李兵++曾艷婷++莫惠雯++陳圣斌++趙惠玲++盧汝梅

【摘要】目的：建立華佗豆中綠原酸的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法測定華佗豆中綠原酸的含量，液相色譜柱為Inertsil ODS-3 （250mm×46mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈和01%磷酸水溶液，流速1mL/min，檢測波長327nm。結(jié)果：綠原酸進(jìn)樣量在0548～3288μg之間線性關(guān)系良好（r=09999）；華佗豆中綠原酸平均回收率為9631%。結(jié)論：該方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，為華佗豆的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定及進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】華佗豆；綠原酸；HPLC

【中圖分類號(hào)】R914【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）01-0016-03

Determination of Chlorogenic Acid in Plants of Calonyction muricatum by HPLC

LI BingZENG YantingMO HuiwenCHEN ShengbinLU Rumei*

Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530200，China

Abstract：Objective To develop a HPLC method for the determination of chlorogenic acid（CHA） from Calonyction muricatum. Methods CHA was determined by HPLC on a Inertsil ODS-3（250mm×46mm，5μm） column， acetonitrile-01% phosphoric acid solution as mobile phase， the flow rate was 10mL/min and detected at 327nm. Results Good linearities of CHA in the range of 0548～3288ug（r=09999）. And the average recovery was 9631%（RSD=212%）. Conclusion These results as above was simple，sensitive，accurate and had good reproducibility， can be used to provide the scientific evidence for the establishment of standard for quality controland further study.

Keywords：Calonyction muricatum； Chlorogenic Acid； HPLC

華佗豆為旋花科植物丁香茄Calonyction muricatum （Linn） GDon的種子，又名天茄子、天茄。其始載于《救荒本草》，味苦，性寒，具有瀉下、解毒等功效，分布于廣西、云南、河南、湖北、湖南等地[1]。在廣西民間，華佗豆又稱跌打豆，常用于治療跌打損傷、小兒疳積、小兒肺炎，療效顯著[2]。Gevara B Q等[3]研究結(jié)果表明，華佗豆具有明顯的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗菌活性。華佗豆中富含綠原酸成分，綠原酸是由咖啡酸和奎尼酸縮合而成的縮酚酸，具有抗菌、增高白血球、清除自由基、抑制黃嘌呤氧化酶等活性[4]。綠原酸為抗菌抗炎作用的酚酸類活性成分。目前，以綠原酸類成分用于華佗豆質(zhì)量控制的報(bào)道較少，研究采用HPLC法測定華佗豆中綠原酸的含量，為其質(zhì)量控制和臨床開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與材料

11儀器Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；BS224分析天平（德國賽多利斯）；KQ-500DA數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；CD-UPH-II-20L實(shí)驗(yàn)室超純水器（成都超純科技有限公司）；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭）。

12材料綠原酸（批號(hào)：F9MQ-ADLM，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（批號(hào)：67-56-1）、乙腈（批號(hào)：75-05-8）均為色譜純，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；水為超純水。

華佗豆藥材采自玉林市，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為旋花科植物丁香茄Calonyction muricatum （Linn） GDon的種子 。

2方法與結(jié)果

21色譜條件Inertsil ODS-3柱（46mm×250mm，5μm），以乙腈（B）-01%磷酸水溶液（A）（9 ∶[KG-*3]91）為流動(dòng)相；流速1mL/min；柱溫25℃；檢測波長327nm；進(jìn)樣量5μL。

22對(duì)照品溶液制備取綠原酸對(duì)照品約14mg，精密稱定，加甲醇定容到25mL量瓶中，制成每1mL含0548mg綠原酸的溶液，即為對(duì)照品溶液。

23供試品溶液的制備取華佗豆（玉林）粉末（過號(hào)篩）約03g，精密稱定，置50mL錐形瓶中，精密加入甲醇20mL，稱定質(zhì)量，常溫下超聲處理90min，冷卻至室溫，用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，濾過，取適量續(xù)濾液經(jīng)，高速離心15min，作為供試品溶液。

24線性范圍考察精密吸取綠原酸對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6μL，依次進(jìn)樣，測定綠原酸的峰面積。以峰面積對(duì)進(jìn)樣量（μg）進(jìn)行直線回歸，得回歸方程為：Y=140608965X-03327，r=09999。結(jié)果表明： 綠原酸在0548～3288μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

25精密度試驗(yàn)取上述對(duì)照品溶液，按“21”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定綠原酸的峰面積。結(jié)果綠原酸峰面積RSD為0 99 %，表明儀器精密度良好。

26穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品（玉林），按“23”項(xiàng)下方法制備，按“21”項(xiàng)色譜條件分別在0、3、6、12、18、24h進(jìn)樣，測定綠原酸峰面積，RSD為112%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

27重復(fù)性試驗(yàn)取同一份供試品（玉林），按“23”項(xiàng)下方法平行制備6份，按21項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果綠原酸平均含量為1456mg/g，RSD為274%，表明本法重復(fù)性良好。

28加樣回收試驗(yàn)精密稱取已知綠原酸含量的華佗豆樣品015g，共6份，分別精密加入1866mg/mL綠原酸對(duì)照品1mL，按“23”項(xiàng)下方法制備，按“21”項(xiàng)色譜條件分別測定，計(jì)算加樣回收率，平均加樣回收率為9631%，RSD為212%，結(jié)果表明本法準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見表1。

29樣品含量測定取4個(gè)不同產(chǎn)地華佗豆藥材粉末03g，精密稱定，按“23”項(xiàng)下方法制備，按“21”項(xiàng)色譜條件分別測定。結(jié)果見表2，圖1、2。

3討論

綠原酸為苯丙素類化合物，分子結(jié)構(gòu)中含有酯基、不飽和雙鍵及多元酚，鄰二酚羥基在加熱過程中易氧化分解，故本研究采用甲醇常溫下超聲處理。不同產(chǎn)地華佗豆含量測定結(jié)果表明，華佗豆中含有大量的綠原酸類成分，基于此類成分與其抗菌抗炎活性息息相關(guān)，可考慮將此類成分的含量作為華佗豆的質(zhì)量控制指標(biāo)。本研究中建立的含量測定方法簡單可行，重現(xiàn)性好，可為華佗豆藥材的質(zhì)量控制提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草（第6卷）[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999： 495.

[2] 朱小勇，趙紅艷，黃貴慶，等.超臨界CO2提取天茄子揮發(fā)油化學(xué)成分的分析[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（7）：139-141.

[3] Guevara B Q，Rosalinda C，Solevilla Y B，et al.Preliminary phytochemical microbiological and pharmacological studies of Calonyction muricatum Linn[J]. Acta Manilana Ser A Nat Appl Sci，1978，（17）：20.

[4] 徐小昆， 陳志勇， 廖立平， 等. 丁公藤屬植物中東莨菪苷、綠原酸、東莨菪素、異綠原酸A、異綠原酸B 和異綠原酸C 的含量測定[J].中國中藥雜志，2015，40（6）：1119-1122.

（編輯：穆麗華）