(yī)院遵義市基因遺傳病精準(zhǔn)診斷及藥物靶向治療重點實驗室，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院中心實驗室，貴州遵義563003；3.遵義醫(yī)學(xué)院微生物資源及藥物開發(fā)特色重點實驗室，貴州遵義563003；4.遵義醫(yī)學(xué)院檢驗系，貴州遵義563003）

鏈霉菌Streptomycessp.FJS31-2產(chǎn)鹵化二型聚酮類化合物的發(fā)酵條件優(yōu)化

王蔭蔭1,2,3，王 苗3，錢聲艷3，呂玉紅3，保玉心3，胡永林4，岳昌武1,2,3*

（1.遵義市第一人民醫(yī)院遵義市基因遺傳病精準(zhǔn)診斷及藥物靶向治療重點實驗室，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院中心實驗室，貴州遵義563003；3.遵義醫(yī)學(xué)院微生物資源及藥物開發(fā)特色重點實驗室，貴州遵義563003；4.遵義醫(yī)學(xué)院檢驗系，貴州遵義563003）

以產(chǎn)zunyimycin A及BE-24566B類鹵化天然化合物的Streptomycessp.FJS31-2為研究對象，分別利用高分辨質(zhì)譜（HRMS）和高效液相色譜（HPLC）為檢測手段，對不同的碳源、氮源組合的培養(yǎng)基在不同的培養(yǎng)時間和萃取條件下獲得的目標(biāo)化合物進(jìn)行定性和產(chǎn)量的分析。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)添加10 g/L無水乙醇浸泡24 h后的腐殖酸，培養(yǎng)17 d，采取乙酸乙酯萃取可以使目標(biāo)化合物產(chǎn)量提高。

鏈霉菌；zunyimycin A；發(fā)酵條件；優(yōu)化

人們已分離到約4 500個結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的天然鹵化物，對于大部分微生物天然產(chǎn)物而言，鹵化后其生物活性會發(fā)生很大的改變，往往具有較好的生物活性和臨床應(yīng)用潛力[1-2]，如土壤鏈霉菌來源的鹵化產(chǎn)物BE-19412A及其甲基化修飾后的BE-19412B都表現(xiàn)出很好的抗腫瘤活性[3]。目前臨床應(yīng)用的絕大部分鹵化抗生素都是來自微生物或其骨架經(jīng)人工修飾的半合成產(chǎn)物，且化合物主骨架上鹵化取代位置及取代基的種類和數(shù)目對抗生素的生物活性有不同程度的影響[4-5]。目前臨床廣泛使用的鹵化抗生素大部分是微生物天然產(chǎn)物或其人工修飾的半合成天然產(chǎn)物，近年來新開發(fā)的抗生素中，鹵化天然產(chǎn)物依然占據(jù)重要地位，如2014年美國食品和藥物管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)上市的用于治療耐藥菌感染的4種新型抗生素中達(dá)巴萬星（dalbavancin）、奧利萬星（oritavanci）、磷酸泰地唑胺（tedizolid）3種抗生素為鹵化物[6]。隨著在普通生境分離的放線菌中發(fā)現(xiàn)新鹵化抗生素越來越困難，人們開始把目光轉(zhuǎn)向特殊生境或典型生境，并在沙漠、海洋、植物內(nèi)生菌等特殊生境中發(fā)現(xiàn)了新鹵化活性天然產(chǎn)物[7-9]。目前已在不同來源的鏈霉菌中分離到的二型聚酮類化合物Anthrabenzoxocinones家族成員見圖1。Anthrabenzoxcinone家族成員主要包括（+）-anthrabenzoxocinone（又名（+）-ABX、BE-24566B26或1.264C等）以及其結(jié)構(gòu)類似物(-)-anthrabenzoxocinone（-）-ABX，1a)、（-）-bischloroanthrabenzoxocinone（（-）-BABX，1b）和zunyimycin等[10-12]。其中，zuunyimycin A為本課題組首次從鏈霉菌Stre-ptomycessp.FJS31-2發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得的一個新鹵化二型聚酮化合物，受限于該菌在原始培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)率較低，zunyimycin A和BE-24566B及衍生物的活性分析和活性分子機制的解析進(jìn)展緩慢。

圖1 zunyimycin A及結(jié)構(gòu)類似物Fig.1 Zunyimycins and its structural analogue A

本研究通過優(yōu)化Streptomycessp.FJS31-2發(fā)酵培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)時間等條件，提高zunyimycin類化合物的產(chǎn)量，為其后續(xù)研究以及相關(guān)鏈霉菌天然產(chǎn)物的開發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)積累。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

鏈霉菌Streptomycessp.FJS31-2：由本實驗室分離自貴州梵凈山土壤（海拔高度800 m,東經(jīng)108°47′50″，北緯27°56′32″），保存于中國普通菌種保存中心（菌株號CGMCC4.7321），該菌已由本課題組進(jìn)行基因組測序（no.PRJNA320463）。

1.1.2 主要試劑

甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；甲醇、乙腈（均為色譜純）：邁瑞達(dá)（北京）公司；微量元素預(yù)混液：ZnSO4·7H2O 2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 2 g，MnCl2·4H2O 2 g，CuSO4·5H2O 2 g，Na2B4O7·10H2O 2 g，（NH4)6MO7O24·4H2O 2 g，定容至1 000 mL；腐殖酸A為雙蒸水浸泡24 h過濾取濾液，腐殖酸B為無水乙醇浸泡24 h過濾取濾液。

1.1.3 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：碳酸鈣2 g/L，葡萄糖4 g/L，麥芽抽提物10 g/L，酵母粉4 g/L，瓊脂粉18 g/L（液體培養(yǎng)基不含瓊脂粉），微量元素預(yù)混液0.05%，天然pH值，雙蒸水定容至1 L，分裝于250 mL（裝100 mL）或500 mL三角瓶（裝200 mL），121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Winpat-WP-30L自動滅菌發(fā)酵罐：美國Major Science公司；STRIKE300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：意大利Steroglass公司；LC-20A高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：日本島津公司；JJ-CJ-2FD雙人超凈臺：蘇州市金凈凈化設(shè)備有限公司；BSP-400生化培養(yǎng)箱、YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業(yè)有限公司；Milli-Q Reference超純水機：德國Merck Millipore公司；DZ-900雙層大容量落地式振蕩器：蘇州培英實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

菌種活化：取出斜面保存的Strepotomycessp.FJS31-2菌種，接種環(huán)刮取菌體接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，挑取單菌落培養(yǎng)至第三代可放大培養(yǎng)。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

課題組前期對培養(yǎng)基種類進(jìn)行篩選，確定出基礎(chǔ)培養(yǎng)基所產(chǎn)目標(biāo)化合物比較穩(wěn)定但含量較低。在此基礎(chǔ)上，試通過調(diào)整碳源、氮源比例及添加腐殖酸提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。設(shè)計23種培養(yǎng)基（見表1）用于Strepotomyces.sp. FJS31-2發(fā)酵條件優(yōu)化，每種培養(yǎng)基發(fā)酵400 mL，在接種量相同相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)15 d，乙酸乙酯等體積搖床萃取2次、140 r/min振蕩12 h，HPLC檢測發(fā)酵產(chǎn)物中目標(biāo)化合物紫外吸收峰值及峰面積，并與10號基礎(chǔ)培養(yǎng)基做對照，比較不同培養(yǎng)基對化合物產(chǎn)量的影響。

表1 23種發(fā)酵培養(yǎng)基的組分Table 1 Components of 23 kinds of fermentation media g/L

1.3.3 培養(yǎng)時間優(yōu)化

菌體培養(yǎng)至7 d、9 d、11 d、13 d、15 d、17 d、19 d、21 d，200 mL乙酸乙酯等體積搖床萃取2次，140 r/min振蕩12 h，HPLC檢測zunyimycin A峰面積變化，確定最佳培養(yǎng)時間。

1.3.4 萃取劑優(yōu)化

采用極性由小到大的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇等體積萃取200 mL，HPLC檢測目標(biāo)化合物比較峰面積的大小考察萃取劑對產(chǎn)物的影響。

1.3.5 發(fā)酵產(chǎn)物定性[13-14]

菌株FJS31-2抽提物37℃旋蒸得浸膏，取1 mg浸膏用3 mL色譜甲醇溶解，微孔濾膜過濾，設(shè)定HPLC進(jìn)樣體積統(tǒng)一為10 μL，根據(jù)化合物在HPLC上的出峰時間、峰型峰值與HRMS對比進(jìn)行定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組分對zunyimycin A和BE-24566B類化合物產(chǎn)量的影響

通過改變培養(yǎng)基成分，根據(jù)HPLC檢測目標(biāo)化合物吸收峰面積的大小，比較發(fā)酵產(chǎn)物的變化，結(jié)果見圖2。

圖2 培養(yǎng)基組成對鹵化二型聚酮類化合物發(fā)酵產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of medium components on the fermentation yields of halogenated typeⅡpolyketides

由圖2可知，當(dāng)酵母粉含量高時可提高BE-24566B的產(chǎn)量，酵母粉含量＜4 g/L時不利于化合物產(chǎn)生，酵母粉可作為該化合物發(fā)酵的最佳有機氮源；而葡萄糖作為碳源對次級代謝產(chǎn)物的影響不及氮源的重要，當(dāng)葡萄糖含量為4 g/L而酵母粉被硝酸銨或甘露醇代替時，化合物產(chǎn)量仍較低；碳源氮源以一定的比例添加體積分?jǐn)?shù)1%乙醇浸泡過的腐殖酸，可提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，原始培養(yǎng)基BE-24566B產(chǎn)生峰面積為200，優(yōu)化后峰面積達(dá)525，zunyimycin A峰面積由原來52提高至250，并優(yōu)化出BE-24566B-1Cl化合物，所以將22號作為該菌發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基。HPLC檢測次級代謝產(chǎn)物存在BE-24566B、一氯取代衍生物（BE-24566B-Cl），發(fā)酵液的質(zhì)譜信息中證實此化合物紫外吸收峰，zunyimycin A是鹵化二型聚酮類二氯取代衍生物，三者之間基本母核相同僅取代基不同，推測發(fā)酵過程中三者是一個動態(tài)相互轉(zhuǎn)化的過程[15]。

2.2 培養(yǎng)時間對zunyimycin A和BE-24566B類化合物產(chǎn)量的影響

菌株FJS31-2產(chǎn)生的鹵化二型聚酮類化合物在生物體內(nèi)是相互轉(zhuǎn)化的過程，對此菌株而言培養(yǎng)時間是一個重要的影響因素，因此本次試驗從發(fā)酵的第10天開始至第20天結(jié)束，每天以200 mL等體積萃取的分析方法考察培養(yǎng)時間的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 培養(yǎng)時間對鹵化二型聚酮類化合物發(fā)酵產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the yield of halogenated typeⅡpolyketides

由圖3可知，BE-24566B及其氯代衍生物在發(fā)酵至17 d時含量最高，以BE-24566B為主。在7 d同時檢測到3種化合物，繼續(xù)培養(yǎng)至11 d時含量均發(fā)生較大改變；17 d后迅速下降，21 d時BE-24566B-1Cl降至為0，可推測一、二氯取代的衍生物受菌體內(nèi)部環(huán)境影響較大不穩(wěn)定，因此將發(fā)酵17 d為該菌培養(yǎng)的最佳時間。

2.3 萃取劑對zunyimycin A和BE-24566B類化合物產(chǎn)量的影響

zunyimycin A和BE-24566B及BE-24566B-1Cl化合物母核結(jié)構(gòu)相同，而氯原子取代的位置不同將會影響到化合物的極性，不同極性的溶劑萃取的產(chǎn)物將有差別。實驗選取不同極性溶劑對發(fā)酵產(chǎn)物等體積萃取，通過HPLC檢測目標(biāo)產(chǎn)物峰面積的變化，結(jié)果見圖4。

圖4 萃取劑對鹵化二型聚酮類化合物發(fā)酵產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of extraction agent on the yield of halogenated typeⅡpolyketides

由圖4可知，以乙酸乙酯作為萃取時得到的目標(biāo)化合物含量較高，因此選擇乙酸乙酯劑作為萃取劑。

3 結(jié)論

實驗通過改變培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)方式及發(fā)酵產(chǎn)物萃取溶劑的選擇等因素，對鏈霉菌（Streptomycessp.）FJS31-2發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，可以得出較優(yōu)培養(yǎng)基組成為基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)添加10 g/L無水乙醇浸泡24 h后的腐殖酸，培養(yǎng)17 d，采取乙酸乙酯萃取可以使目標(biāo)化合物產(chǎn)量提高。固體培養(yǎng)除周期長，操作繁瑣，影響發(fā)酵的因素難以檢測外，目標(biāo)化合物的產(chǎn)量要高于液體培養(yǎng)；液體發(fā)酵方式可以縮短發(fā)酵周期、對發(fā)酵影響因素可以實現(xiàn)在線考察，降低勞動力等優(yōu)點，但產(chǎn)生目標(biāo)化合物種類和含量都較低，后續(xù)實驗還需進(jìn)一步優(yōu)化液體發(fā)酵條件，使目標(biāo)化合物產(chǎn)量及效率得以進(jìn)一步提升。

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Optimization of fermentation conditions for halogenated type II polyketides production from Streptomycessp.FJS31-2

WANG Yinyin1,2,3,WANG Miao3,QIAN Shengyan3,L Yuhong3,BAO Yuxin3,HU Yonglin4,YUE Changwu1,2,3*(1.Zunyi Key Laboratory of Genetic Diagnosis&Targeted Drug Therapy,The First People's Hospital of Zunyi City,Zunyi 563003,China; 2.The Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi 563003,China;3.Guizhou Key Laboratory of Microbial Resources& Drug Development,Zunyi Medical University,Zunyi 563003,China;4.Department of Clinical Laboratory Medicine,Zunyi Medical University, Zunyi 563003,China)

TakingStreptomycessp.FJS31-2 which produces zunyimycin A and BE-24566B halogenated natural compound as research object,the target compound obtained from the fermentation medium with different carbon and nitrogen sources at different culture time and extraction conditions were qualitatively and quantitatively analyzed by high resolution mass spectrum(HRMS)and high performance liquid chromatography(HPLC).Results showed when adding humic acid which soaked in the basic medium with 10 g/L absolute ethyl alcohol for 24 h,the target compound yield could be improved by ethyl acetate extraction at 17 d.

Streptomycetessp.;zunyimycin A;fermentation conditions;optimization

Q93-3

0254-5071（2017）01-0066-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.013

2016-07-25

國家自然科學(xué)基金(31160004，31460006)；貴州省科技學(xué)技術(shù)基金項目(黔科合J字[2010]2156，黔科合J字[2012]2348，黔科合SY字[2013]3013)

王蔭蔭（1989-），女，碩士研究生，研究方向微生物與天然產(chǎn)物資源開發(fā)。

*通訊作者：岳昌武(1975-)，男，教授，博士，研究方向為微生物天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)與生物合成。