吳靜怡 周劍峰 裴仁治 張丕勝 劉旭輝 杜小紅

兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病致癌基因FGFR3表達(dá)對預(yù)后的影響研究

吳靜怡 周劍峰 裴仁治 張丕勝 劉旭輝 杜小紅

目的 分析急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）患兒成纖維細(xì)胞生長因子受體3（FGFR3）基因的表達(dá)情況，探討其在疾病預(yù)后判斷中的意義。方法采用實時定量PCR法檢測52例B-ALL患兒（B-ALL組）與12例對照兒童（對照組）骨髓血中B淋巴細(xì)胞FGFR3基因表達(dá)水平；并以B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平的中位數(shù)為界，將B-ALL組患兒分為FGFR3基因高表達(dá)組和FGFR3基因低表達(dá)組。比較FGFR3基因高表達(dá)組和FGFR3基因低表達(dá)組患兒的各項臨床指標(biāo)；隨訪36個月，比較兩組患兒的無事件生存（EFS）率。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測B淋巴細(xì)胞免疫分型、巢式PCR法檢測B淋巴細(xì)胞融合基因，比較不同B淋巴細(xì)胞免疫分型及融合基因的B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平。結(jié)果B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于對照組兒童（1.637±0.903 vs 0.645±0.559，P＜0.05）。FGFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒性別、年齡、外周血WBC、肝脾有無腫大、有無髓外浸潤、B淋巴細(xì)胞免疫分型及染色體核型等臨床指標(biāo)比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。FGFR3基因高表達(dá)組患兒EFS率低于FGFR3基因低表達(dá)組患兒（49.97%vs 76.17%，P＜0.05）。B-ALL組患兒中，CD34+患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于CD34-患兒（P＜0.05），BCR/ABL+患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于BCR/ABL-患兒（P＜0.05）。結(jié)論FGFR3基因高表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，有望成為輔助評價兒童B-ALL預(yù)后的指標(biāo)。

急性B淋巴細(xì)胞白血病 FGFR3 預(yù)后

成纖維細(xì)胞生長因子受體（FGFR）是一類具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受體，在細(xì)胞生長、分化、遷移及血管發(fā)生、傷口愈合等生理、病理過程中發(fā)揮重要作用[1]。FGFR3是FGFR家族一員，其在膀胱癌中高表達(dá)，且與腫瘤轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)浸潤密切相關(guān)[2]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)約25%多發(fā)性骨髓瘤患者發(fā)生t（4；14）（p16.3；q32.3）基因易位，導(dǎo)致FGFR3基因過度表達(dá)而致瘤[3]。FGFR3基因定位于染色體4pl 6.3，跨越16.5 kb，共含19個外顯子，是已被確認(rèn)的致癌基因。本研究旨在分析FGFR3基因在急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）患兒B淋巴細(xì)胞中的表達(dá)情況，探討其在疾病預(yù)后判斷中的意義，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2006年6月至2015年3月在寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鄞州醫(yī)院初診的B-ALL患兒52例（BALL組），采用MICM分型診斷。其中男33例，女19例；年齡0.25～16歲，中位年齡10歲；同時記錄患兒初診時外周血WBC、PLT、肝脾有無腫大、有無髓外浸潤、B淋巴細(xì)胞免疫分型及染色體核型等臨床指標(biāo)。患兒均按《兒童ALL診療建議》[4]進(jìn)行危險度分組，并參照該建議治療；1個療程結(jié)束后，根據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[5]評價療效，隨訪3年。選取同期健康兒童10例及缺鐵性貧血患兒2例作為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患兒、對照兒童監(jiān)護(hù)人均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 人淋巴細(xì)胞分離液購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程醫(yī)學(xué)研究所，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，RNA酶抑制劑購自華美生物工程公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國Promega公司，Taq DNA聚合酶購自加拿大Fermentas公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自上海東洋紡生物科技有限公司，所有流式試劑均購自美國BD公司。PRISM 7300實時定量PCR儀購自美國ABI公司，ChemilmagerTM5500型凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Alpha Innotech公司，四色數(shù)字化流式細(xì)胞購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 FGFR3基因?qū)崟r定量PCR檢測 抽取B-ALL組患兒及對照組兒童骨髓血3～5ml，淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓B淋巴細(xì)胞，Trizol一步法抽取總RNA，按試劑盒說明書操作步驟合成cDNA鏈。FGFR3基因上游引物5′-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3′，下游引物5′-GCCCAGTAACAGTACAGAACGA-3′，擴(kuò)增片段長度110bp。內(nèi)參GAPDH基因上游引物5′-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3′，下游引物5'-CATGCCATCACTGCCACCCAGAAGA-3′，擴(kuò)增片段長度150bp。20μl反應(yīng)體系中含 cDNA 2μl、FGFR3及 GAPDH上下游引物（10μmol/L）各0.5μl，每份標(biāo)本均設(shè)2個復(fù)孔，每板同時設(shè)質(zhì)控對照組、陽性對照組和陰性對照組。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10s，95℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸10s，40個循環(huán)，目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率基本一致。按照相對定量法計算目的基因的相對拷貝數(shù)即表達(dá)水平，具體公式為2-△△ct，其中△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，△△Ct=待測標(biāo)本△Ct值-標(biāo)準(zhǔn)品△Ct值。并以B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平的中位數(shù)為界，將B-ALL組患兒分為FGFR3基因高表達(dá)組和FGFR3基因低表達(dá)組。

1.3.2 染色體核型分析 24h培養(yǎng)法制備B-ALL組患兒骨髓B淋巴細(xì)胞染色體，采用G帶技術(shù)顯帶，分析細(xì)胞數(shù)20個。根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN1995）》描述核型，包括正常二倍體、超二倍體、亞二倍體、假二倍體。

1.3.3 B淋巴細(xì)胞免疫分型檢測 應(yīng)用四色數(shù)字化流式細(xì)胞儀和相應(yīng)的配套試劑檢測B淋巴細(xì)胞的免疫分型。所有B-ALL組患兒標(biāo)本均先以CD45設(shè)門，選定CD45弱陽性和側(cè)向角散射較小區(qū)域細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.3.4 B淋巴細(xì)胞融合基因檢測 參照文獻(xiàn)[6]報道的巢式PCR方法，同時檢測B-ALL組患兒骨髓B淋巴細(xì)胞融合基因。擴(kuò)增產(chǎn)物取10μl進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像掃描系統(tǒng)分析，根據(jù)特異條帶的有無分別記為陽性和陰性。

1.4 觀察指標(biāo) （1）比較B-ALL組患兒與對照組兒童FGFR3基因表達(dá)水平。（2）比較FGFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒各臨床指標(biāo)（性別、年齡、外周血WBC、肝脾有無腫大、有無髓外浸潤、B淋巴細(xì)胞免疫分型及染色體核型）。（3）患兒隨訪36個月，中位隨訪時間18個月，觀察比較FGFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒疾病預(yù)后。其中無事件生存（EFS）率定義為患兒自確診之日起至任何事件發(fā)生（包括復(fù)發(fā)、第二腫瘤或死亡）或末次隨訪日期，若患兒治療效果未達(dá)完全緩解，其EFS率為0.00%。（4）比較不同B淋巴細(xì)胞免疫分型及融合基因的 B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比表示，兩組比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。采用Kaplan-Meier法估計患者的EFS率并繪制生存曲線，兩組患者EFS率的比較采用log-rank檢驗。

2 結(jié)果

2.1 B-ALL組患兒與對照組兒童FGFR3基因表達(dá)水平比較 B-ALL組患兒與對照組兒童FGFR3基因表達(dá)水平分別為1.637±0.903、0.645±0.559，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），即B-ALL患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于對照兒童。

2.2 FGFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒各項臨床指標(biāo)比較 實時定量PCR檢測結(jié)果提示，F(xiàn)GFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒各有26例。兩組患兒各臨床指標(biāo)比較見表1。

由表1可見，兩組患兒性別、年齡、外周血WBC、肝脾有無腫大、有無髓外浸潤、B淋巴細(xì)胞免疫分型及染色體核型等臨床指標(biāo)比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。

2.3 FGFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒疾病預(yù)后比較 兩組患兒生存曲線見圖1。

圖1 FGFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒生存曲線

由圖1可見，F(xiàn)GFR3基因高表達(dá)組與與FGFR3基因低表達(dá)組患兒EFS率分別為49.97%、76.17%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），即FGFR3基因高表達(dá)組患兒EFS率低于FGFR3基因低表達(dá)組患兒。

2.3 不同B淋巴細(xì)胞免疫分型的B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測到B-ALL組患兒B淋巴細(xì)胞免疫分型包括CD10、CD20、CD22、CD34、CD38。不同B淋巴細(xì)胞免疫分型的B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平比較見表2。

表1 FGFR3基因高表達(dá)組與FGFR3基因低表達(dá)組患兒各臨床指標(biāo)比較[例（%）]

表2 不同B淋巴細(xì)胞免疫分型的B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平比較

由表2可見，B-ALL組患兒中，CD34+患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于CD34-患兒（P＜0.05）。

2.4 不同B淋巴細(xì)胞融合基因的B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平比較 巢式PCR法檢測到BALL組患兒B淋巴細(xì)胞融合基因包括HLA-DR、BCR/ ABL及TEL/AML1。不同B淋巴細(xì)胞融合基因的BALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平比較見表3。

表3 不同B淋巴細(xì)胞融合基因的B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平比較

由表3可見，B-ALL組患兒中，BCR/ABL+患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于BCR/ABL-患兒（P＜0.05）。

3 討論

FGFR3屬于酪氨酸激酶家族，生理條件下與配體結(jié)合后形成二聚體，激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶，參與細(xì)胞的生長、分化及遷移。在腫瘤組織中，F(xiàn)GFR3基因發(fā)生突變導(dǎo)致以受體非依賴的方式異常激活，有研究發(fā)現(xiàn)約35%膀胱癌及25%宮頸癌組織存在FGFR3基因的突變[7]。而在血液系統(tǒng)惡性疾病如慢性髓細(xì)胞白血病、漿細(xì)胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤中也發(fā)現(xiàn)FGFR3基因的過表達(dá)[8-9]。如將FGFR3基因高表達(dá)的骨髓細(xì)胞植入經(jīng)致死性照射的小鼠體內(nèi)，所有移植后的小鼠都出現(xiàn)了惡性的血液表型，包括淋巴細(xì)胞和髓系的惡性表型[10]。這些前期研究均提示FGFR3作為一種致癌基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與對照組兒童相比，B-ALL組患兒FGFR3基因表達(dá)水平較高。對BALL組患兒的隨訪也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR3基因高表達(dá)組患兒EFS率低于FGFR3基因低表達(dá)組患兒。

本研究發(fā)現(xiàn)B-ALL組患兒中，BCR/ABL+患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于BCR/ABL-患兒。Dvorakova等[11]發(fā)現(xiàn)慢性粒細(xì)胞白血病患者治療后BCR/ABL拷貝數(shù)下降，F(xiàn)GFR3基因表達(dá)水平明顯下降至正常水平，當(dāng)白血病復(fù)發(fā)或進(jìn)入加速期后，F(xiàn)GFR3基因表達(dá)水平會隨BCR/ABL拷貝數(shù)上升而明顯升高。兩者在腫瘤細(xì)胞增殖過程中有明顯的相關(guān)性，另外值得注意的是BCR/ ABL酪氨酸酶是依賴Ras信號途徑激活，而FGFR3基因的激活途徑是Ras非依賴性的，因此FGFR3基因的異常激活很可能進(jìn)一步激活BCR/ABL酪氨酸酶，導(dǎo)致細(xì)胞增殖。

本研究亦發(fā)現(xiàn) B-ALL組患兒中，CD34+患兒FGFR3基因表達(dá)水平高于CD34-B-ALL患兒。CD34抗原起源于早期造血干細(xì)胞，分化成熟后逐漸消失，在兒童ALL中表達(dá)明顯高于成人。盡管目前兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中CD34與預(yù)后關(guān)系尚不明確，但這仍提示來源于早期造血細(xì)胞的惡性克隆更容易出現(xiàn)致癌基因FGFR3的異常表達(dá)。國外學(xué)者在慢性粒細(xì)胞白血病患者CD34+細(xì)胞及健康供者CD34+外周血干細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)FGFR3基因的異常高表達(dá)[12]，這與本研究觀察到的現(xiàn)象一致。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示FGFR3基因高表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，有望成為輔助評價兒童B-ALL治療效果及預(yù)后的指標(biāo)。FGFR3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑或可作為抗腫瘤治療重要的靶向藥物，值得臨床及實驗室進(jìn)一步研究。

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Expression of FGFR3 gene in childhood acute B lymphoblastic leukemia and its relation to disease progression

Objective To investigate the expression of fibroblast growth factor receptors 3(FGFR3)gene in childhood acute B lymphoblastic leukemia(B-ALL),and its clinical significance in disease progression.MethodsThe expression levels of FGFR3 in 52 children with B-ALL and 12 normal children were assayed by real time RT-PCR.Clinical indicators were compared between patients with high FGFR3 expression and those with low FGFR3 expression.Patients were followed up for 36 months. The event-free survival(EFS)rate was compared with single factor analysis between two groups.B lymphocyte immune classification was detected by flow cytometry and B lymphocyte fusion gene was detected by nested PCR.The expression levels of FGFR3 were compared among different immune classification and fusion gene groups.ResultsFGFR3 was over-expressed in children with B-ALL compared with normal controls (1.637±0.903 vs 0.645±0.559,P＜0.05).There were no significant differences in sex,age,peripheral blood WBC count,hepatosplenomegaly,extramedullary infiltration,B lymphocyte immune classification and karyotype between low FGFR3 group and high FGFR3 group(P＞0.05).The probability of 3-year EFS for patients with high FGFR3 level was significantly lower than that with low FGFR3 level(49.97%vs 76.17%,P＜0.05).Expression levels of FGFR3 were significantly different between BCR/ABL+group and BCR/ABL-group(P＜0.05)and between CD34+group and CD34-group(P＜0.05).ConclusionOver-expression of FGFR3 may participate in malignant hematopoiesis and the detection of FGGR3 expression might be helpful in evaluation of disease progression in childhood acute B lymphoblasticleukemia.

Acute B lymphoblastic leukemia Fibroblast growth factor receptor 3 Progression

2015-12-10）

（本文編輯：李媚）

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LQ12H08001）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（2012KYB186）；寧波市自然科學(xué)基金項目（2012A610236）；寧波市醫(yī)學(xué)科技計劃項目（2011B23）

315000 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鄞州醫(yī)院血液內(nèi)科（吳靜怡、裴仁治、張丕勝、劉旭輝、杜小紅）；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院血液科（周劍峰）

裴仁治，E-mail：peirz@163.com