申明金，曹洪斌，柴震

（1.川北醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，四川南充 637000； 2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川南充 637000)

半夏中微量元素的測定及半夏模糊聚類分析

申明金1，曹洪斌1，柴震2

（1.川北醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，四川南充 637000； 2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川南充 637000)

采用原子吸收分光光度法測定了20個不同產(chǎn)地半夏樣品中Fe，Mn，Cu，Zn，Cr，Ca，Mg，Ni，Pb等9種元素的含量。由于不同產(chǎn)地的半夏中微量元素含量數(shù)據(jù)離散，根據(jù)一種或幾種微量元素的含量難以評價藥物的相似性，故以9種元素含量并結(jié)合Zn／Cu值和Ca／Mg值為指標(biāo)，運用模糊聚類分析方法研究半夏藥物的質(zhì)量分類。結(jié)果顯示，當(dāng)閾值λ=0.55時，20個半夏樣品聚為4類；當(dāng)λ=0.65時，20個半夏樣品聚為6類；當(dāng)λ=0.70時，20個半夏樣品聚為10類。半夏中微量元素含量豐富，微量元素的種類及含量與藥物療效密切相關(guān)。在高閾值λ上截取聚為一類的藥物其組成與質(zhì)量相似性較大，該研究為中藥質(zhì)量評價提供了一種新的方法。

半夏；微量元素；模糊聚類分析；原子吸收分光光度法

半夏是臨床上常用的一種中藥，具有治療痰多咳嗽、胸脘痞悶等病癥的功效。半夏含有多種化學(xué)成分，除含有生物堿、核苷、有機酸等有機成分之外，還含有多種微量元素［1］。中藥中的微量元素盡管含量較低，卻是中藥藥性物質(zhì)的重要組成部分［2–3］，在現(xiàn)代中藥藥效研究中，分析測定中藥中微量元素的種類、含量和元素含量的比例十分重要，這些數(shù)據(jù)也是中藥生產(chǎn)和質(zhì)量評價的重要指標(biāo)。我國半夏主產(chǎn)于江蘇、湖北和四川等地，由于各地土壤、氣候等差異因素的影響，各地所產(chǎn)半夏中微量元素的含量、元素含量的比例存在明顯的差異。筆者以20個產(chǎn)地的半夏樣品為研究對象，采用火焰原子吸收分光光度法測定其中Fe，Mn，Cu，Zn，Cr，Ca，Mg，Pb的含量，并以這些元素的含量、Zn／Cu值和Ca／Ma值作為考察指標(biāo)，采用模糊聚類分析方法研究藥物的相似性，從微量元素整體反映的信息進行聚類比較，為該類中藥藥效研究和生產(chǎn)質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

原子吸收分光光度計：TAS–990型，北京普析通用儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：101–1A型，上海東星建材試驗設(shè)備有限公司；

電子分析天平：BS110S型，北京賽多利斯天平有限公司；

電子控溫加熱板：EGH–1型，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；

Fe，Mn，Cu，Zn，Cr，Ca，Mg，Ni，Pb空心陰極燈：日本Hitachi公司；

超純水器：法國Millipore公司；

微型植物粉碎機：FZ102型，天津市泰斯特儀器有限公司；

Fe，Mn，Cu，Zn，Cr，Ca，Mg，Ni，Pb標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：質(zhì)量濃度均為100 μg／mL，阿拉丁試劑（上海）有限公司；

硝酸、高氯酸、硫酸：優(yōu)級純，成都艾科達化學(xué)試劑公司；

實驗用水為超純水，電阻率為18.1 MΩ·cm；

半夏樣品分別采集于南充、遂寧等20個不同產(chǎn)地。

1.2 樣品處理方法

將半夏樣品以清水洗凈，再以洗潔精清洗，然后用大量水洗凈，用超純水反復(fù)沖洗4～5次，在70℃恒溫箱內(nèi)烘干至恒重，粉碎后過180 μm(80目)篩并置于干燥器中備用。準(zhǔn)確稱取0.500 g樣品于100 mL燒杯中，加入10 mL硝酸–高氯酸混酸（體積比為4∶1），放置過夜后在電爐上消化至冒白煙，消化液為無色或淡黃色近干時，加入適量超純水，置于電子控溫加熱板上，于130℃趕酸30 min。冷卻后將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用1%硝酸溶液清洗燒杯3次，清洗液移至容量瓶中，用超純水定容，待測。用同樣方法制備空白溶液。

1.3 儀器工作條件

Fe，Mn，Cu，Zn，Cr，Ca，Mg，Ni，Pb均采用空氣–乙炔火焰原子吸收光度法測定，根據(jù)相關(guān)文獻［4–6］選擇各元素的分析波長、燈電流、狹縫、燃燒器高度等測定條件見表1。將Fe，Mn，Cu，Zn，Cr，Ca，Mg，Ni，Pb單元素標(biāo)準(zhǔn)儲備液用1%硝酸溶液逐級稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定。

表1 儀器工作條件

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

按照1.3儀器工作條件，準(zhǔn)確吸取各元素的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液在對應(yīng)的測定波長下進行吸光度測定。采用7點標(biāo)準(zhǔn)曲線法繪制各元素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果見表2。

表2 線性方程與線性范圍

2.2 加標(biāo)回收試驗與精密度試驗

在已知各金屬元素含量的半夏樣品中分別加入一定量的Zn，Cu，Cr，Mn，Mg，F(xiàn)e，Ni，Pb標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定各金屬含量后計算樣品的加標(biāo)回收率。在不同時間重復(fù)測定5次，計算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，本法回收率在96.45%～101.75%之間，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.97%～1.87%，表明本方法精密度、準(zhǔn)確度良好。

2.3 樣品測定結(jié)果

按1.3儀器工作條件，測定半夏樣品溶液的吸光度，由各元素的線性方程計算相應(yīng)的濃度，同時利用空白試驗進行校正。測定高含量元素需先將樣品稀釋到線性范圍內(nèi)再進行測定，20個不同產(chǎn)地半夏樣品中的微量元素測定結(jié)果見表3。

2.4 半夏的模糊聚類分析

模糊聚類是一種廣泛用于中藥分類、藥效研究的模糊數(shù)學(xué)方法。該法以樣本之間的特征、相似性和親疏程度為依據(jù)，通過建立模糊相似關(guān)系對客觀事物進行分類［7］。從所測結(jié)果可知，20個產(chǎn)地半夏樣品中微量元素含量數(shù)據(jù)具有較高的離散性。由于半夏含有多種藥理成分，這些物質(zhì)之間存在協(xié)同和拮抗兩種作用，因而依據(jù)某一種或幾種元素的含量并不能完全客觀地對半夏進行分類和質(zhì)量評價，其分類結(jié)果存在一定的模糊性，適合應(yīng)用模糊聚類對其進行分類研究。應(yīng)用模糊聚類方法，以半夏中9種元素的含量以及Zn／Cu和Ca／Mg含量比值等11個指標(biāo)構(gòu)建數(shù)據(jù)集X{xij}，i=20，j=11。

表3 不同產(chǎn)地半夏中微量元素含量測定結(jié)果

模糊聚類分析的步驟如下［8］。

(1)將數(shù)據(jù)集進行標(biāo)準(zhǔn)化處理以消除指標(biāo)間因數(shù)據(jù)相差過大而產(chǎn)生的影響。

(2)利用標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)集X{xij}計算樣本之間的相似程度rij以構(gòu)成相似矩陣R={rij}，i=20，j=11。選擇夾角余弦法計算相似系數(shù)。

(3)由于相似矩陣R不具傳遞性，需將其改造為等價矩陣以便進行聚類分析。改造的方法是對相似矩陣R進行合成運算。合成運算的法則采用最大、最小取值法，即：

式中：∨——在m個（rik∧rkj）中取最大值；

∧——在rik和rkj中取最小值。

當(dāng)合成運算滿足RL=R2L時，所得RL即為等價矩陣RT。

(4)選擇合適的閾值λ對等價矩陣進行截取聚類，便可得到聚類分析結(jié)果。

對于模糊聚類分析，一般從較低的閾值開始進行截取聚類。閾值較小，所分類別數(shù)較少。但同一類中個別藥物之間的相似程度可能較低。在較高閾值上進行截取聚，雖然所分類別數(shù)增多，但同一類中藥物的相似程度較大。對20個半夏樣本的11個指標(biāo)數(shù)據(jù)進行模糊聚類分析，對所得模糊等價矩陣進行截取聚類，相似系數(shù)接近的藥物聚為一類，其聚類結(jié)果如下。

當(dāng)取閾值λ≤0.45時，20個產(chǎn)地的半夏樣品聚為2類。除20#單獨聚為一類外，其余產(chǎn)地的半夏樣品聚為一大類。

當(dāng)取閾值λ=0.55時，20個半夏樣品聚為4類。其中1#～11#聚為一大類，13#～19#聚為一大類，12#和20#各自聚為一類。

當(dāng)取λ=0.65時，20個半夏樣品聚為6類。其聚類為： {1，2，3，5，10，14，18，19}； {6，7，8，9，11，15，16，17}；{4}；{12}；{13}；{20}。相比于較低的閾值，用較高的閾值對等價矩陣中的相似系數(shù)進行截取，大的聚類開始進一步細分。

當(dāng)取λ=0.70時，20個半夏樣品聚為10類。其聚類為：{1，2}；{3，5，10，14}；{18，19}；{6，7}；{8，9，11，15，17}；{4}；{12}；{13}；{16}；{20}。相比于較低的閾值，用較高的閾值對等價矩陣中的相似系數(shù)進行截取，大的聚類開始進一步細分。

當(dāng)取λ=0.75時，20個半夏樣品的聚類為：{18，19}；{6，7}；{8，9}；{11，15，17}；其余半夏樣品各自聚為一類。

當(dāng)取λ=0.80時，20個半夏樣品的聚類為：{18，19}；{6，7}；其余半夏樣品各自聚為一類。

當(dāng)λ取值在0.85～0.95之間時，20個半夏樣品的聚類為：{18，19}；其余半夏樣品各自聚為一類。

當(dāng)取λ＞0.95時，20個半夏樣品各自聚為一類。

從以上的聚類結(jié)果可以看出不同產(chǎn)地半夏之間的相似程度，不同的截取閾值所得分類結(jié)果不同。在實際應(yīng)用中可以根據(jù)相關(guān)要求選擇合適的閾值進行聚類。

2.5 半夏模糊聚類分析結(jié)果驗證

微量元素常和中藥中的有機成分形成配合物而發(fā)揮作用，每一種微量元素都有其獨特的作用。Pb是一種對人體危害比較嚴(yán)重的有毒金屬，在中藥材生產(chǎn)中必須嚴(yán)格控制；Ca能降低細胞膜的通透性，具有解毒、消炎、消腫及抗感染等作用［9–10］；Mg是多種酶的激活劑、參與蛋白質(zhì)的合成并具有調(diào)節(jié)體溫的作用，缺Mg則可引起可導(dǎo)致人體內(nèi)K+濃度降低及機體虛弱、免疫力低下［11–12］；由于Ca和Mg之間的拮抗作用，高鎂血癥可引起低血鈣；Ni能促進人體內(nèi)鐵的吸收，刺激紅細胞再生和血液生長［13］；Cu是維持免疫系統(tǒng)正常功能不可缺少的元素，能夠提高抵抗微生物感染能力［14］；Zn對維持細胞功能有重要作用，具有抗菌、抗病毒、增強免疫功能的作用［15–16］；Zn與Cu之間存在拮抗和協(xié)同兩種作用，但過量的Zn會抑制機體對Cu的吸收［17］；Cr是維持正常膽固醇所必須的微量元素，也是由胰島素參與的脂肪或糖的代謝所必須的微量元素［18］；Fe能有效促進人體血液循環(huán)和交換，有利于提高機體免疫功能和預(yù)防疾病的作用［19］；Mn元素具有提高免疫力、刺激抗毒素的合成等作用［20］。

從模糊聚類分析的原理可知，在較高閾值上截取聚為一類的半夏的相似程度較大。當(dāng)在較高閾值0.75上截取聚類時，20個半夏樣品的聚類為：{18，19}；{6，7}；{8，9}；{11，15，17}；其余半夏樣品各自聚為一類。18#和19#半夏樣品中Ca元素含量相對較低，藥材中Ca／Mg值也相對較低，但Pb含量相對較高。兩者產(chǎn)地分別為川西平原的廣漢與綿竹，土壤類型主要是灰棕沖積水稻土。8#，9#，6#，7#，11#，15#和17#半夏的產(chǎn)地為四川盆地丘陵區(qū)，土壤類型主要為鈣質(zhì)紫色土。

以上地區(qū)所產(chǎn)半夏的相似性仍有一定的差別。8#與9#半夏分別產(chǎn)自三臺和中江縣，兩地相鄰、土壤類型和氣候相同；6#與7#半夏同產(chǎn)自于鹽亭縣，各元素含量較為接近；11#，15#，17#半夏分別產(chǎn)自南充高坪區(qū)、嘉陵區(qū)和順慶區(qū)，三者位置相鄰、具有較高的氣候和土壤類似性。以上聚類結(jié)果表明，氣候、產(chǎn)地等環(huán)境因素對半夏藥材中微量元素的吸收有一定的影響，因而與中藥材的質(zhì)量分類具有較為密切的聯(lián)系。因此在中藥種植生產(chǎn)中，選擇氣候、土壤合適的生產(chǎn)基地十分重要。

3 結(jié)論

中藥中往往含有多種藥效成分，多效性和整體平衡性是中藥的特色，因而對中藥質(zhì)量的分類應(yīng)從整體性的角度進行綜合評價。半夏的藥效和質(zhì)量是由其所含多種藥理成分協(xié)同作用的結(jié)果，元素的種類、含量、比值都會對半夏的藥效和質(zhì)量產(chǎn)生影響。因此，測定半夏中微量元素的含量對半夏藥效研究和質(zhì)量分類具有重要的意義。從測定結(jié)果可知，20個產(chǎn)地的半夏樣品中，Ca，Mg，F(xiàn)e元素含量差異較大，其它元素含量差異較小。由于元素之間功效的相互影響，半夏的質(zhì)量分類中類別之間并沒有一個截然的界限。運用模糊聚類分析來研究不同產(chǎn)地半夏的相似性，從微量元素整體的角度并考慮Ca／Mg和Zn／Cu含量比等因素，體現(xiàn)出中藥中各微量元素之間的協(xié)同作用。模糊聚類分析方法給出的結(jié)果指明在一定程度上的類別歸屬，這樣的分類結(jié)果更加符合實際情況。

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Determination of Trace Elements in Pinellia Ternate and Fuzzy Cluster Analysis of Pinellia Ternate

Shen Mingjin1, Cao Hongbin1, Chai Zhen2
(1. Department of Chemistry, North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, China; 2. Affliated Hospital North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, China)

The contents of Fe, Mn, Cu, Zn, Cr, Ca, Mg, Ni and Pb in pinellia ternate from twenty areas were determined by atomic absorption spectrophotometry. It was diffcult to evaluate the similarity of drug by the content of one or several trace elements in different growing areas. So the quality classifcation of the pinellia ternate from different areas was studied by using the fuzzy clustering analysis method based on the contents of 9 elements and the ratio of Zn／Cu and Ca／Mg. The results showed that twenty kinds of pinellia ternate were clustered into four classes when thresholdλwas 0.55; these pinellia ternate were clustered into six classes whenλwas 0.65 and clustered into ten classes whenλwas 0.70. The contents of trace elements in Pinellia Ternate were rich and the element type and content were closely related to the effcacy. It had high degree of quality similarity among Pinellia Ternates clustered into classes on the higher threshold, the study provides a new method for quality evaluation of traditional Chinese medicine.

pinellia ternate; trace element; fuzzy cluster analysis; atom absorption spectrophotometry

O651

：A

：1008–6145(2017)01–0029–04

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.01.007

聯(lián)系人：申明金；E-mail: shmj1970@163.com

2016–10–21