季 彬，祁宏山，王治業(yè)*，杜軍國，曾 楊，陳 娟，祝 英

（甘肅省科學院生物研究所，甘肅蘭州730000）

微生物促生劑發(fā)酵玉米皮生產飼料蛋白研究

季 彬，祁宏山，王治業(yè)*，杜軍國，曾 楊，陳 娟，祝 英

（甘肅省科學院生物研究所，甘肅蘭州730000）

以玉米皮為基本碳源，通過單因素和正交試驗，以產朊假絲酵母、啤酒酵母和白地霉聯(lián)合固態(tài)發(fā)酵生產蛋白飼料進行了研究。以提高真蛋白含量為主要目的，優(yōu)化得到最佳的發(fā)酵條件為菌液接種量7%，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基料水比1:1.8（g:mL），發(fā)酵溫度31℃，發(fā)酵時間80 h。在此條件下，真蛋白含量可達15.6%，是發(fā)酵前的1.94倍。

玉米皮；固態(tài)發(fā)酵；飼料蛋白

我國優(yōu)質飼料資源短缺，一直以來都制約著畜牧業(yè)的長效發(fā)展[1-3]。玉米皮是玉米籽粒的表皮部分，也稱作玉米纖維或玉米渣，是玉米加工淀粉后的副產物，通常在濕法[4]加工淀粉的過程中被分離出來。玉米皮富含淀粉和纖維素[5]，還有少量的植物蛋白，傳統(tǒng)的使用方法是直接用來飼喂牛羊，但因其適口性差，牛羊等采食率低，飼喂效果不好。利用微生物發(fā)酵[6-7]的方法，可將玉米皮中的淀粉、纖維類物質直接轉化為牛羊易采食的單細胞蛋白。目前，相關研究[8-9]多采用將不同飼料化菌株分別接入玉米皮，然后再利用固態(tài)混合發(fā)酵的方式生產單細胞蛋白飼料，但這種方法在工業(yè)化生產中一是由于不同菌株間可能存在的競爭、協(xié)同關系，菌株間的配比往往不能反映飼料化過程中各菌株間真實的相互關系，增蛋白效果有限；二是多次接種增加了工作量，也增加了雜菌污染的機會。針對于此，本試驗采用將飼料化菌株經細胞固定化后接種至玉米皮糖化醪中反復培養(yǎng)，待其菌群結構穩(wěn)定后再將菌液一次性接入玉米皮后固態(tài)發(fā)酵。由于菌液中各菌株的配比已經玉米皮水解液的反復優(yōu)化，呈穩(wěn)定的狀態(tài)，在接入玉米皮后可在較短時間內迅速進入飼料化發(fā)酵，其最佳的菌株配比也更能高產單細胞蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

白地霉（GeotrichumcandidumLink）、產朊假絲酵母（Candida utilis）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeHansen）：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心甘肅分中心提供。

1.1.2 材料

聚乙烯醇復合凝膠[10]：蘭州凱奇生物工程有限責任公司提供。

玉米皮：甘肅張掖昆侖生化有限責任公司提供。將玉米皮粉碎后過40目篩，加入相當于干料總量1%的營養(yǎng)鹽液（0.05%硫酸銨，0.027%磷酸二氫鉀，硫酸鎂0.02%，水1000mL），含水量控制在60%左右，于121℃滅菌處理25min。

1.1.3 培養(yǎng)基

白地霉培養(yǎng)基：馬鈴薯200g去皮，切成小塊，加水煮沸20min后用紗布過濾，濾液加葡萄糖20g，定容至1000mL，pH值自然，冷卻后待用。固體培養(yǎng)基加瓊脂16 g。

酵母種子培養(yǎng)基：蛋白胨8 g，牛肉膏5 g，酵母粉3 g，葡萄糖10 g，七水硫酸鎂0.5 g，水1 000 mL。

固定化細胞培養(yǎng)基[11]：白地霉菌液體培養(yǎng)基與玉米糖化醪1∶1混合，其中玉米糖化醪的制作方法：將玉米粉碎并過40目篩，與水以1:4.5的比例混合并加熱，待溫度為40℃，開始加入所需酶量一半的淀粉酶（淀粉酶按12 U/g玉米粉稱?。?，保溫30 min，后繼續(xù)加熱至90℃，加入剩余的淀粉酶，并加熱至沸25 min，后開始冷卻，待溫度為62～64℃時加入糖化酶（糖化酶按200 U/g玉米粉稱?。⒈?0 min后降溫至28～30℃。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；MJ-160型霉菌培養(yǎng)箱：上海恒躍醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 酵母菌共固定化方法

將待固定的酵母菌種分別經種子培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)后，待菌懸液中酵母細胞數(shù)達到1.2×108CFU/mL以上時，將產朊假絲酵母、啤酒酵母菌懸液以1:1的體積比混合，然后以2:8的體積比與聚乙烯醇凝膠混合，攪拌均勻后置于低溫冷凍箱中固化48 h，解凍后切成4 cm×4 cm×4 cm的切塊備用。

1.3.3 共固定化細胞增殖培養(yǎng)[12]

將備用的固定化細胞切塊加入固定化增殖培養(yǎng)基中，在28℃條件下增殖18 h，增殖罐攪拌轉速為90 r/min。

將固定化酵母增殖液與白地霉菌培養(yǎng)液以1∶1的比例混合[13]后，接種在蒸煮好的玉米皮中，在一定培養(yǎng)條件下發(fā)酵。

1.3.4 玉米皮固態(tài)發(fā)酵試驗[14-16]

①單因素試驗

試驗以玉米皮為基本碳源，添加營養(yǎng)鹽液后控制料水比，經蒸煮滅菌處理后接種培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條件為玉米皮200 g，料水比1∶2（g∶mL），接種量10%，30℃培養(yǎng)72 h，考察不同接種量（5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%）、基質料水比（1∶1.0、1∶1.4、1∶1.8、1∶2.2、1∶2.6、1∶3.0（g∶mL））、發(fā)酵溫度（25℃、28℃、31℃、34℃、37℃）和培養(yǎng)時間（48 h、64 h、72h、80h、90h）對玉米皮飼料化發(fā)酵產真蛋白量的影響。

②正交試驗

在單因素試驗基礎上，選取接種量、培養(yǎng)基料水比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間4個因素，取3水平設計試驗，發(fā)酵終了時測定真蛋白含量，并且利用軟件對試驗結果進行極差分析。正交試驗因素與水平見表1。

表1 玉米皮發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for corn bran culture conditions optimization

1.3.5 真蛋白含量測定[17]

用電子天平精確稱取發(fā)酵后產物0.5 g放置于100 mL燒杯中，加入30 mL蒸餾水用玻璃棒攪拌均勻，再煮沸依次加入10%硫酸銅水溶液20 mL和2.5%氫氧化鈉溶液20 mL，邊加邊攪拌，加完后繼續(xù)攪拌幾分鐘。放置2 h，沉淀物用濾紙過濾，并用70℃以上熱蒸餾水反復洗滌沉淀，直至濾液無沉淀為止（用氯化鋇試驗檢驗）。最后將濾紙和沉淀物包好，65～70℃烘箱干燥。用凱氏定氮法測定樣品中真蛋白含量，同時作空白對照。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料水比對玉米皮飼料化發(fā)酵產真蛋白的影響

固態(tài)發(fā)酵不同于液態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵中合理控制發(fā)酵基質中水分的含量，有利于微生物進行細胞運動、生長、細胞內外營養(yǎng)物質交換。料水比對真蛋白含量的影響見圖1。

圖1 料水比對玉米皮產真蛋白含量的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on true protein content from corn bean

由圖1可以看出，真蛋白含量隨料水比的增加呈先增大后減小的趨勢，當料水比為1∶1.8（g∶mL）時，飼料化發(fā)酵后玉米皮真蛋白含量達最大值，為14.3%。原因可能是低水分發(fā)酵時，底物中的營養(yǎng)物沒有足夠的自由水將其擴散到底物表面，菌株生長繁殖的營養(yǎng)物質供給不足，真蛋白增量不足；高水分發(fā)酵時，底物顆粒間沒有足夠的孔隙率，供氧不足，菌株生長受限，真蛋白增量有限。因此選擇料水比為1∶1.8（g∶mL）進行后續(xù)試驗。

2.1.2 接種量對玉米皮飼料化發(fā)酵產真蛋白的影響

接種量對真蛋白含量的影響見圖2。由圖2可知，真蛋白含量隨接種量的增加呈先快速后緩慢增大的趨勢，當接種量為7.5%時，飼料化發(fā)酵后玉米皮中真蛋白含量可達9.7%，之后隨著接種量的增加，真蛋白含量增量較小，考慮到菌液生產成本，控制接種量在7.5%較為合適。接種量大可以縮短發(fā)酵過程中菌株細胞數(shù)達到峰值的時間，提早形成發(fā)酵終產物。這是因為種子液中含有胞外水解酶類，接種量大，酶量也多，有利于對固態(tài)基質中營養(yǎng)物質的分解和利用，同時菌體量多，占有絕對生長優(yōu)勢，可以相對減少雜菌污染和生長的機會。但接種量過大，也會造成菌體前期生長過速，后期由于基質中菌體代謝產物堆積和營養(yǎng)物質消耗殆盡，導致菌體早衰，從而影響產物的合成。因此，選擇接種量為7.5%進行后續(xù)試驗。

圖2 接種量對玉米皮產真蛋白含量的影響Fig.2 Effects of inoculum on true protein content from corn bran

2.1.3 發(fā)酵溫度對玉米皮飼料化發(fā)酵產真蛋白的影響

溫度對發(fā)酵的影響及其調節(jié)控制是影響微生物生長繁殖最重要的因素之一，其主要表現(xiàn)在對細胞生長、產物合成和培養(yǎng)基質物理性質的改變等方面。據(jù)此，控制適當?shù)陌l(fā)酵溫度，使生產菌種處于產物合成最佳的溫度下生長，才能得到優(yōu)質高產的效果。發(fā)酵溫度對真蛋白含量的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對玉米皮產真蛋白含量的影響Fig.3 Effects of the fermentation temperature on true protein content from corn bran

由圖3可知，真蛋白含量隨發(fā)酵溫度的升高呈先增大后減小的趨勢，當混合菌液在31℃發(fā)酵玉米皮時，發(fā)酵后得成熟物料中真蛋白含量最高為14.5%，之后，隨著溫度的上升，真蛋白含量有所下降。因此，選擇發(fā)酵溫度為31℃進行后續(xù)試驗。

2.1.4 發(fā)酵時間對玉米皮飼料化發(fā)酵產真蛋白的影響

真蛋白含量是評價玉米皮飼料化發(fā)酵效果的重要指標，而微生物的生長要經過停滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰退期四個階段，微生物發(fā)酵產物的總量隨著微生物的生長階段的改變而改變。發(fā)酵時間對真蛋白含量的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對玉米皮產真蛋白含量的影響Fig.4 Effects of the fermentation time on true protein content from corn bran

由圖4可知，真蛋白含量隨發(fā)酵時間的延長呈先增大后減小的趨勢，玉米皮飼料化發(fā)酵80 h時，真蛋白含量可達峰值為14.8%，之后隨著發(fā)酵時間的延長有所減低，分析認為是由于微生物自身分解代謝所致。因此，選擇發(fā)酵時間為80 h進行后續(xù)試驗。

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，選取接種量、培養(yǎng)基料水比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間4因素，分別設3個水平，用正交表L9（34）設計試驗，研究各因素對玉米皮飼料化發(fā)酵的影響，試驗結果與分析見表2。

表2 玉米皮發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for corn bran fermentation conditions optimization

由表2可知，直觀分析得出最佳水平組合為A1B2C2D2，即菌種接種量7%，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基料水比1∶1.8（g∶mL），發(fā)酵溫度31℃，發(fā)酵時間80 h。在此條件下，真蛋白含量為15.6%，是發(fā)酵前的1.94倍。4種因素對真蛋白產量影響依次為培養(yǎng)基料水比＞發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時間，即培養(yǎng)基含水量和發(fā)酵溫度是影響玉米皮飼料化發(fā)酵的主要因素，其他影響較小。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test result

由方差分析（表3）可知，培養(yǎng)基料水比、發(fā)酵時間F比＞F0.05（2,2），故其對玉米皮飼料化發(fā)酵產真蛋白十分顯著（P＜0.05）；接種量、發(fā)酵溫度F比＜F0.05（2,2），故其對玉米皮飼料化發(fā)酵產真蛋白的影響不顯著（P＞0.05）。

3 結論

本試驗中玉米皮經蒸煮滅菌處理后，接種經細胞固定化后制得的產朊假絲酵母、啤酒酵母、白地霉菌液優(yōu)化菌液，固態(tài)發(fā)酵后制取單細胞蛋白飼料。試驗結果表明，將菌液接種量控制在7%，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基料水比1∶1.8（g∶mL），發(fā)酵溫度31℃，發(fā)酵80 h時，真蛋白含量可達15.6%，是發(fā)酵前的1.94倍。本研究由于優(yōu)化了發(fā)酵菌液，發(fā)酵后玉米皮真蛋白含量要高于現(xiàn)有的研究水平，顯示了其優(yōu)越性，具有一定的工業(yè)應用潛力。

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Feed protein production from corn bran with microbial fermentation promoters

JI Bin,QI Hongshan,WANG Zhiye*,DU Junguo,ZENG yang,CHEN Juan,ZHU Yin(Institute of Biology,Gansu Provincial Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

Usingcornbranasbasiccarbonsource,proteinfeedwasproducedwiththesolid-statefermentationofCandidautilis,Saccharomycescerevisiae andGeotrichum candidumby single-factor and orthogonal experiments.To improve pure protein content,the optimal fermentation conditions were as follows:solid-liquid ratio of solid-state fermentation medium 1:1.8(g:ml),inoculum 7%,fermentation temperature 31℃and time 80 h.Under the above conditions,the true protein content in the final product achieved 15.6%,which was 1.94 times of before fermentation.

corn bran;solid-state fermentation;feed protein

S816.6

0254-5071（2017）01-0107-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.022

2016-05-04

甘肅省科學院青年基金（2013QN-07）；國家科技支撐計劃（2012BAD14B10-4）；國家星火項目（2012GA860003）

季彬（1983-），男，助理研究員，本科，主要從事農業(yè)廢棄物高值化利用研究工作。

*通訊作者：王治業(yè)（1976-），男，研究員，碩士，主要從事生物資源高值化及清潔生產方面的研究工作。