魯 龍，畢生雷*，金洪波，吳 娟，張鵬飛

(河南天冠企業(yè)集團有限公司車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室，河南南陽473000)

研磨法破碎小球藻細胞工藝優(yōu)化

魯 龍，畢生雷*，金洪波，吳 娟，張鵬飛

(河南天冠企業(yè)集團有限公司車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室，河南南陽473000)

選取破碎過程中的關(guān)鍵因素，以油脂得率為評價指標，通過進行單因素試驗和正交試驗，對研磨法破碎小球藻細胞的工藝條件進行了研究。結(jié)果表明，小球藻細胞破碎最佳工藝條件為藻液質(zhì)量濃度150 g/L，破碎時間2.5 h，球磨機轉(zhuǎn)速400 r/min，藻液與鋼珠的質(zhì)量比為3:4。在此工藝條件下，能達到較好的破碎效果，油脂得率為46.89%。

小球藻；研磨法；破碎；油脂得率

小球藻（Chlorella）是一種普生性單細胞綠藻，屬于綠藻門綠藻綱卵囊藻科，現(xiàn)已被廣泛養(yǎng)殖[1]。小球藻的主要產(chǎn)物是藻類油脂，它是由甘油三酯和多不飽和脂肪酸組成的，是藻細胞在一定的環(huán)境條件下利用碳水化合物等有機物經(jīng)復雜的代謝反應(yīng)合成的[2]。將油脂從藻細胞中提取出來與甲醇進行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，可以制備出具有可再生、環(huán)保、安全等優(yōu)點的生物柴油。

小球藻細胞被較為堅韌的細胞壁所包裹，而油脂大多存在于藻體細胞內(nèi)，難以直接將油脂提取出來[3]。因此，為提高油脂的提取效率，在提取前需要對藻體細胞進行破壁預處理。目前運用較多的細胞破碎方法可分為機械法和非機械法。機械法包括研磨法、高壓均質(zhì)法、超聲法、反復凍融法等[4]，這些方法雖然破壁效率高但存在能耗高的問題；而酸熱法、堿熱法、酶解法則屬于非機械法[4]，這些方法的使用則容易影響油脂的質(zhì)量，而且廢水排放存在著明顯的環(huán)保壓力。因此，現(xiàn)階段在進行較大規(guī)模的細胞破碎時，依舊是機械破碎方法應(yīng)用比較廣泛。

小球藻目前的研究方向主要圍繞異養(yǎng)方式培養(yǎng)的小球藻，異養(yǎng)培養(yǎng)方式避免了光自養(yǎng)培養(yǎng)過程中光限制等問題,使得工業(yè)化大規(guī)模高密度培養(yǎng)微藻成為可能。嚴佳琦等[5]分別對小球藻進行光合自養(yǎng)、混合營養(yǎng)高碳、混合營養(yǎng)低碳和異養(yǎng)低碳培養(yǎng)，結(jié)果表明自養(yǎng)小球藻細胞相比，異養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻細胞內(nèi)蛋白含量顯著下降而脂肪含量顯著增加。而不同菌株、培養(yǎng)基質(zhì)以及培養(yǎng)條件對小球藻的影響主要體現(xiàn)在細胞的密度和產(chǎn)物含量方面。周連寧等[6]使用高壓脈沖電場破碎小球藻細胞，利用脈沖電場造成的振蕩效應(yīng)使細胞崩壞，最高破壁率為72.51%。DOUCHA J等[7]對比了不同品牌、不同功率、不同容積的勻漿器，分別進行了30 min以上的破壁實驗，發(fā)現(xiàn)破壁率均在60%以上，隨著破壁時間的延長，部分破壁率甚至能夠達到90%。HYEON S C等[8]為了從小球藻中提取脂質(zhì)，用纖維素酶對小球藻進行破壁處理，發(fā)現(xiàn)當pH值為5.0，溫度為50℃時，酶解72 h，能有效破壁，并且脂質(zhì)提取率最高為85.3%。鄧祥元等[9]采用超聲波破碎小球藻提取葉綠素，在超聲溫度62℃，超聲時間2 h的條件下，葉綠素提取量為10.99 mg/g。

本實驗使用行星式球磨機通過研磨法破碎小球藻細胞，在球磨機中，鋼珠與細胞懸液在高速運轉(zhuǎn)中充分的猛烈碰撞、擠壓，具有較高的研磨效率和研磨效果，促使細胞壁破裂，釋放出細胞內(nèi)含物[10]。在實驗過程中，系統(tǒng)地研究了破碎過程中的關(guān)鍵因素對小球藻破碎效率的影響，通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化得出使用球磨機破碎小球藻細胞的最佳工藝條件。以期為小球藻的破碎提油過程提供工藝參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

異養(yǎng)小球藻（Chlorella）：清華大學生命科學院提供。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖：國藥集團化學試劑有限公司；酵母粉：安琪酵母有限公司；蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；無水乙醇：天津科密歐化學試劑有限公司；正己烷：鄭州派尼化學試劑廠。所有試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母粉3 g/L，KH2PO40.075g/L，MgSO40.075g/L，CaCl20.025g/L，K2HPO40.175g/L，（NH4）2SO41 g/L，F(xiàn)e2（SO4）33 g/L，ZnSO40.072 g/L，蛋白胨3 g/L，MnCl20.581 g/L，鉬酸鈉0.044 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

50 L發(fā)酵罐：上海國強生化工程裝備有限公司；101A-3型電熱鼓風烘箱：上海森信實驗儀器有限公司；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；ME3002E型電子天平：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司；TG16型臺式高速離心機：長沙英泰儀器有限公司；XQM型行星式球磨機：長沙天創(chuàng)粉末技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小球藻藻液的培養(yǎng)方法

發(fā)酵試驗采用50L發(fā)酵罐，接種量10%，發(fā)酵溫度28℃，pH 6.5，通風量2 m3/（L·h），轉(zhuǎn)速為間歇調(diào)節(jié)（干物質(zhì)含量＜20 g/L，轉(zhuǎn)速為200 r/min；20 g/L＜干物質(zhì)含量＜50 g/L，轉(zhuǎn)速為300 r/min；50 g/L＜干物質(zhì)含量＜70 g/L，轉(zhuǎn)速為400 r/min；干物質(zhì)含量＞70 g/L，轉(zhuǎn)速為450 r/min），采用間歇補料，葡萄糖含量低于10 g/L時補料[11-14]。發(fā)酵15 d，結(jié)束后，測得干物質(zhì)含量為132 g/L，密封后放入4℃的冰箱中備用。

1.3.2 不同質(zhì)量濃度藻液的配制方法

發(fā)酵結(jié)束后，小球藻藻液的質(zhì)量濃度為132 g/L，使用高速離心機7 000 r/min離心15 min，棄去部分上清液，將剩下的上清液和藻泥重新進行混合，使用此方法可將藻液進行濃縮。濃縮后測得藻液的質(zhì)量濃度為327g/L，在試驗中，根據(jù)需要的濃度，取一定量濃縮后的藻液，按照一定的比例加水稀釋，即可調(diào)配出不同質(zhì)量濃度的藻液。

1.3.3 細胞破碎方法

鋼珠與藻液的研磨過程在球磨罐中進行，每個球磨罐容積500 mL，取一定濃度的小球藻發(fā)酵液300 g，加入球磨罐中，再加入一定質(zhì)量的鋼珠，鋼珠每個直徑2 mm，然后蓋緊蓋子，固定好罐體，設(shè)定好轉(zhuǎn)速和時間。球磨罐在機械作用下高速轉(zhuǎn)動，帶動鋼珠在罐體中劇烈攪動，鋼珠與細胞之間的碰撞力和剪切力作用于細胞壁，使細胞破碎釋放油脂[15]。

1.3.4 油脂的提取方法

在破碎后的藻液中加入100 mL正己烷和30 mL無水乙醇，振蕩搖勻，油脂溶解在有機溶劑中[16]。隨后7000r/min離心10 min，棄殘渣，將上清液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，同樣的方法重復3次，將得到的上清液合并至分液漏斗中[16-18]。此時，細胞破碎后釋放出的油脂就全部溶解在分液漏斗內(nèi)的有機溶劑中。

1.3.5 油脂含量的測定

在分液漏斗中，水在下層，有機溶劑在上層，有機溶劑層是溶解了油脂的正己烷和乙醇。將水層放出，留下有機溶劑層，然后轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中將有機溶劑蒸干，留下的即為提取出的小球藻油脂[19-20]。油脂得率計算公式如下：

式中：y為油脂得率，%；m0為破碎的藻液的干物質(zhì)質(zhì)量，g；m1為通過試驗提取出的油脂質(zhì)量，g。

1.3.6 單因素試驗設(shè)計

選取細胞破碎過程中的4個關(guān)鍵因素藻液質(zhì)量濃度（100 g/L、150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L）、破碎時間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）、球磨機轉(zhuǎn)速（200 r/min、300 r/min、400 r/min、500 r/min、600 r/min）和藻液量:鋼珠質(zhì)量比（3∶3、3∶4、3∶5、3∶6、3∶7）進行單因素試驗，考察這4個因素單獨變化時對油脂得率的影響。

1.3.7 小球藻細胞破碎條件優(yōu)化正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以油脂得率為評價指標，進行L9（34）正交試驗，使用SPSS 17.0軟件分析試驗結(jié)果方差，根據(jù)分析結(jié)果得出細胞破碎的最佳工藝條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 小球藻細胞破碎條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for cell disruption conditions optimization ofChlorella

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 藻液質(zhì)量濃度對細胞破碎過程的影響

圖1 不同藻液質(zhì)量濃度對油脂得率的影響Fig.1 Effects of differentChlorellaliquid concentration on oil yield

由圖1可知，藻液質(zhì)量濃度越大，細胞破碎后的油脂得率越小，因為藻液質(zhì)量濃度越大，黏度就越大，這就會影響到鋼珠在藻液中的運動速度，鋼珠間的碰撞、剪切作用會減弱[21]。藻液質(zhì)量濃度＞300 g/L后，會完全成為黏稠狀，在破碎過程中，會造成鋼珠粘連，會嚴重影響破碎的效果。但是，藻液質(zhì)量濃度選擇過低，藻細胞少，破碎后提取出的油脂也少，會造成試驗誤差較大，而且工作效率也低，所以選擇200 g/L作為破碎時的最適宜藻液質(zhì)量濃度。

2.1.2 破碎時間對細胞破碎過程的影響

圖2 不同破碎時間對油脂得率的影響Fig.2 Effects of different disruption time on oil yield

由圖2可知，破碎時間越長，油脂得率越高。但是當破碎時間＞2.0 h后，油脂得率基本維持穩(wěn)定。這是因為2.0 h后，藻液細胞已經(jīng)達到最大的破碎程度，進一步增加破碎時間，油脂得率并不能進一步提高。所以選擇2.0 h作為細胞破碎時的最佳破碎時間。

2.1.3 球磨機轉(zhuǎn)速對細胞破碎過程的影響

由圖3可知，球磨機轉(zhuǎn)速＜400r/min時，轉(zhuǎn)速越高，油脂得率越高；當轉(zhuǎn)速達到400 r/min時，油脂得率達到最大值；當轉(zhuǎn)速＞400r/min之后，油脂得率隨著轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大反而有所減少，呈現(xiàn)出下降的趨勢。這是因為轉(zhuǎn)速越高，對藻細胞的破碎作用越強，一定時間內(nèi)球磨機的破碎效率越高，提取油脂后，計算得到的油脂得率就越高。但是轉(zhuǎn)速過快時，會使小球藻細胞集中于球磨罐底部，與球磨珠之間過于分散從而降低破壁效果，同時會消耗大量的能量，會使藻液溫度上升，從而導致降溫所用的能量也有所上升[22]。所以選擇400r/min作為進行破碎時球磨機的轉(zhuǎn)速。

圖3 不同轉(zhuǎn)速對油脂得率的影響Fig.3 Effects of different rotate speed on oil yield

2.1.4 藻液與鋼珠質(zhì)量比對細胞破碎過程的影響

圖4 不同藻液與鋼珠質(zhì)量比對油脂得率的影響Fig.4 Effects of different mass ratio ofChlorellacell and steel ball on oil yield

由圖4可知，當藻液與鋼珠質(zhì)量比在3∶3～3∶5時，鋼珠量越多，細胞破碎后，提取油脂得率越高；當藻液與鋼珠質(zhì)量比為3∶5時，油脂得率最高，達到47.16%；當藻液與鋼珠質(zhì)量比為3∶5～3∶7時，鋼珠量越多，油脂得率越低。這是因為鋼珠越多，彼此之間的剪切力越強，破碎效率也就越高，但是當加入過多時，由于鋼珠的相互作用顯著，不能使其達到適合破碎的速率分布[23]。所以選擇最適宜的藻液與鋼珠質(zhì)量比為3∶5。

2.2 正交試驗優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以油脂得率為評價指標，通過L9（34）正交試驗來進行優(yōu)化，找出最佳的工藝條件。正交試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

由表2可知，影響小球藻細胞壁破碎的主次因素是破碎時間＞轉(zhuǎn)速＞藻液質(zhì)量濃度＞藻液與鋼珠質(zhì)量比。各因素的最佳水平是A1B3C2D1，即藻液質(zhì)量濃度為150 g/L，破碎時間2.5 h，轉(zhuǎn)速400 r/min，藻液與鋼珠的質(zhì)量比為3∶4。在此最佳條件下進行3次驗證試驗，小球藻油脂得率為46.89%。

表2 小球藻細胞破碎條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for cell disruption conditions optimization ofChlorella

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments result

由表3方差分析可知，破碎時間和轉(zhuǎn)速對小球藻油脂得率影響顯著（P＜0.05），藻液質(zhì)量濃度和藻液與鋼珠質(zhì)量比影響不顯著（P＞0.05），這表明在各個因素所考察的范圍內(nèi)，破碎時間和轉(zhuǎn)速是一個重要因素，而藻液質(zhì)量濃度和藻液與鋼珠質(zhì)量比對小球藻油脂得率影響不大。

3 結(jié)論

通過對研磨法破碎細胞的效果進行比較，并對影響細胞破碎的因素進行單因素試驗和正交試驗可知，使用研磨法破碎小球藻細胞壁的最佳工藝條件為：將藻液質(zhì)量濃度調(diào)配到150 g/L加入球磨罐中，然后按照藻液與鋼珠質(zhì)量比為3∶4的比例加入鋼珠，蓋緊蓋子，固定好罐體后，設(shè)置轉(zhuǎn)速為400 r/min，運轉(zhuǎn)時間為2.5 h，啟動球磨機進行破碎。按照此工藝條件進行試驗，操作簡便，藻液處理量大，萃取后，油脂的得率可達到46.89%。本試驗優(yōu)化出的工藝直接使用微藻發(fā)酵液進行細胞破碎，是一種簡便有效的細胞破碎方法。優(yōu)化出的研磨破碎工藝可以為微藻油脂的大規(guī)模提取提供試驗參考，并且對生物柴油的工業(yè)化生產(chǎn)及發(fā)展有積極的促進作用。在現(xiàn)今國際油價大幅下跌的環(huán)境下，微藻生物能源的產(chǎn)業(yè)化仍待時日，更需要基礎(chǔ)研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化緊密結(jié)合，快速推進產(chǎn)業(yè)的協(xié)同發(fā)展。

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Optimization ofChlorellacell disruption process by grinding method

LU Long,BI Shenglei*,JIN Hongbo,WU Juan,ZHANG Pengfei(State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Technology,Henan Tianguan Group Co.,Ltd.,Nanyang 473000,China)

The key factors were selected in the process of disruption.Using oil yield as evaluation index,the process conditions ofChlorellacell disruption by grinding method were researched through the single factor and orthogonal experiments.The results indicated that the optimum disruption conditions were optimized as follows:Chlorellaliquid concentration 150 g/L,disruption time 2.5 h,rotate speed of ball grinder 400 r/min,the mass ratio ofChlorellaliquid and steel ball 3:4.Under the conditions,the disruption effect was better,and the oil yield was 46.89%.

Chlorella;grinding method;disruption;oil yield

TK6

0254-5071（2017）01-0116-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.024

2016-10-20

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃（2011BAD14B05）

魯龍（1988-），男，助理工程師，碩士，研究方向為生物質(zhì)能源開發(fā)。

*通訊作者：畢生雷（1981-），男，工程師，碩士，研究方向為生物化工。