王 愛，潘立君，于秀石，李 麗，司軍強，馬克濤*，李新芝

·論著·

自發(fā)性高血壓大鼠外周血淋巴細(xì)胞連接蛋白43與炎性因子表達(dá)水平的相關(guān)性研究

王 愛1，2，潘立君3，于秀石1，2，李 麗1，2，司軍強1，2，馬克濤1，2*，李新芝1，4

高血壓；連接蛋白43；炎癥；淋巴細(xì)胞

王愛，潘立君，于秀石，等.自發(fā)性高血壓大鼠外周血淋巴細(xì)胞連接蛋白43與炎性因子表達(dá)水平的相關(guān)性研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20(2)：177-181.[www.chinagp.net]

WANG A,PAN L J, YU X S,et al.Correlation between connexin 43 in peripheral blood lymphocytes and expression level of inflammatory factors among spontaneously hypertensive rats[J].Chinese General Practice，2017，20(2)：177-181.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 于2015年4月—2016年4月，選取自發(fā)性高血壓(SH)大鼠和正常血壓的Wistar京都(WKY)大鼠各20只，16～18周齡，雄性，體質(zhì)量150～220 g，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(許可證編號SCXK京2007-0001)，已達(dá)到清潔級標(biāo)準(zhǔn)，動物質(zhì)量為一級標(biāo)準(zhǔn)。飼養(yǎng)環(huán)境要求：良好通風(fēng)、空氣過濾系統(tǒng)，環(huán)境安靜，室溫保持20 ℃、濕度控制在45%左右，每日更換墊料和飲用水，自由攝取水和食物。

1.1.2 儀器及試劑 流式細(xì)胞儀(E6)購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，水浴鍋(H216)購自上海博訊實業(yè)有限公司，低速大容量離心機(LC-4016)購自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，相差倒置顯微鏡(XD30)購自寧波舜宇儀器有限公司，生物安全柜(BHC-1300ⅡA2)購自阿爾泰實驗室設(shè)備(北京)有限公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱(HF151)購自上海力申科學(xué)儀器有限公司，凝膠成像儀(BioDoc Imaging)購自美國UVP公司，梯度PCR儀〔TC-96/G/H(b)C〕購自杭州博日科技有限公司，酶標(biāo)儀、微量分光光度計(K5500)購自北京凱奧科技發(fā)展有限公司，熒光定量PCR儀(TIB-8000)購自泰普生物科學(xué)(中國)有限公司。

別藻青蛋白(allophycocyanin，APC)標(biāo)記小鼠抗大鼠CD4抗體(B159112)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記小鼠抗大鼠CD8a抗體(B166485)、PE標(biāo)記IgG1、кIsotype Ctrl同型對照(B179044)均購自Bio Legend公司，小鼠來源抗大鼠Anti-Cx43(ab-79010)購自Abcam公司，山羊抗小鼠IgG/異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記二抗(ZF-0312)購自北京中杉金橋生物科技有限公司，大鼠白介素(IL)-2(230240922)、IL-6(230641023)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，淋巴細(xì)胞分離液(LTS10770125)購自天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，RPMI 1640培養(yǎng)基(1279443)購自美國Gibco公司，Concanavalin A(C-2010)購自美國Sigma公司，縫隙連接阻斷劑Gap27(A1045)購自Apexbio公司，實時熒光定量PCR試劑購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，Trizol購自life technologies公司，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠血壓測定 應(yīng)用BP-6無創(chuàng)血壓監(jiān)測儀測量大鼠尾動脈血壓，避免大鼠躁動，于大鼠清醒安靜狀態(tài)下連續(xù)測量3次，每次間隔至少1 min，測量3次取平均值即為大鼠收縮壓。

1.2.2 樣本采集 3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集腹主動脈外周血5 ml，1 500 r/min離心5 min(離心半徑20 cm)，取血漿于-20 ℃保存，離心后的下層血細(xì)胞用于分離外周血淋巴細(xì)胞。

1.2.3 炎性因子IL-2和IL-6表達(dá) 取凍存于-20 ℃的血漿樣品，ELISA法檢測IL-2和IL-6表達(dá)水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 淋巴細(xì)胞分離 將血細(xì)胞與0.9%氯化鈉溶液1∶1等體積稀釋，吹打混勻。取無菌15 ml離心管，加入淋巴細(xì)胞分離液，將淋巴細(xì)胞懸液緩慢按照1∶1比例加到淋巴細(xì)胞分離液上層，保證血液置于淋巴細(xì)胞分離液上層。根據(jù)密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞，低速離心機水平離心30 min(1 500 r/min，緩升緩降，離心半徑20 cm)。將分離的白色渾濁淋巴細(xì)胞層吸出至無菌15 ml離心管內(nèi)，加入3倍體積0.9%氯化鈉溶液洗滌，以1 800 r/min離心6 min(離心半徑20 cm)。洗滌2次，棄上清液，沉淀即淋巴細(xì)胞。加入1 ml培養(yǎng)基重懸，吸取50 μl到1.5 ml離心管，加450 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋10倍，顯微鏡下計數(shù)并用錐蟲藍(lán)染色觀察淋巴細(xì)胞活性。淋巴細(xì)胞活性為95%以上，調(diào)整淋巴細(xì)胞濃度為1×106個/ml，將淋巴細(xì)胞接種在24孔板中。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測IL-2 mRNA和IL-6 mRNA表達(dá) 計數(shù)分離出的淋巴細(xì)胞，調(diào)整培養(yǎng)基至淋巴細(xì)胞濃度為1×106個/ml。將淋巴細(xì)胞分為空白對照組、刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)組(培養(yǎng)48 h后加入5 μg/ml ConA)和Gap27+ConA組(培養(yǎng)前加入500 μmol/L Gap27，培養(yǎng)48 h后加入5 μg/ml ConA)。加入10%自體血清(血清處理步驟：56 ℃滅活30 min，以4 000 r/min離心30 min，離心半徑20 cm，4 ℃保存)，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

Trizol法提取上述培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞mRNA，核酸蛋白含量檢測儀測定A260/A280值，1%甲醛溶液變性凝膠電泳檢測提取淋巴細(xì)胞mRNA的質(zhì)量。選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因，GAPDH引物序列：上游：5′-CTCTCTGCTCCTCCCTGTTC-3′,下游：5′-GCCAAATCCGTTCACACCG-3′；IL-2引物序列：上游：5′-ACGCTTGTCCTCGCTA-3′，下游：5′-GCACCTGTAAGTCCAGCAAC-3′； IL-6引物序列：上游：5′-TTGGGACTGATGTTGTTGAC-3′，下游：5′-TGTGGGTGGTATCCTCTGT-3′。將提取的mRNA樣品、隨機引物、Rtmix、dNTP混合液、焦碳酸二乙酯(DEPC)按照反轉(zhuǎn)錄體系配制反應(yīng)體系，按照37 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min，90 ℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶5 min的反應(yīng)程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix，10×miScript Nucleics Mix通用引物，模板cDNA和RNase-Free water置于冰上，并輕輕混勻，配制反應(yīng)體系，按照95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸10 s，40個循環(huán)設(shè)置Bio-Rad熒光定量PCR儀，記錄IL-2 mRNA與IL-6 mRNA相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1SH和WKY大鼠收縮壓比較SH大鼠收縮壓為(211±15)mmHg(1mmHg=0.133kPa)，高于WKY大鼠的(122±5)mmHg，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=25.22,P<0.01)。

2.2SH和WKY大鼠炎性因子表達(dá)水平比較SH大鼠IL-2表達(dá)水平為(152.40±29.62)pg/ml，高于WKY大鼠的(73.41±20.16)pg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.24，P<0.05)；SH大鼠IL-6表達(dá)水平為(29.74±1.90)pg/ml，高于WKY大鼠的(22.58±1.06)pg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.72，P<0.05)。

2.4 各組淋巴細(xì)胞IL-2mRNA、IL-6mRNA相對表達(dá)水平比較SH大鼠各組淋巴細(xì)胞IL-2mRNA、IL-6mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中ConA組IL-2mRNA、IL-6mRNA表達(dá)水平均高于空白對照組和Gap27+ConA組，Gap27+ConA組IL-6mRNA表達(dá)水平低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。WKY大鼠各組淋巴細(xì)胞IL-6mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。WKY大鼠各組淋巴細(xì)胞IL-2mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中ConA組IL-2mRNA表達(dá)水平高于空白對照組和Gap27+ConA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table 1 Comparison of the expression levels of IL-2 and IL-6 mRNA among different groups of SH rats and WKY rats

組別SH大鼠IL?2mRNA IL?6mRNAWKY大鼠IL?2mRNA IL?6mRNA空白對照組240±008231±001107±021109±004ConA組621±046a281±008a355±038a135±024Gap27+ConA組176±045b134±024ab133±024b130±005F值409462692291092P值<001<001<001044

注：SH=自發(fā)性高血壓，WKY大鼠=Wistar京都大鼠，IL-2=白介素2，IL-6=白介素6，ConA=刀豆蛋白A；與空白對照組比較，aP<0.05；與ConA組比較，bP<0.05

3 討論

WAKI等[8]研究發(fā)現(xiàn)，高血壓模型動物腦干中細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，炎性細(xì)胞可影響其血壓的調(diào)節(jié)。血管緊張素Ⅱ可刺激大鼠神經(jīng)中樞，活化T淋巴細(xì)胞，加重高血壓進(jìn)展[9]。炎性因子主要由免疫細(xì)胞釋放，參與調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)，在細(xì)胞增殖、分化、免疫修復(fù)等過程中發(fā)揮主要作用[10]。MADHUR等[11]研究表明，原發(fā)性高血壓病患者血清C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α和IL-6等炎性因子水平與血壓升高呈正相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，SH大鼠炎性因子IL-2和IL-6表達(dá)水平均高于WKY大鼠，與既往研究[12]一致，提示SH與炎性反應(yīng)關(guān)系密切。

Gap27作為特異性縫隙連接阻斷劑，可能作用于Cx細(xì)胞膜第二胞外環(huán)，阻斷三磷腺苷(ATP)釋放和鈣離子內(nèi)流，發(fā)揮阻斷作用[17]。OVIEDO-ORTA等[18]研究發(fā)現(xiàn)，縫隙連接參與調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞間信號傳遞，并且在炎性因子刺激下，單核細(xì)胞Cx43表達(dá)上調(diào)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，Gap27可使T淋巴細(xì)胞炎性因子IL-2 mRNA和IL-6 mRNA表達(dá)下調(diào)。NIGER等[19]研究發(fā)現(xiàn)，縫隙連接影響炎性因子和免疫球蛋白的分泌，本研究結(jié)果與其相符，提示縫隙連接阻斷劑可能通過改變Cx43通道結(jié)構(gòu)或抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度進(jìn)而改變通道通透性[20]，從而影響炎性因子的釋放。

綜上所述，SH大鼠伴隨炎性反應(yīng)，炎性因子釋放增加，同時構(gòu)成T淋巴細(xì)胞間縫隙連接通道的Cx43表達(dá)顯著上調(diào)，應(yīng)用縫隙連接阻斷劑阻斷T淋巴細(xì)胞間信息通訊后炎性因子的釋放顯著下降，提示縫隙連接參與高血壓炎性反應(yīng)，具體機制有待進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)：王愛、李麗、司軍強、馬克濤進(jìn)行課題設(shè)計與實施、資料收集整理、成文并對文章負(fù)責(zé)；潘立君、于秀石、李新芝進(jìn)行課題設(shè)計與實施、評估、資料收集整理；馬克濤進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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本文鏈接：

——連接蛋白43

細(xì)胞連接通訊是動物體內(nèi)細(xì)胞通訊的主要方式之一，其發(fā)揮細(xì)胞之間信息傳遞功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是細(xì)胞間隙連接，而細(xì)胞間隙連接的主要結(jié)構(gòu)成分是連接蛋白。對于細(xì)胞間信息傳遞、細(xì)胞的生長、分化、維持心肌節(jié)律性同步收縮具有重要的意義。連接蛋白家族是一組高度相關(guān)的蛋白質(zhì)家族，每一個蛋白均是一種基因的產(chǎn)物。目前已發(fā)現(xiàn)十幾種連接蛋白，其中連接蛋白43是由總跨度為2768堿基對的三條互補脫氧核苷酸所編碼的含有387氨基酸的單肽。連接蛋白43在維持正常心律的電生理中起重要作用，連接蛋白43是主要的間隙連接蛋白也是心室肌細(xì)胞主要連接蛋白。連接蛋白43與心律失常、分娩、腫瘤等的發(fā)生密切相關(guān)，隨著研究的進(jìn)一步深入，從分子水平、基因轉(zhuǎn)錄等著手，更進(jìn)一步闡述其致病機制，可能為臨床的診斷和治療提供新的理論依據(jù)。

(本文編輯：吳立波)

Correlation between Connexin 43 in Peripheral Blood Lymphocytes and Expression Level of Inflammatory Factors among Spontaneously Hypertensive Rats

WANGAi1，2,PANLi-jun3,YUXiu-shi1，2,LILi1，2，SIJun-qiang1，2,MAKe-tao1，2*,LIXin-zhi1，4

1.KeyLaboratoryforXinjiangEndemicandEthnicDiseasesoftheEducationMinistryofChina,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832002,China2.DepartmentofPhysiology，MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832002,China3.UrumqiPetrochemicalCompanyofChinaWorkerHospital，Urumqi830019，China4.DepartmentofPhysiologyandPathology,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832002,China

*Correspondingauthor：MAKe-tao，Professor;E-mail：maketao@hotmail.com

Hypertension； Connexin 43； Inflammation； Lymphocytes

國家自然科學(xué)基金資助項目(31260247，81460098，81560081,81660271)；石河子大學(xué)杰出青年人才培育計劃項目(2012ZRKXJQ01)；石河子大學(xué)高層次人才科研啟動計劃(RCZX201449)

R 544.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.02.011

2016-03-08；

2016-10-09)

1.832002新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室

2.832002新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室

3.830019新疆烏魯木齊市，中國石油烏魯木齊石化公司職工醫(yī)院

4.832002新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室

*通信作者：馬克濤，教授；E-mail：maketao@hotmail.com