聶芳菲 楊清默 夏有辰 馬建勛 陳東明

(北京大學(xué)第三醫(yī)院成形外科，北京 100083)

·實(shí)驗(yàn)研究·

半導(dǎo)體激光局部照射對SD大鼠缺血皮瓣愈合時(shí)ICAM-1和MCP-1表達(dá)的影響

聶芳菲 楊清默①夏有辰*馬建勛 陳東明

(北京大學(xué)第三醫(yī)院成形外科，北京 100083)

目的 觀察半導(dǎo)體激光局部照射SD大鼠缺血皮瓣創(chuàng)面愈合時(shí)組織中炎癥反應(yīng)因子細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的表達(dá)，探討其促進(jìn)缺血皮瓣愈合的機(jī)制。 方法 在20只雄性SD大鼠背部兩側(cè)對稱各制備2個(gè)皮瓣，蒂位于尾側(cè)，長6 cm，寬1 cm，2個(gè)皮瓣間距離2 cm。實(shí)驗(yàn)側(cè)(實(shí)驗(yàn)組)皮瓣術(shù)后行半導(dǎo)體激光照射，每天1次，連續(xù)照射數(shù)天直至取材，同時(shí)遮擋對照側(cè)(對照組)。采用自身對照法比較實(shí)驗(yàn)組和對照組的創(chuàng)面愈合情況和皮瓣存活面積，分別于術(shù)后4、7、10、14 d取皮瓣中段組織進(jìn)行病理學(xué)染色，分析制備的大鼠皮瓣血管形成情況和炎癥反應(yīng)因子ICAM-1和MCP-1的表達(dá)。 結(jié)果 皮瓣遠(yuǎn)端發(fā)生明顯的缺血壞死。術(shù)后7 d，實(shí)驗(yàn)組和對照組的皮瓣存活率分別為(84.6±10.8)%和(79.8±11.3)%，實(shí)驗(yàn)組皮瓣存活率明顯高于對照組(n=5，t=7.299，P=0.002)。術(shù)后4、7、10、14 d實(shí)驗(yàn)組微血管密度分別為(74.160±25.968)、(115.937±17.827)、(87.330±21.383)、(69.644±12.126)個(gè)/mm2，均明顯高于對照組(33.460±8.310)個(gè)/mm2(t=3.089，P=0.037)、(36.685±7.693)個(gè)/mm2(t=11.741，P=0.000)、(43.474±7.400)個(gè)/mm2(t=4.185，P=0.014)、37.104±8.721(t=5.218，P=0.006)。術(shù)后4 d實(shí)驗(yàn)組炎癥因子ICAM-1的表達(dá)量0.063±0.015明顯高于對照組0.045±0.017(t=8.430，P=0.001)；術(shù)后7 d實(shí)驗(yàn)組炎癥因子ICAM-1和MCP-1的表達(dá)量分別為0.022±0.008、0.041±0.008，均明顯低于對照組0.042±0.015(t=4.309，P=0.013)、0.065±0.007(t=6.731，P=0.003)。 結(jié)論 半導(dǎo)體激光局部照射SD大鼠缺血皮瓣能調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合時(shí)炎癥因子ICAM-1和MCP-1的表達(dá)，是促進(jìn)缺血皮瓣愈合的重要機(jī)制之一。

半導(dǎo)體激光； 缺血皮瓣； 炎癥； 單核細(xì)胞趨化蛋白-1; 細(xì)胞間黏附分子-1

皮瓣移植是整形外科最基本的治療手段，如果皮瓣的長寬比過大，由于皮瓣本身的血管痙攣、感染、過氧化損傷、血栓形成等會(huì)導(dǎo)致皮瓣缺血壞死，影響組織的修復(fù)。目前，術(shù)后皮瓣的缺血壞死仍然是一個(gè)非常棘手的問題。2013年Cury等[1]研究表明低能量激光照射對大鼠缺血性皮瓣的血管再生有促進(jìn)作用，提示低能量物理因素的干預(yù)在微創(chuàng)甚至無創(chuàng)的情況下可能有利于促進(jìn)皮瓣成活的效果。盡管已對低能量激光(包括氦氖激光和半導(dǎo)體激光等)進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究，并且在創(chuàng)面愈合、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、口腔疾病等治療領(lǐng)域取得肯定的療效，但其作用機(jī)制尚未完全明確[2]。有關(guān)半導(dǎo)體激光照射促進(jìn)缺血皮瓣成活的炎癥相關(guān)機(jī)制的報(bào)道也不多。為研究半導(dǎo)體激光促進(jìn)缺血皮瓣遠(yuǎn)端缺血組織愈合的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了長寬比為6∶1的超長隨意型皮瓣，成功制備皮瓣遠(yuǎn)端缺血的動(dòng)物模型，并比較該模型近端和遠(yuǎn)端組織的創(chuàng)面愈合情況，觀察炎癥因子細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)在其中的表達(dá)情況，為探討半導(dǎo)體激光調(diào)節(jié)創(chuàng)面局部炎癥反應(yīng)，促進(jìn)缺血皮瓣創(chuàng)面愈合的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

健康雄性SD大鼠20只[北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK(京)2011-0039]，體重350～400 g。羊抗鼠ICAM-1多克隆抗體、羊抗鼠MCP-1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒PV9003購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物模型的制備

3%戊巴比妥鈉0.15 ml/100 g體重腹腔內(nèi)麻醉，背部備皮。以中線為界，在大鼠背部設(shè)計(jì)皮瓣，蒂位于尾部雙側(cè)髂棘連線上，長6 cm，寬1 cm。大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，鋪巾，切開皮瓣掀起至筋膜層，切斷皮瓣與下方肌肉層的筋膜連接，使皮瓣與基底無連接，僅留1 cm寬的蒂，5-0帶針線原位縫合皮瓣(圖1)，無菌敷料覆蓋，固定，術(shù)后單籠飼養(yǎng)。

1.3 照射方案

鎵鋁砷(GaAlAs)半導(dǎo)體激光治療機(jī)(北京三頓醫(yī)療設(shè)備有限公司，SUNDOM-300IB型)，波長810 nm，功率900 mW，每天1次，每次6 min，連續(xù)照射，能量密度為21.6 J/cm2。采用自身對照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，按照隨機(jī)序號(hào)確定照射側(cè)，照射范圍覆蓋單側(cè)皮瓣，其余部位用不銹鋼板遮擋，不行激光照射。

1.4 標(biāo)本采集與組織學(xué)染色

術(shù)后4、7、10、14 d取材，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只。分別取每個(gè)皮瓣中部，面積為1 cm×0.5 cm的全層皮膚組織，固定于4%多聚甲醛。常規(guī)石蠟包埋，切片厚度5 μm。

HE染色顯示組織的基本結(jié)構(gòu)和形態(tài)，計(jì)數(shù)微血管密度：參照Weidner校正法計(jì)數(shù)微血管，在放大400倍的條件下，每例樣本檢測10個(gè)的視野，涵蓋真皮全層，分別記錄血管數(shù)，按血管數(shù)/高倍鏡視野面積(0.24 mm2)進(jìn)行計(jì)數(shù)分析[3]。免疫組化染色顯示目的分子ICAM-1和MCP-1的表達(dá)部位，采用Image-Pro 6.0軟件進(jìn)行陽性染色信號(hào)采集分析，在放大400倍的條件下，每例樣本采集10個(gè)視野，計(jì)算其陽性信號(hào)的平均光密度(optical density,OD)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

術(shù)后1 d皮瓣遠(yuǎn)端開始出現(xiàn)顏色加深、變黑，與皮瓣近端界限較模糊，觸之質(zhì)地稍硬，皮溫低，未完全壞死。第3天起，壞死部位基本確定，與近端皮瓣分界清楚，邊界不再擴(kuò)大，顏色加深，發(fā)硬，收縮，與周圍皮膚稍分離，皮瓣壞死部位形成結(jié)痂(圖2)。大約術(shù)后第14天，結(jié)痂開始脫落，露出皮下瘢痕組織。

取大鼠術(shù)后7 d皮瓣圖像，壞死部位固定后，應(yīng)用Image-pro6.0軟件計(jì)算壞死面積。皮瓣存活率=皮瓣存活表面積/皮瓣總面積×100%，實(shí)驗(yàn)組(84.6±10.8)%，對照組(79.8±11.3)%，實(shí)驗(yàn)組皮瓣存活率明顯高于對照組(n=5，t=7.299，P=0.002)。

2.2 組織學(xué)觀察及分析

與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組缺血皮瓣術(shù)后第4天有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，術(shù)后第7天炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕，術(shù)后14 d組織結(jié)構(gòu)清晰，皮下血管較豐富，炎癥細(xì)胞少見，皮肌層肌纖維排列較好。鏡下觀察計(jì)數(shù)，在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組微血管密度均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.3 ICAM-1

術(shù)后4 d在實(shí)驗(yàn)組ICAM-1的表達(dá)量明顯高于對照組；術(shù)后7 d 實(shí)驗(yàn)組ICAM-1的表達(dá)量明顯低于對照組。在創(chuàng)面修復(fù)的晚期(術(shù)后10、14 d)，2組ICAM-1的表達(dá)量未見明顯差異(圖3，表2)。

2.4 MCP-1

術(shù)后4 d實(shí)驗(yàn)組MCP-1的表達(dá)量略高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后7 d實(shí)驗(yàn)組MCP-1的表達(dá)量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在創(chuàng)面修復(fù)的晚期(術(shù)后10、14 d)，2組MCP-1的表達(dá)量未見明顯差異(圖4，表3)。

個(gè)/ mm2

OD/μm2

OD/μm2

圖1 大鼠背部缺血皮瓣模型的制備。以中線為界，在大鼠背部設(shè)計(jì)皮瓣，蒂位于尾部雙側(cè)髂棘連線上，長6 cm，寬1 cm，切開皮瓣，原位縫合 圖2 大鼠缺血皮瓣模型術(shù)后大體觀察(未照射側(cè))。A. 術(shù)后1 d皮瓣遠(yuǎn)端開始出現(xiàn)顏色加深、變黑，與皮瓣近端界限較模糊；B. 術(shù)后3 d壞死部位基本確定，與近端皮瓣分界清楚 圖3 大鼠皮瓣ICAM-1的免疫組化染色，蘇木素復(fù)染，棕黃色為陽性信號(hào)。A、B. 術(shù)后4 d對照組與實(shí)驗(yàn)組，ICAM-1在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量明顯高于對照組；C、D. 術(shù)后7 d對照組與實(shí)驗(yàn)組，ICAM-1在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量明顯低于對照組；E、F. 術(shù)后10 d對照組與實(shí)驗(yàn)組，2組的表達(dá)量未見明顯差異 ×100 圖4 大鼠皮瓣MCP-1的免疫組化染色，蘇木素復(fù)染，棕黃色為陽性信號(hào)。A、B. 術(shù)后4 d對照組與實(shí)驗(yàn)組，MCP-1在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量略高于對照組；C、D. 術(shù)后7 d對照組與實(shí)驗(yàn)組， MCP-1在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量明顯低于對照組；E、F. 術(shù)后10 d對照組與實(shí)驗(yàn)組，2組的表達(dá)量未見明顯差異 ×100

3 討論

臨床研究[2，4]表明低能量激光照射對糖尿病足、靜脈潰瘍創(chuàng)面、急性擦傷創(chuàng)面等均有一定的治療作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示機(jī)制可能是低能量激光可活化某些信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)(增加或減少)多種細(xì)胞因子和生長因子水平，進(jìn)而間接作用于創(chuàng)面，促進(jìn)其愈合[2，5，6]。19～24 J/cm2的低能量激光效應(yīng)高于能量密度設(shè)定在8.25 J/cm2以下及130 J/cm2以上的治療效應(yīng)[7]。本研究選擇21.6 J/cm2的能量密度用于促進(jìn)缺血皮瓣的創(chuàng)傷愈合。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)長寬比為6∶1的超長隨意型皮瓣，觀察其遠(yuǎn)端壞死情況，并行組織病理學(xué)檢查，分析制備的大鼠皮瓣血管形成情況及炎癥相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)情況，結(jié)果成功制備了遠(yuǎn)端缺血壞死的大鼠背部缺血皮瓣模型。

血液循環(huán)障礙被認(rèn)為是皮瓣壞死的主要原因，本研究結(jié)果表明局部照射低能量激光可以增加局部皮膚的微血管密度，術(shù)后14 d內(nèi)與對照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示促進(jìn)局部微血管形成是其作用機(jī)制之一，與Cury等[1]報(bào)道相似。弱激光還可能具有調(diào)節(jié)炎癥介導(dǎo)因子的作用[6]，從而起到促進(jìn)創(chuàng)面愈合，促進(jìn)缺血皮瓣存活的效應(yīng)。

ICAM是免疫球蛋白超家族的成員之一，內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞等均可表達(dá)ICAM-1，促炎因子能促進(jìn)其表達(dá)。ICAM-1不僅是一個(gè)白細(xì)胞黏附分子，而且通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞激活直接參與炎癥反應(yīng)[8,9]。ICAM-1在增生的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)最強(qiáng)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管生長因子及細(xì)胞外基質(zhì)是調(diào)節(jié)血管生成的3個(gè)重要因素，因此，ICAM-1促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附可能是誘導(dǎo)血管生成的起始事件[10]。本研究結(jié)果表明，半導(dǎo)體激光照射能明顯升高缺血皮瓣術(shù)后4 d ICAM-1的表達(dá)，7 d時(shí)抑制其表達(dá)，證實(shí)半導(dǎo)體激光照射具有縮短炎癥反應(yīng)期，促進(jìn)傷后早期血管生成，促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。

MCP-1屬于一種前炎癥因子，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)黏附因子，促使炎性細(xì)胞向病變部位聚集，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。其主要功能是激活和趨化單核細(xì)胞，在炎癥性疾病和新生血管形成及其損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[11]。研究[12，13]表明MCP-1在正常創(chuàng)面?zhèn)? d即可迅速達(dá)到高峰然后逐漸下降至傷前水平。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后4 d實(shí)驗(yàn)組表達(dá)水平略高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本實(shí)驗(yàn)未能檢測更早的時(shí)間點(diǎn)有關(guān)；術(shù)后7 d實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量明顯低于對照組，提示在缺血皮瓣術(shù)后的適當(dāng)時(shí)機(jī)有效控制炎性反應(yīng)，減少炎性反應(yīng)因子、趨化因子和黏附因子的表達(dá)對于皮瓣的愈合具有重要的意義。

總之，本研究證實(shí)低能量激光在大鼠創(chuàng)面愈合的早期通過促進(jìn)血管新生，促進(jìn)創(chuàng)面炎癥反應(yīng)提早啟動(dòng)并進(jìn)而提早創(chuàng)面修復(fù)過程，而后又在一定程度上抑制炎癥相關(guān)因子ICAM-1和MCP-1的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加速創(chuàng)面愈合的作用。誠然，創(chuàng)面愈合過程中，炎癥細(xì)胞及炎癥因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)錯(cuò)綜復(fù)雜，要證明低能量激光促進(jìn)缺血皮瓣創(chuàng)面愈合的確切機(jī)制仍需要深入研究探討。

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(修回日期：2016-12-22)

(責(zé)任編輯：李賀瓊)

Effects of Semiconductor Laser Local Irradiation on Expression of ICAM-1 and MCP-1 During the Healing of Ischemic Skin Flaps in Sprague-Dawley Rats

NieFangfei*,YangQingmo,XiaYouchen*,etal.

*DepartmentofPlasticSurgery,PekingUniversityThirdHospital,Beijing100083,China

XiaYouchen,E-mail:xiayouchen@sohu.com

Objective To study the mechanism of semiconductor laser local irradiation in promoting the healing of ischemic skin flap in Sprague-Dawley(SD) rats by investigating the expression of inflammatory factors of intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1). Methods Two symmetrical skin flaps were prepared at the back of a male SD rat with the pedicles located on the tail. Each flap was 6 cm in length and 1 cm in width, and the distance between the two flaps was 2 cm. One flap was treated with semiconductor laser local irradiation (once daily until specimen collection) and the other side was the control side. The self-control method was used to compare the differences between the two flaps. The survival area of flap, the vascular formation and the expressions of inflammation related molecules ICAM-1 and MCP-1 were detected respectively on the postoperative 4, 7, 10, and 14 d. Results The distal end of the skin flaps had obvious ischemic necrosis. The survival rate of flap and the microvascular density in the experimental group were significantly higher than those in the control group after the operation. On the 7th day, the survival rates of flaps in the experimental group and the control group were (84.6±10.8)% and (79.8±11.3)%, respectively. On the 4th, 7th, 10th, and 14th days, the microvessel densities (per mm2) of the experimental group (74.160±25.968, 115.937±17.827, 87.330±21.383, and 69.644±12.126) were significantly higher than those of the control group (33.460±8.310,t=3.089,P=0.037; 36.685±7.693,t=11.741,P=0.000; 43.474±7.400,t=4.185,P=0.014; 37.104±8.721,t=5.218,P=0.006). On the 4th day after operation, the expression of ICAM-1 in the experimental group (0.063±0.015) was significantly higher than that in the control group (0.045±0.017,t=8.430,P=0.001), while on the 7th day after operation, the expressions of inflammatory cytokines of ICAM-1 and MCP-1 in the experimental group (0.022±0.008 and 0.041±0.008) were significantly lower than those in the control group (0.042±0.015,t=4.309,P=0.013; 0.065±0.007,t=6.731,P=0.003). Conclusions The expression of inflammatory factors of MCP-1 and ICAM-1 during the healing of ischemic skin flap in SD rats can be regulated by semiconductor laser irradiation. This is an important mechanism to promote the healing of ischemic skin flap.

Semiconductor laser; Ischemic skin flap; Inflammation; Monocyte chemotactic protein-1; Intercellurlar cell adhesion molecule-1

，E-mail：xiayouchen@sohu.com

A

1009-6604(2017)02-0166-05

10.3969/j.issn.1009-6604.2017.02.017

2016-06-15)

①(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科，廈門 361003)