張曉曼 李彥玲 任月勤 李艾凡 張杰文

鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內科 鄭州 450000

胰島素抵抗對大鼠海馬及Aβ42代謝的影響

張曉曼 李彥玲 任月勤 李艾凡 張杰文

鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內科 鄭州 450000

目的 建立糖皮質激素所致阿爾茨海默病模型，觀察胰島素抵抗大鼠海馬β-淀粉樣蛋白42(Aβ42)的表達及對大鼠學習記憶的影響，探討胰島素抵抗在糖皮質激素所致阿爾茨海默病(AD)發(fā)病機制中的作用。方法 30只健康雄性SD大鼠，隨機挑選10只作為空白組(CON)。余下的采用地塞米松腹腔注射21 d制作胰島素抵抗模型，以穩(wěn)態(tài)模型的胰島素抵抗指數(shù)將其分為胰島素抵抗組及對照組，Y迷宮測定大鼠造模后的學習記憶成績，HE、Nissl染色觀察海馬組織形態(tài)學改變，免疫組化法及免疫印跡法觀察Aβ42在海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中的表達。結果 (1)Y迷宮試驗顯示，實驗組記憶能力較空白組明顯減退，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。實驗組記憶能力對照組減退，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，空白組、對照組2組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(2)Nissl染色：空白組海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊而密，實驗組部分細胞形態(tài)欠規(guī)則，出現(xiàn)核固縮，壞死，細胞排列紊亂，表明有大量的神經(jīng)元細胞死亡。對照組的病理結果則介于兩者之間。(3)海馬CA1 Aβ42免疫組化結果：空白組、對照組2組Aβ42陽性細胞表達相似且與實驗組比較相對少，平均積分光密度值低，2組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，實驗組較對照組明顯增多，平均積分光密度值增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；(4)海馬CA1區(qū)Aβ42免疫印跡檢測示：實驗組Aβ42表達水平較空白組上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，實驗組Aβ42表達水平較對照組上調，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？瞻捉M、對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 (1)糖皮質激素可致大鼠海馬出現(xiàn)神經(jīng)元損傷和病理學改變。出現(xiàn)胰腦島素抵抗的大鼠表現(xiàn)尤為明顯。但無明顯的老年斑及神經(jīng)原纖維纏結。(2)糖皮質激素可增加Aβ42的表達，胰島素抵抗大鼠的改變更為明顯，說明胰島素抵抗參與了糖皮質激素所致阿爾茨海默病的發(fā)病機制。

胰島素；胰島素抵抗；Aβ42；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種慢性進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以漸進性記憶障礙、人格改變及語言障礙等神經(jīng)精神癥狀為特征。流行病學資料顯示，AD患病率呈現(xiàn)顯著上升趨勢，65歲以上人口發(fā)病率為5%～10%，75歲以上老年人口中則上升為20%以上[1]。隨著人口預期生命延長，AD的發(fā)病率及病死率也在逐步提高，目前治療方法僅能緩解癥狀，不能改變疾病病程，且無有效的預防及治愈措施[2-3]?？梢姡珹D已成為威脅人類健康和發(fā)展的最嚴峻社會問題之一[4]。近年來，越來越多研究表明，糖皮質激素在阿爾茨海默病的發(fā)病及發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用，在其發(fā)病的機制方面，盡管很多人做了很多的研究，包括糖皮質激素與β-淀粉樣蛋白的產(chǎn)生、微管相關蛋白tau蛋白的異常磷酸化、神經(jīng)的可塑性、氧化應激及鈣紊亂之間的關系等。這些研究結果為闡明AD的發(fā)病機制提供新的視角，并為AD的臨床用藥提供新的潛在靶點，具有重要意義。但糖皮質激素與阿爾茨海默病之間的發(fā)病機制至今仍未完全清楚。

所謂胰島素抵抗(IR)是指各種原因使體內胰島素水平高于正常而其有效濃度及生物效能減低，導致胰島素相對不足，可使細胞攝取和利用葡萄糖的生理效應減低。本課題擬通過應用糖皮質激素后，大鼠血糖、胰島素水平與海馬Aβ42的關系的研究，探討糖皮質激素在AD發(fā)生中的作用機制，為闡明AD的發(fā)病機制及尋求新的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，體質量(300±20)g(清潔級)，許可證號：scxk(豫)2005-0001，由河南省實驗動物中心提供。胰島素放射免疫測定試劑盒(北京北方生物技術研究所)，β-淀粉樣肽抗體(Aβ42抗體)(美國Sigma公司)，Bradford蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio公司)，免疫組化試劑盒(北京中杉公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的篩選及動物模型的制作及評價：動物由河南省實驗動物中心提供，大鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機分成正?？瞻捉M(CON)、地塞米松組。根據(jù)張芳林[5]地塞米松(dexamethasone，DEX)誘導方法建立胰島素抵抗大鼠模型，大鼠內眥眼眶靜脈叢穿刺取血，放射免疫法測定胰島素，取血后繼續(xù)給藥。以穩(wěn)態(tài)模型的胰島素抵抗指數(shù)將其分為胰島素抵抗組及對照組(空白對照組大鼠RI均數(shù)加3個標準差的視為胰島素抵抗，每組10只)。

1.2.2 胰島素抵抗指數(shù)評價：待血糖和胰島素測定結果出來，以穩(wěn)態(tài)模型的胰島素抵抗指數(shù)計算公式HOMA-IR=FINs(IU/L)× FPG(mmol/L)/22.5[6]計算胰島素抵抗指數(shù)(IRI)，對各組大鼠作出IR程度評價。

1.2.3 行為學測試：行為學測試于造模后胰島素抵抗程度評價結束后進行，用3等分Y-型電迷宮箱對所有的大鼠進行測試。

1.2.4 標本的制備：胰島素抵抗程度評價及Y-迷宮測試結束后，采集標本。各組大鼠迅速斷頭取腦，沿正中矢狀線將大腦分成兩半，一半迅速放入—80 ℃液氮罐中凍存?zhèn)湫蠾estern blot檢測；另一半放入10%的甲醛溶液(pH 7.0)中，固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，制作切片，備HE、Nissl染色、免疫組織化學染色檢測。

1.2.5 Western blotting測定Aβ42酶蛋白的含量：根據(jù)使用量，按每1 mL RIPA裂解液加入10 μL的PMSF配置組織細胞裂解液。按200 μL/20 mg腦質量加入相當體積的組織細胞裂解液，冰上用勻漿器將組織研磨，然后在冰浴下超聲波粉碎制成勻漿，取各組海馬組織進行勻漿。選用20%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，隨后進行轉膜、封閉、加入一抗(以TBST稀釋1：200)、漂洗、加入二抗(以TBST按1：2 000稀釋)、漂洗、DAB顯色劑避光顯色等步驟，待顯色滿意后放入TBS中終止反應。內參蛋白選用β-actin(以TBST按1：500稀釋)。最后用凝膠圖像分析儀對膜上條帶進行分析。

2 結果

2.1 大鼠空腹血糖、血漿胰島素及胰島素抵抗程度比較 實驗測得空白組大鼠的胰島素抵抗指數(shù)為5.0±1.9，由此將地塞米松喂養(yǎng)的大鼠胰島素抵抗指數(shù)<10.7的為對照組，>10.7的為胰島素抵抗組。

2.2 腹腔注射DEX對大鼠學習記憶能力的影響 與空白組比較胰島素抵抗組學習記憶獲得次數(shù)明顯增加，學習記憶的正確反映率明顯降低，學習記憶能力明顯減退，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。胰島素抵抗組與對照組、對照組與空白組比較，學習記憶次數(shù)稍有增加，正確反應率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠Y迷宮試驗的學習記憶成績比較

2.3 大鼠海馬CA1區(qū)HE染色結果 空白組和對照組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)規(guī)則，層次豐富，細胞線清晰，細胞排列整齊而密，胞核清晰，胞核大而圓，著色呈均勻淡藍色或藍色，細胞質豐富，膠質細胞散在分布，且空白組更明顯；胰島素抵抗組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)欠規(guī)則，錐體細胞排列松散，不整齊，海馬內出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，細胞周圍出現(xiàn)間隙，有膠質細胞浸潤(見圖1)。但無明顯的老年斑及神經(jīng)原纖維纏結。

圖1 海馬CA1區(qū)HE染色(×400) A：空白對照組 B：對照組 C：胰島素抵抗組

2.4 大鼠海馬CA1區(qū)Nissl染色果比較 Nissl染色也是對腦組織海馬CA1區(qū)錐體細胞進行形態(tài)學檢測，空白組和對照組大鼠的海馬錐體細胞胞漿內尼氏體豐富，細胞排列整齊；胰島素抵抗組大鼠海馬錐體細胞中尼氏體較空白組減少，有少數(shù)細胞核固縮深染，對照組介于兩者之間(見圖2)。

圖2 海馬Nissl染色結果(×400) A：空白對照組 B：對照組 C：胰島素抵抗組

2.5 海馬CA1區(qū) Aβ42免疫組化結果分析 各組大鼠海馬CA1區(qū)均可見陽性反應物，分布于神經(jīng)元胞膜和胞漿，部分在細胞外間隙沉積，胰島素抵抗組Aβ42陽性細胞較空白組明顯增多，胞漿著色明顯加深，且出現(xiàn)細胞外陽性著色。對照組病理結果介于胰島素抵抗組與空白組之間。Biosens Digital Imaging System v1.6圖象分析系統(tǒng)分析顯示：胰島素抵抗組與對照組、對照組與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而胰島素抵抗組與空白組顯示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3，表2。

圖3 海馬免疫組化結果(×400) A：空白對照組 B：對照組 C：胰島素抵抗組

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)免疫組化結果比較

注：與空白組與對照組比較，*P<0.05；與胰島素抵抗與空白組比較，Aβ42陽性細胞數(shù)及平均積分光密度，**P<0.01

2.6 各組大鼠Western blot檢測結果 各組大鼠海馬組織進行勻漿，采用Western blot方法，用Aβ42抗體測海馬組織Aβ42蛋白含量，見圖4，表3。利用圖像分析軟件對Western blot印跡進行定量分析，PBS陰性對照組未出現(xiàn)條帶影，其余各組在6～15 kD處皆出現(xiàn)一明顯較寬條帶，表明蛋白表達明顯增加，胰島素抵抗組與空白組OD值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而胰島素抵抗組與空白組、對照組，空白組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 Western blot結果(×400)

表3 各組大鼠Aβ42灰度值比較

注：與空白組與對照組比較，*P<0.05；與胰島素抵抗與空白組比較，Aβ42灰度值比較，**P<0.01

3 討論

阿爾茨海默病(AD)是一種以進行性認知功能減退為特征的中樞神經(jīng)退行性疾病，其特征的病理學表現(xiàn)是Aβ在細胞外的沉積形成老年斑、tau蛋白過度磷酸化在細胞內形成神經(jīng)原纖維纏結(NFT)、海馬錐體細胞顆粒變性和神經(jīng)元的缺失等。

DEX是糖皮質激素(glucocorticoids，GCs)類似物，GCs是一種公認的應激激素，是腎上腺皮質在下丘腦和垂體調節(jié)下分泌的一種物質，正常濃度的GCs能維持機體正常的生長發(fā)育、參與多種體內代謝過程及調節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能。GCs可直接拮抗胰島素作用和抑制胰島素釋放而使糖脂代謝紊亂，降低胰島素敏感性引起IR。它不直接破壞β細胞，而是通過影響糖代謝，降低糖耐量出現(xiàn)IR特征。最近大量研究報道糖皮質激素與AD發(fā)病的關系密切。

很多的研究試驗證實超過一定限度的GC水平介導與AD發(fā)病密切相關，且超過一定限度，隨糖皮質激素量的增加，其導致AD的發(fā)病率也在增加，可能影響AD的產(chǎn)生、tau 蛋白的高度磷酸化、神經(jīng)的可塑性及氧化應激、鈣紊亂等[7-10]。導致AD發(fā)病的具體機制尚不完全清楚。

本實驗中，光鏡下HE及Nissl染色可見空白組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)規(guī)則、層次豐富、細胞排列整齊，Nissl染色胞漿內尼氏體豐富、周圍膠質細胞散在分布；胰島素抵抗組鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)欠規(guī)則、細胞排列松散、紊亂、有核固縮現(xiàn)象，許多細胞胞體縮小，HE染色胞漿呈淡藍色，僅呈很淡的藍色甚至藍色消失、胞核固縮深染，Nissl染色大鼠的海馬神經(jīng)元細胞胞漿內尼氏體減少或缺如、膠質細胞浸潤明顯。而對照組的病理變化介于上述兩者之間。Y型迷宮試驗顯示，胰島素抵抗組學習記憶獲得次數(shù)明顯增加，學習記憶的正確反映率明顯降低，胰島素抵抗組與對照組、對照組與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而胰島素抵抗組與空白組比較差異更為明顯(P<0.01)。本研究表明，給予糖皮質激素后有IR特征的大鼠海馬神經(jīng)元細胞受到的損傷最明顯，進而影響大鼠的記憶、認知功能，使認知能力受損。

本實驗中，海馬CA1區(qū) Aβ42免疫組化結果及免疫印跡檢測結果，胰島素抵抗組與對照組、對照組與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而胰島素抵抗組與空白組比較差異更為明顯(P<0.01)，表明糖皮質激素誘發(fā)胰島素抵抗大鼠的大腦海馬中Aβ42表達增多，該結果與鏡下結果一致。由此本實驗證實，給予糖皮質激素誘發(fā)胰島素抵抗導致大腦海馬中Aβ42表達增多，是導致阿爾茨海默病的原因之一。

至于病理學檢測未發(fā)現(xiàn)明顯的老年斑及神經(jīng)原纖維纏結，考慮其原因為在正常生理情況下，機體是一個整體，多種因素相互作用使內部環(huán)境處于一個相對穩(wěn)定的動態(tài)環(huán)境中，腦內可持續(xù)產(chǎn)生Aβ，機體可通過有效的清除措施抑制其聚集，兩者一定程度上維持一定的平衡。胰島素抵抗僅是影響Aβ42表達增多的因素之一，其在短時間內不一定出現(xiàn)導致胰島素抵抗大鼠出現(xiàn)病理學上的明顯改變。

研究表明，海馬神經(jīng)元中含有大量糖皮質激素受體(glucocorico- ids receptor，GR)[11]，而且海馬區(qū)GR最大結合能力均高于其他腦區(qū)，因此，海馬是GCs最為敏感的神經(jīng)靶位之一，也是AD病理損害最嚴重的腦區(qū)之一[12]。高濃度下，其還可通過血腦屏障進入腦內，危害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起海馬萎縮、突觸丟失、神經(jīng)元凋亡[13-14]。也有研究表明，GC與大腦學習記憶的神經(jīng)調節(jié)機制呈“U”型相關，低劑量可促進大腦的學習記憶，高劑量則抑制大腦的學習記憶，但機制并不清楚。但在本實驗中胰島素抵抗組與對照組相比較，胰島素抵抗組的變化較為明顯，表明胰島素抵抗也是GCs引起海馬損傷的機制之一。

另外，已有研究表明，SAD的發(fā)生是多因素造成的。本實驗也僅僅說明糖皮質激素所誘導的胰島素抵抗參與了AD的發(fā)病，是導致其發(fā)病的原因之一。但糖皮質激素參與AD發(fā)病的機制也可能是多方面的，其具體機制有待我們進一步研究。

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(收稿2016-11-17)

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1673-5110(2017)02-0026-04