楊盛茹，鄒 建，丁長(zhǎng)河*，劉洪斌，張 煌

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南鄭州450046；2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001；3.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京100125）

稀酸預(yù)處理玉米芯酶解工藝響應(yīng)面優(yōu)化研究

楊盛茹1，鄒 建1，丁長(zhǎng)河2*，劉洪斌3，張 煌1

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南鄭州450046；2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001；3.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京100125）

木質(zhì)纖維原料還原糖（葡萄糖、木糖）轉(zhuǎn)化是燃料乙醇生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟之一，該文以玉米芯為原料，采用稀硫酸處理、酶水解以提高還原糖轉(zhuǎn)化量。以還原糖轉(zhuǎn)化量為考核指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化稀酸處理玉米芯酶解條件，擬合硫酸體積分?jǐn)?shù)、加酶量、酶解時(shí)間3個(gè)因素對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化量的回歸模型。結(jié)果表明，最佳酶解工藝為121℃條件下預(yù)處理60 min，硫酸體積分?jǐn)?shù)0.8%，料液比1∶15（g∶mL），加酶量7%（纖維素酶∶半纖維素酶1∶1），酶解時(shí)間70.9 h。在此最佳條件下，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定酶解液中還原糖轉(zhuǎn)化量為462.62 mg/g，其中木糖、葡萄糖轉(zhuǎn)化量分別為330.02 mg/g、132.60 mg/g，還原糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)46.3%。

玉米芯；稀酸預(yù)處理；酶解；響應(yīng)面試驗(yàn)；高效液相色譜

能源、環(huán)境危機(jī)是21世紀(jì)制約人類社會(huì)、經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸。當(dāng)前，燃料乙醇是除生物柴油外規(guī)?；褂玫纳锬茉雌穂1]。木質(zhì)纖維生物質(zhì)是當(dāng)前生產(chǎn)生物燃料乙醇的重要原料，其資源廣泛且價(jià)格低廉[2-3]。

我國(guó)的玉米播種面積位居世界第二[4]，據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局發(fā)布的公告顯示，2015年我國(guó)玉米播種面積381.166 km2，總產(chǎn)量22 458.0萬(wàn)t[5]，而玉米芯產(chǎn)量據(jù)估算可達(dá)約7 487.04萬(wàn)t[6-7]。有專家學(xué)者研究以玉米芯為原料制備還原糖，但是轉(zhuǎn)化率有待提高，如羅鵬等[8-9]研究用超臨界二氧化碳及超聲預(yù)處理后再用稀酸水解，得出還原糖產(chǎn)率為39.5%；SIDIRAS D等[10]以硫酸作為催化劑在140℃條件下進(jìn)行有機(jī)溶劑處理，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%的可溶性糖。

木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)乙醇要經(jīng)過(guò)預(yù)處理、酶解糖化、發(fā)酵等過(guò)程，其中高效的預(yù)處理是燃料乙醇生產(chǎn)的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，稀酸法由于水解濃度低、應(yīng)用過(guò)程較簡(jiǎn)單、適用于規(guī)?；笊a(chǎn)，一直備受關(guān)注[11-14]。利用酶水解產(chǎn)生的還原性糖，具有糖產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少等特性，但是酶解過(guò)程本身復(fù)雜，且影響因素較多，只有在合適的條件下才能發(fā)揮出最佳活性[15]。響應(yīng)面法在篩選培養(yǎng)基及優(yōu)化等方面應(yīng)用較多[16]，但在優(yōu)化預(yù)處理、酶解過(guò)程中應(yīng)用較少。

本研究以玉米芯為原料，用稀硫酸預(yù)處理、纖維素酶和半纖維素酶水解，并用單因素及響應(yīng)曲面試驗(yàn)對(duì)還原糖（葡萄糖、木糖）轉(zhuǎn)化工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)于木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性還原糖的測(cè)定方法有多種，其中高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法快捷方便、準(zhǔn)確性高，因此試驗(yàn)中選用此法進(jìn)行還原糖定量分析[17]。本研究旨在探索高效轉(zhuǎn)化玉米芯還原糖的工藝，為玉米芯的有效利用提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而為生物轉(zhuǎn)化玉米芯制取乙醇的工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米芯（鄭州市上街區(qū)），自然晾曬干燥，粉碎過(guò)篩（直徑4 mm）后保存；硫酸、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純）：洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶和半纖維素酶（酶活均為10 000 U/g）：肇東日程酶制劑有限公司；木糖、葡萄糖（均為色譜純）：上海銳谷生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters2695高效液相色譜：美國(guó)Waters公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；YX280B手提式不銹鋼蒸汽鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 還原糖含量測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定還原糖含量。色譜條件為：Waters Carbohydrate High Performance色譜柱（4.6 mm× 250mm,4μm）；流速1.0mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量10μL；流動(dòng)相乙腈:水（75:25,V/V）；氮?dú)鈮毫?5psi；檢測(cè)器溫度80℃。

木質(zhì)纖維原料經(jīng)處理后轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性的還原糖主要是木糖、葡萄糖[18]，分別以葡萄糖、木糖為標(biāo)準(zhǔn)品，二者的保留時(shí)間分別為8.406 min、6.280 min，分別以葡萄糖、木糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖、木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y＝3×106x-2×106，相關(guān)系數(shù)為R2＝0.993；木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y＝2×106x-3×106，相關(guān)系數(shù)為R2＝0.998。利用葡萄糖、木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中還原糖含量，還原糖轉(zhuǎn)化量計(jì)算公式如下：

式中：YRS為還原糖轉(zhuǎn)化量，mg/g；CRS為還原糖含量，mg/L；V為樣品體積，L；m為玉米芯質(zhì)量，g。

還原糖轉(zhuǎn)化率即玉米芯中還原糖的轉(zhuǎn)化比率，其計(jì)算公式為：

1.3.2 玉米芯酶解條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

玉米芯4.00 g，加入一定硫酸溶液60 mL，混合均勻后于90℃浸泡4 h，于121℃預(yù)處理一定時(shí)間后加入酶[纖維素酶∶半纖維素酶（1∶1）]（調(diào)pH為4.5），在130 r/min、45℃條件下水解一定時(shí)間后以5 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾后于4℃保存用于HPLC分析。以還原糖轉(zhuǎn)化量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同硫酸體積分?jǐn)?shù)（0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%）、不同料液比(1∶9、1∶12、1∶15、1∶18、1∶21（g∶mL））、不同預(yù)處理時(shí)間（0、15 min、30 min、45 min、60min、75min）、不同酶解時(shí)間（0、24h、36h、48h、60h、72h、84 h），不同加酶量（0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%）對(duì)玉米芯酶解效果的影響。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化玉米芯酶解條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面軟件Design Expert 7.0對(duì)玉米芯酸法預(yù)處理、酶解條件進(jìn)行3因素3水平的中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CDD），以還原糖轉(zhuǎn)化量（Y）作為響應(yīng)值對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。CDD試驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

表1 CCD試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of CCD experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 硫酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)玉米芯還原糖轉(zhuǎn)化量影響

圖1 硫酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)木糖(a)及葡萄糖(b)轉(zhuǎn)化量的影響Fig.1 Effect of acid concentration on the conversion amount of xylose(a)and glucose(b)

由圖1可知，經(jīng)稀硫酸處理后酶解液中木糖轉(zhuǎn)化量遠(yuǎn)高于葡萄糖，同時(shí)分析得出硫酸體積分?jǐn)?shù)逐漸增大，還原糖（木糖、葡萄糖）轉(zhuǎn)化量曲線類似于拋物線即先增加后減少，這是因?yàn)樵谔幚頃r(shí)硫酸體積分?jǐn)?shù)過(guò)小無(wú)法充分破壞玉米芯纖維結(jié)構(gòu)致使降解不徹底，而過(guò)大時(shí)轉(zhuǎn)化的還原糖由于進(jìn)一步降解而減少。在硫酸體積分?jǐn)?shù)為0.8%時(shí)木糖、葡萄糖轉(zhuǎn)化量均達(dá)到最大，分別為303.28 mg/g和117.04 mg/g。因此，確定硫酸體積分?jǐn)?shù)為0.8%。

2.1.2 預(yù)處理時(shí)間對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化量影響

圖2 預(yù)處理時(shí)間對(duì)木糖(a)及葡萄糖(b)轉(zhuǎn)化量的影響Fig.2 Effect of pretreatment time on the conversion amount of xylose(a)and glucose(b)

由圖2可知，在試驗(yàn)0～60 min范圍時(shí)，隨著預(yù)處理時(shí)間延長(zhǎng)，葡萄糖轉(zhuǎn)化量和木糖轉(zhuǎn)化量均增加，且預(yù)處理時(shí)間為60 min時(shí)，木糖轉(zhuǎn)化量最大為289.56 mg/g，而葡萄糖轉(zhuǎn)化量在預(yù)處理時(shí)間＞60 min之后略有增加。綜合酶解液中還原糖轉(zhuǎn)化量及時(shí)間成本，選擇預(yù)處理時(shí)間為60 min。

2.1.3 料液比對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化量影響

由圖3可知，料液比在1∶9～1∶21（g∶mL）時(shí)，酶解液中木糖、葡萄糖的轉(zhuǎn)化量均隨料液比的變化而呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)；木糖轉(zhuǎn)化量在料液比1∶15（g∶mL）時(shí)最大為289.56 mg/g，葡萄糖轉(zhuǎn)化量在料液比1∶18（g:mL）時(shí)最大為109.52 mg/g。綜合考慮酶解液中還原糖轉(zhuǎn)化量，確定料液比為1∶15（g∶mL）。

圖3 料液比對(duì)木糖(a)及葡萄糖(b)轉(zhuǎn)化量的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the conversion amount of xylose (a)and glucose(b)

2.1.4 加酶量對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化量影響

圖4 加酶量對(duì)木糖(a)及葡萄糖(b)轉(zhuǎn)化量的影響Fig.4 Effect of enzyme addition on the conversion amount of xylose (a)and glucose(b)

由圖4可知，在沒(méi)有纖維酶類的條件下水解仍檢測(cè)出木糖和葡萄糖，說(shuō)明稀酸的浸泡、高溫作用等這些過(guò)程已經(jīng)有還原糖轉(zhuǎn)化，還原糖轉(zhuǎn)化量為235.56 mg/g（木糖和葡萄糖轉(zhuǎn)化量分別是124.56 mg/g、34.25 mg/g）；加酶量1%～6%時(shí)，隨加酶量的增加，酶解液中木糖和葡萄糖轉(zhuǎn)化量均逐漸增大，且變化較明顯；在加酶量＞6%時(shí)，木糖、葡萄糖轉(zhuǎn)化量增加逐漸平緩。綜合成本確定加酶量為6%。

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化量影響

圖5 酶解時(shí)間對(duì)木糖(a)及葡萄糖(b)轉(zhuǎn)化量的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on the conversion amount of xylose (a)and glucose(b)

由圖5可知，在前72 h內(nèi)隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解液中葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化量均呈逐漸增加趨勢(shì)，二者比較分析出木糖轉(zhuǎn)化增加率比葡萄糖增加率高。酶解時(shí)間＞72 h后，由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)發(fā)生副反應(yīng)導(dǎo)致糖破壞致使木糖和葡萄糖的轉(zhuǎn)化量均降低。因此，確定酶解時(shí)間為72 h。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化玉米芯酶解條件

通過(guò)單因素試驗(yàn)，選擇對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化量影響較大的硫酸體積分?jǐn)?shù)（A）、加酶量（B）、酶解時(shí)間（C）三個(gè)因素為自變量，還原糖轉(zhuǎn)化量（Y）為響應(yīng)值，采用CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析見(jiàn)表2，利用Design Expert 7.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析得方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，模型P值＜0.000 1，F(xiàn)值=90.53，影響極顯著，所得模型合適。失擬項(xiàng)的P值=0.8514＞0.05，F(xiàn)值=0.04，影響不顯著，決定系數(shù)R2＝0.993 9，擬合度＞90%，擬合度較好，可用此模型對(duì)影響還原糖轉(zhuǎn)化量的試驗(yàn)因子做出分析。B、A2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），AB、AC對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。因此各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值還原糖轉(zhuǎn)化量的影響并不能以簡(jiǎn)單的線性關(guān)系表示，所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸擬合可得二次回歸方程：

Y=443.97+6.92A+20.33B-6.45C-49.85A2+0.88B2-26.98C2-13.78AB+13.22AC-1.19BC

表2 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of CCD experiments

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

同時(shí)利用Design Expert 7.0軟件，分別做出加酶量、硫酸體積分?jǐn)?shù)、酶解時(shí)間交互作用對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化量影響的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖6。從圖6中可直觀地看出各因素間的相互作用、最佳參數(shù)。加酶量及因素交互作用對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化量的影響，曲線越陡影響越明顯越大，對(duì)應(yīng)于還原糖轉(zhuǎn)化量的變化越大。對(duì)試驗(yàn)因子影響及交互作用分析得出加酶量這一因素對(duì)響應(yīng)值還原糖轉(zhuǎn)化量的影響最明顯最大，加酶量和硫酸體積分?jǐn)?shù)交互作用、酶解時(shí)間和硫酸體積分?jǐn)?shù)交互作用顯著，同方差分析結(jié)果一致。

圖6 加酶量、硫酸體積分?jǐn)?shù)及酶解時(shí)間交互作用對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化量影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.6 Response surfaces plots and contour line of effects of interaction between enzyme addition,sulfate concentration and enzymolysis time on the conversion amount of reducing sugar

經(jīng)回歸模型預(yù)測(cè)玉米芯預(yù)處理、酶解轉(zhuǎn)化還原糖最佳工藝條件為硫酸體積分?jǐn)?shù)0.76%、加酶量6.99%、酶解時(shí)間70.87 h，還原糖轉(zhuǎn)化量理論值465.76 mg/g。對(duì)最佳工藝條件修正并驗(yàn)證，得出在硫酸體積分?jǐn)?shù)0.8%、加酶量7%、酶解70.9 h條件下，還原糖轉(zhuǎn)化量可達(dá)462.62 mg/g，其中木糖轉(zhuǎn)化量為330.02 mg/g，葡萄糖轉(zhuǎn)化量為132.60 mg/g，與預(yù)測(cè)值擬合度較好，證明此模型預(yù)測(cè)作用很好工藝參數(shù)合理可行。

3 結(jié)論

原料預(yù)處理可以破壞纖維的致密結(jié)構(gòu)，使纖維素、木質(zhì)素、半纖維素有效分離，可酶解性大大提高[11]。試驗(yàn)研究稀酸浸泡、纖維素酶和半纖維素酶水解轉(zhuǎn)化玉米芯還原糖，并用響應(yīng)曲面法對(duì)其工藝參數(shù)優(yōu)化，得出最佳條件為：硫酸體積分?jǐn)?shù)0.8%、90℃浸泡4h、料液比1∶15（g∶mL），在121℃條件下預(yù)處理60 min，加酶量（纖維素酶∶半纖維素酶1∶1）7%條件下酶解70.9h，還原糖轉(zhuǎn)化量可達(dá)462.62mg/g，其中木糖轉(zhuǎn)化量為330.02mg/g，葡萄糖轉(zhuǎn)化量為132.60mg/g，還原糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)46.3%。該試驗(yàn)為進(jìn)一步研究玉米芯發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇提供理論依據(jù)。

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Optimization of enzymolysis process of corncobs with dilute acid pretreatment by response surface methodology

YANG Shengru1,ZOU Jian1,DING Changhe2*,LIU Hongbin3,ZHANG Huang1(1.College of Food Engineering,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China;2.School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China;3.China Animal Disease Control Center,Beijing 100125,China)

The conversion of lignocellulosic biomass to reducing sugar(glucose and xylose)was one of key processes in the fuel ethanol production. To increase the concentration of glucose and xylose,corncobs was pretreated with dilute acid firstly and hydrolyzed with cellulase and hemicellulase. The enzymatic hydrolysis conditions of corncob were optimized by single factor and response surface experiments using reducing sugar conversion amount as evaluation index,and the regression model according to the significances and interaction effects of acid concentration,enzyme addition and hydrolysis time on the sugar conversion amount was fitted.The results indicated that the optimum conditions was determined as follows:sulfuric acid concentration 0.8%,solid-liquid ratio 1:15(g:ml),121℃for 60 min,enzyme addition 7.0%(cellulose:hemicellulase 1:1)for 70.9 h.Under the condition,the reducing sugar conversion amount determined by HPLC reached 462.62 mg/g and conversion rate was up to 46.3%,including xylose 330.02 mg/g and glucose 132.60 mg/g.

corncob;dilute acid pretreatment;enzymolysis;response surface experiment;HPLC

TS261.9

0254-5071（2017）01-0111-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.023

2016-10-24

河南省高校科技創(chuàng)新人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（101HASYTIT035）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（142102110178）；河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（162102210107）

楊盛茹（1988-），女，碩士，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)乙醇發(fā)酵。

*通訊作者：丁長(zhǎng)河（1968-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)乙醇發(fā)酵。