陳鵬程,李曉敏,李芳柏*(1.中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所,廣東 廣州 510640；.廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所,廣東 廣州 510650；3.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

水稻土Fe(II)氧化耦合NO3-還原的微生物變化

陳鵬程1,2,3,李曉敏2,李芳柏2*(1.中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所,廣東 廣州 510640；2.廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所,廣東 廣州 510650；3.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

利用不同馴化條件(Soil、Soil+Fe(II)、Soil+NO3-和Soil+Fe(II)+NO3-)對(duì)華南水稻土進(jìn)行中性厭氧條件下的富集培養(yǎng), 探究淹水期水稻土亞鐵(Fe(II))氧化和硝酸鹽(NO3-)還原過程,及此過程中微生物群落的變化.結(jié)果表明,在 Soil+Fe(II)處理中,亞鐵不能發(fā)生自然氧化.只有在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,Fe(II)才能被氧化成Fe(III);同時(shí),Fe(II)的存在減慢了NO3-的還原.利用高通量測(cè)序技術(shù)表征微生物群落組成隨培養(yǎng)時(shí)間的變化,結(jié)果表明, Soil+Fe(II)和Soil處理的微生物群落組成沒有顯著差異.在Soil+NO3-處理中,Pseudogulbenkiania、Flavobacterium和Rhodocyclus屬成為優(yōu)勢(shì)菌群.在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,Zoogloea、Geothrix、Sunxiuqinia和Vulcanibacillus等屬成為優(yōu)勢(shì)菌群,主要包括硝酸鹽還原菌、Fe(II)氧化菌和Fe(III)還原菌.

亞鐵氧化；硝酸鹽還原；微生物群落；水稻土；中性pH

-and Soil+Fe(II)+NO3-) at circumneutral pH under anoxic conditions. The objectives were to investigate the transformations of Fe(II) and nitrate as well as the shifts of composition and diversity of microbial communities during these processes. The results revealed that Fe(II) could not be oxidized in the treatment of Soil+Fe(II), but only be oxidized in the treatment of Soil+Fe(II)+NO3-. Meanwhile, the presence of Fe(II) slowed down the NO3

-reduction. Illumina high throughput sequencing was used to profile the diversity and abundance of microbial communities over time. The results showed that no significant difference of microbial communities between treatments of Soil+Fe(II) and Soil. Pseudogulbenkiania, Flavobacterium and Rhodocyclus gradually became the dominant genera in the treatment of Soil+NO3

-. Zoogloea, Geothrix, Sunxiuqinia and Vulcanibacillus were the most abundant genera in the treatment of Soil+Fe(II)+NO3-, which was a mixture of nitrate reducers, Fe(II) oxidizers and Fe(III) reducers. Key words：Fe(II) oxidation；nitrate reduction；microbial community；paddy soil；circumneutral pH

鐵元素是地殼中含量第 4高的變價(jià)金屬元素[1].鐵的生物地球化學(xué)循環(huán)過程耦合其他元素的氧化還原過程,對(duì)碳、氮和重金屬等元素的轉(zhuǎn)化有重要的影響[2-4].鐵在天然環(huán)境中多數(shù)以不溶態(tài) Fe(III)氧化物的形式存在.微生物驅(qū)動(dòng)的Fe(II)氧化和 Fe(III)還原可以發(fā)生在厭氧環(huán)境中[5].厭氧環(huán)境中鐵氧化還原過程主要是由鐵相關(guān)微生物群落所驅(qū)動(dòng)的,包括Fe(II)氧化菌和Fe(III)還原菌[6].其中,硝酸鹽依賴型亞鐵氧化微生物可以利用厭氧環(huán)境中的硝酸鹽作為電子受體,在有機(jī)物質(zhì)存在的情況下氧化 Fe(II),從而影響著環(huán)境中Fe元素和N元素的循環(huán)[7].

目前,大部分關(guān)于 Fe(II)氧化耦合硝酸鹽還原過程及其微生物的研究,主要關(guān)注從環(huán)境中分離純化出來的純菌,并探究其亞鐵成礦機(jī)制[8].混合培養(yǎng)主要集中在淡水底泥環(huán)境中[9],這個(gè)過程是由多種不同微生物共同完成的.然而,關(guān)于稻田環(huán)境中的 Fe(II)氧化耦合硝酸鹽還原過程,以及其中的微生物群落組成的研究還很少[10-11].

水稻土是一個(gè)由干濕交替引起的好氧-厭氧反復(fù)交替的生態(tài)系統(tǒng),水稻土含鐵量高達(dá)100～200 μmol/cm3[12],因此在淹水期時(shí) Fe(III)還原和 Fe(II)氧化過程均能發(fā)生[13].此外,水稻土系統(tǒng)受人為活動(dòng)干擾大,碳和氮的輸入與積累量高,因此厭氧條件下Fe(II)氧化耦合硝酸鹽還原過程也是有可能發(fā)生的.最近,關(guān)于水稻土在厭氧條件下發(fā)生的Fe(II)氧化和硝酸鹽還原過程及其微生物群落組成變化初有報(bào)道,并發(fā)現(xiàn) Azospira、Zoogloea和 Dechloromonas 等屬是此過程中的優(yōu)勢(shì)微生物[14].深入了解由水稻土微生物引起的Fe(II)氧化耦合硝酸鹽還原過程,有利于揭示此過程中的微生物機(jī)制,并可為調(diào)控水稻土環(huán)境中鐵-氮循環(huán)提供科學(xué)依據(jù).本研究采用花崗巖發(fā)育的華南水稻土作為研究對(duì)象,分別添加Fe(II)、NO3

-以及Fe(II)+NO3-對(duì)其富集培養(yǎng).研究水稻土在中性 pH厭氧條件下 Fe(II)氧化耦合NO3

-還原的動(dòng)力學(xué)變化過程,探討不同富集處理中微生物群落組成的動(dòng)態(tài)變化.

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)和樣品處理

實(shí)驗(yàn)用的水稻土于2014年采集自廣州市中國 科 學(xué) 院 華 南 植 物 園 (23°10'38.26"N, 113°21'10.12"E).水稻土樣品采集自表層以下10cm深度,放置于冰盒0℃保存帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行富集培養(yǎng),水稻土pH值為5.8,總鐵含量為23g/kg,有機(jī)碳量為35g/kg,水解N為287mg/kg.

本次的孵育水稻土所采用的培養(yǎng)基配方如下:緩沖液采用 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)-buffer(30mmol/L, pH 7.0),含有10mmol/L硝酸鹽作為電子受體,5mmol/L乙酸鹽作為電子供體,中性鹽(0.68mmol/L CaCl2, 1.03mmol/L KH2PO4, 2.03mmol/L MgCl2和5.14mmol/L NaCl),微量元素(1mL/L,)維生素溶液(1mL/L)和硒-鎢溶液(1mL/L).孵育體系分裝于125mL西林瓶,參照之前的報(bào)道[10]100mL緩沖液體系加入 1g水稻土.培育試驗(yàn)開始前,所有西林瓶都采用高壓蒸汽滅菌(121℃, 20min).為了最大限度的防止氧氣對(duì)FeCl2氧化,FeCl2溶液的配置方式如下:10mL的去離子水用氮?dú)?99.99%)鼓吹25min,加入 9.9g FeCl2配成 1mol/L濃度的母液.500μL 1mol/L FeCl2溶液轉(zhuǎn)移至每個(gè) 125mL西林瓶(西林瓶培養(yǎng)基預(yù)先鼓吹氮?dú)?5min除氧),繼續(xù)鼓吹氮?dú)?10min后,壓橡膠蓋和鋁蓋封緊,Fe2+離子的終濃度為 5mmol/L.樣品模擬采樣實(shí)際溫度置于厭氧培養(yǎng)箱中(30±0.5)℃避光靜置培養(yǎng),每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù).每隔2d取樣,西林瓶搖勻后吸取2mL懸濁液用于Fe濃度測(cè)定,再取約5mL上清液用于硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨的含量測(cè)定、余下的樣品經(jīng) 10000r/min離心后收集沉淀用于DNA提取.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為4個(gè)處理組:(1) Soil; (2) Soil+NO3-; (3) Soil+Fe(II); (4) Soil+Fe(II)+NO3-. Soil+Fe(II)+NO3

-體系第2d開始有氣泡從沉積在瓶底的水稻土中逐漸滲出,水稻土的顏色也由黑色逐漸轉(zhuǎn)化為棕黃色,表明經(jīng)過2d的Fe-N富集,反應(yīng)體系中的Fe2+發(fā)生氧化,并釋放出氣體產(chǎn)物,這也表明了反應(yīng)體系中的優(yōu)勢(shì)微生物經(jīng)過調(diào)整之后開始發(fā)揮作用.

1.2 檢測(cè)方法

硝酸鹽和亞硝酸鹽用離子色譜進(jìn)行定量檢測(cè)(ICS-90, Dionex, US),陰離子交換柱的型號(hào)是IonPac AS14A 4×250mmol/L.為了防止Fe2+離子進(jìn)入陰離子柱與淋洗液(濃度8:1的碳酸鈉/碳酸氫鈉)發(fā)生反應(yīng)生成 Fe(III)沉淀而堵塞了陰離子柱,樣品在打入機(jī)器前必須經(jīng)過以下處理.樣品取出后經(jīng)過離心(10000r/min),上清液經(jīng)過鈉離子交換柱,去除所有殘留的 Fe2+或者 Fe3+,再用0.22μm濾膜過濾.

N2O 用氣相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)(GC-7900, Techcomp, China).用1mL注射器吸取西林瓶頂空氣體1mL直接注射進(jìn)氣相色譜儀的進(jìn)樣口進(jìn)行檢測(cè)[15].銨的檢測(cè),采用納氏試劑比色法,檢測(cè)的波段在420nm[16].HCl浸提態(tài)Fe(III)和溶解態(tài)Fe(II)的檢測(cè),使用 1,10-鄰菲洛林比色法在510nm波段進(jìn)行比色檢測(cè)[17].1.3 DNA的提取和PCR擴(kuò)增

對(duì)于水稻土各個(gè)處理的總DNA提取采用土壤試劑盒(PowerSoilTM, MO BIO)按照說明書的使用步驟操作,提取出來的DNA儲(chǔ)存在-45℃冰箱.細(xì)菌和古細(xì)菌的16S rRNA V4區(qū)的特異性擴(kuò)增使用515F正向引物,806R反向引物(帶有一個(gè)12bp的標(biāo)簽).每個(gè)DNA樣品都是用50μL體系進(jìn)行擴(kuò)增,設(shè)置 3個(gè)平行樣.擴(kuò)增條件如下:95 ℃5min,變性(94℃ 0.5min),退火(50 ℃ 1min),延伸(72 ℃ 1min),最終的延伸溫度72 ℃ 7min.最終得到一個(gè)約470bp長度的片段,并用一個(gè)QIA快速膠回收試劑盒(Qiagen, Chatsworth, CA, US)進(jìn)行純化.所有的PCR產(chǎn)物都按照均一的分子比例混合成為一管樣品.樣品采用 IIluminaMiseq PE(paired end)250bp進(jìn)行測(cè)序.每個(gè)樣品均做 3個(gè)重復(fù).

1.4 高通量測(cè)序分析方法

由于IIlumina測(cè)序技術(shù)在序列末端(3’端)呈現(xiàn)明顯的質(zhì)量下降,為了保持?jǐn)?shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,必須對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)價(jià)并進(jìn)行質(zhì)量篩選.對(duì)測(cè)序序列(成對(duì).fastq)使用 fastqc軟件評(píng)價(jià)數(shù)量和質(zhì)量,并利用perl腳本進(jìn)行質(zhì)量控制,去除低質(zhì)量的堿基.用 Mothur將兩端拼成一個(gè)完整片段后,利用Mothur和 Quantitative Insights Into Microbial Ecology(QIIME)進(jìn)行流程化分析.利用 Uclust在16S的 97%序列相似度水平上分類 Operational taxonomic units (OTUs).在每個(gè)OTUs所屬的序列里,抽取出一條作為代表序列.將代表序列和已知的比對(duì)好的原核生物16S rRNA基因進(jìn)行匹配,并用 FastTree做以 OTU為單位的系統(tǒng)發(fā)育樹.使用Ribosomal Database Project(RDP)數(shù)據(jù)庫在80%的可信度水平上進(jìn)行分類,并進(jìn)行物種注釋,了解物種來源.建立 OTU表格后,根據(jù)序列信息和物種分類信息,將樣品中的序列劃分到不同的分類等級(jí),即門(phylum),綱(class),目(order),科(family),屬(genus).相對(duì)豐度用 R語言的 Scale Function功能進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化.即一個(gè)樣品在某個(gè)分類水平上的標(biāo)準(zhǔn)化值為該樣品在某個(gè)分類上的相對(duì)豐度和所有樣品在該分類的相對(duì)豐度平均值的差除以所有樣品在該分類上的標(biāo)準(zhǔn)差所得到的值,本文的結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)化以后的值在-1～3之間.序列被隨機(jī)挑取用來計(jì)算 alpha 多樣性和beta多樣性.

2 結(jié)果和討論

2.1 Fe元素的轉(zhuǎn)化

圖1 (A)溶解態(tài)Fe(II)和(B)鹽酸浸提態(tài)Fe(III)濃度變化Fig.1 Transformations of (A) dissolved Fe(II), (B) HCl-extractable Fe(III)

如圖 1所示,土壤自身含有＜0.2mmol/L的Fe(III)背景值(即Soil處理),且溶解態(tài)Fe(II)和鹽酸浸提態(tài)Fe(III)濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的推移沒有發(fā)生明顯的變化.Soil+NO3-處理中溶解態(tài)Fe(II)和鹽酸浸提態(tài) Fe(III)與 Soil處理相比沒有明顯差異.在Soil+Fe(II)處理中,溶解態(tài) Fe(II)濃度沒有發(fā)生明顯變化,這說明土壤中原有的成分在厭氧條件下不能引發(fā) Fe(II)氧化.在 Soil+Fe(II)+NO3-體系里,培養(yǎng)前2d就有60%的溶解態(tài)Fe(II)被氧化,在第4d時(shí)有 90%的 Fe(II)被氧化;同時(shí),檢測(cè)到0.5mmol/L的鹽酸浸提態(tài)Fe(III),說明大部分生成的Fe(III)轉(zhuǎn)化成礦物,而沒辦法被0.5M鹽酸溶解.

2.2 N元素的轉(zhuǎn)化

如圖 2所示,在 Soil和 Soil+Fe(II)處理中, NO3-、NO2-和N2O的含量均低于儀器檢測(cè)限,但可以檢測(cè)到約0.08mmol/L的NH4+背景值.NH4+濃度在Soil和Soil+Fe(II)處理中隨時(shí)間逐漸降低,表明NH4+可能被土壤中的微生物吸收利用.

圖2 (A) NO3-, (B)NO2-, (C)N2O和(D)NH4+的濃度變化Fig.2 Transformations of (A)NO3-, (B)NO2-, (C) N2O and (D)NH4+

在 Soil+Fe(II)+NO3-和 Soil+NO3-體 系里,NO3-的濃度均隨時(shí)間推移而逐步減少,Fe(II)的存在減慢了硝酸鹽的還原.這可能和 Fe(II)生成 Fe(III)后,和 NO-產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)有關(guān)[18].NO-33在厭氧條件下的還原主要是硝酸鹽還原菌的作用[10],其對(duì) NO3-的還原代謝可以分為 2條途徑:反硝化途徑(NO3-→NO2-→NO→N2O→N2)和異化硝酸鹽還原途徑(NO3-→NO2-→NH4+)[12],其中NO2-均是這2個(gè)途徑的第一個(gè)中間產(chǎn)物.培養(yǎng)第2d時(shí),在Soil+Fe(II)+NO3-和Soil+NO3-體系里,分別檢測(cè)到約1.4mmol/L和1.7mmol/L的NO2-,隨后這2個(gè)處理的NO2-濃度均逐漸減少.在Soil+ Fe(II)+NO3-體系里,在微生物的作用下,Fe(II)除了可以跟NO3-發(fā)生反應(yīng)(如方程(1)所示)以外,還可以和NO2-發(fā)生化學(xué)反應(yīng),如方程(2)所示.

在培養(yǎng)的前4d里,Soil+Fe(II)+NO3-和Soil+NO3-的 N2O生成量的上升趨勢(shì)幾乎一致.第 4d之后,在 Soil+NO3-體系中,N2O濃度在達(dá)到峰值后隨時(shí)間逐漸減少,N2O是微生物反硝化過程的中間產(chǎn)物,其濃度的減少有可能是反硝化過程的進(jìn)一步進(jìn)行導(dǎo)致的.而在Soil+Fe(II)+NO3-體系里,培養(yǎng)第4d后N2O濃度則保持一個(gè)平穩(wěn)的狀態(tài),根據(jù)反應(yīng)式(1),這有可能是Fe(II)與NO2-的化學(xué)反應(yīng)生成N2O所導(dǎo)致的.

在 Soil+NO3-和 Soil+Fe(II)+NO3-體系里, NH4+濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的推移逐步提高,表明異化硝酸鹽還原成銨(DNRA)過程的發(fā)生.在Soil+NO3-體系里,與 N2O的生成量相比,NH4+的生成量較低,推測(cè)反硝化途徑在硝酸鹽還原過程中的貢獻(xiàn)要大于異化硝酸鹽還原途徑,這和之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類似[9].根據(jù)已測(cè)得的 NO-、3NO2-、N2O和NH4+結(jié)果進(jìn)行簡(jiǎn)單的氮平衡加減計(jì)算,可推算出 Soil+NO-和 Soil+Fe(II)+NO-體33系分別最多可生成6.51mmol/L和5.72mmol/L的NX(包括:NO和N2),再加上已測(cè)到的N2O生成量,可推測(cè) Fe(II)的存在減慢了反硝化途徑.此外,NH4+是自然環(huán)境中較易被生物吸收利用的氮素,DNRA過程是土壤氮儲(chǔ)存的過程[19].在 Soil+ Fe(II)+NO-體系里,NH+的生成量比 Soil+NO-343體系里的要高,表明 Fe(II)的存在促進(jìn)了 DNRA過程的發(fā)生,也增加了氮的儲(chǔ)存.

2.3 微生物群落在門水平上的動(dòng)態(tài)變化

圖3 基于16S rDNA高通量測(cè)序的不同處理微生物群落在門水平上相對(duì)豐度隨反應(yīng)時(shí)間的變化情況(＞1%)(D表示天數(shù))Fig.3 Relative abundance (%) of the dominant microbial phyla (＞1%) with time dependence in different treatments revealed by 16S rDNA Illumina high-throughput sequencing (D means day)

如圖3所示,原始土壤中(D0),Chloroflexi的相對(duì)豐度最高(10%),其相對(duì)豐度在Soil處理中隨時(shí)間推移波動(dòng)很小(7.5%～11%),此外 Deltaproteobacteria (11%～15%)和 Betaproteobacteria(7.9%～14%)的相對(duì)豐度也較高.在 Soil+Fe(II)體系中,門水平的變化趨勢(shì)(除了 D2以外)和 Soil處理區(qū)別不大, Deltaproteobacteria(9.4%～16%)、Betaproteobacteria (11%～12%)和 Chloroflexi (5.1%～11%)等幾個(gè)優(yōu)勢(shì)門類同樣處于一個(gè)比較穩(wěn)定的水平.這說明,在不添加 NO3-作為電子受體的條件下,添加 Fe(II)并不能改變水稻土微生物門水平上的群落組成.

在 Soil+NO3-和 Soil+Fe(II)+NO3-體系中, Betaproteobacteria的相對(duì)豐度在培養(yǎng)第2d就上升到74%以上,成為絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)群落,且其變化趨勢(shì)在2個(gè)處理中也幾乎一致(圖3).除此之外,在Soil+NO3-和 Soil+Fe(II)+NO3-體系中的優(yōu)勢(shì)菌群分別是Deltaproteobacteria(26%～35%)和 Acidobacteria (2.7%～13%).這說明 NO3-的添加會(huì)促進(jìn)Betaproteobacteria和Deltaproteobacteria這2個(gè)門的微生物的生長,而 Fe(II)的加入還能刺激Acidobacteria這個(gè)門的微生物的生長.

2.4 微生物群落在屬水平上的動(dòng)態(tài)變化

在 Soil體系,相對(duì)豐度較高的屬有: Belliinea、Thermodefovibrio、Geobacter和Pseudobenkiania等屬,其含量隨培養(yǎng)時(shí)間推移保持相對(duì)穩(wěn)定,含量分別在4.1%～6.6%、4.0%～ 5.2%、2.7%～6.3%,0.9%～1.4%之間波動(dòng)(圖 4).由此可見,自然土壤在沒有人為添加 Fe(II)或 NO3-的厭氧體系里,其微生物群落的組成結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯的變化.其中,Geobacter[20]和Pseudogulbenkiania等屬[21]分別屬于Fe(III)還原菌和硝酸鹽依賴型Fe(II)氧化菌,由此可見,在碳酸鹽發(fā)育的富含鐵的華南水稻土中,鐵相關(guān)細(xì)菌的相對(duì)豐度處于一個(gè)較高的水平.在 Soil+Fe(II)體系,優(yōu)勢(shì)微生物群落同樣以Geobacter (1.1%～7.6%)、 Bellilinea(2.9%～6.7%)、 Thermodesulfovibrio(1.9%～4.8%)和Pseudogulbenkiania(1.1%～2.2%)等屬為主(圖 4).這說明,水稻土在淹水期時(shí),如果沒有有效的電子受體(如:NO3-)存在,即使存在高濃度 Fe(II),微生物群落也不會(huì)發(fā)生明顯的變化.

圖4 基于16S rDNA高通量測(cè)序的不同處理的微生物群落在屬水平上相對(duì)豐度隨反應(yīng)時(shí)間的變化情況 (D表示天數(shù))Fig.4 Relative abundance (%) of the dominant microbial genera (＞1%) with time dependence in different treatments revealed by 16S rDNA Illumina high-throughput sequencing (D means day)

在 Soil+NO3-體 系,培 養(yǎng) 第 2d 時(shí)Pseudogulbenkiania和Rhodocyclus 等屬成為優(yōu)勢(shì)菌群,其相對(duì)豐度分別提高到34.5%和17.2%.隨后,Bdellovibrio和Flavobacterium 等屬的相對(duì)豐度隨時(shí)間推移逐漸增加,到培養(yǎng)第8d時(shí),其相對(duì)豐度分別為32.8%和3.9%.其中, Pseudogulbenkiania、 Rhodocyclus和Flavobacterium等屬均具有硝酸鹽還原功能[22],這與體系中存在較高濃度NO3-有關(guān).盡管 Soil+NO3-處理中相對(duì)豐度較高的細(xì)菌和Soil+Fe(II)+NO3-的處理有一定的重合性,但優(yōu)勢(shì)菌群還是存在明顯的區(qū)別,表明 Fe(II)的存在對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群仍然起到一定的篩選作用.

在Soil+Fe(II)+NO3-體系,第2d時(shí)Azovibro、Azonexus和Zoogloea 等屬的相對(duì)豐度分別增加到4%、4%和20.7%,其中Azovibro和Azonexus屬于固氮菌屬[23],而 Zoogloea等屬于亞鐵氧化菌

[10].在第4d時(shí),這3種細(xì)菌的相對(duì)豐度有所下降,但 Azospira(1.4%)和 Vulcanibacillu(2.6%)等屬的相對(duì)豐度逐漸上升,前者是硝酸鹽依賴型亞鐵氧化菌[10].后者屬于硝酸鹽還原菌[24].硝酸鹽還原菌還原硝酸鹽所生成的亞硝酸根,可以跟 Fe(II)發(fā)生非生物的化學(xué)氧化反應(yīng)(反應(yīng)式1)[25-26].所以,在 Soil+Fe(II)+NO3-體系中所檢測(cè)到的硝酸鹽還原菌對(duì)亞鐵的氧化也存在潛在的貢獻(xiàn).在第6d時(shí),盡管2株硝酸鹽依賴型亞鐵氧化菌Zoogloea和Azospira等屬仍處于較高相對(duì)豐度(分別為 14.0%和 1.2%),但 Fe(III)還原菌Geothrix[27]、硝酸鹽還原菌 Rhodocyclus[28]和Sunxiuqinia[29]等屬已成為優(yōu)勢(shì)菌群,其相對(duì)豐度分別達(dá)到9.1%,11.1%和1.9%.到第8d時(shí),優(yōu)勢(shì)菌群分別是 Rhodocyclus(24.1%)、Zoogloea (12.2%)和 Geothrix(11.2%)等屬.由于培養(yǎng)第 4d時(shí),約 90%的 Fe(II)已經(jīng)被氧化(圖 1),因此推測(cè)Fe(III)的積累有可能激活了鐵還原菌,發(fā)生Fe(III)的還原溶解,導(dǎo)致培養(yǎng)第6、8d時(shí)Fe(III)濃度有所下降.在本研究的 4個(gè)處理中,均沒有檢測(cè)到相對(duì)豐度超過 1%的厭氧氨氧化菌(如:Candidatus Scalindua和Candidatus kuenina stuttgartiensis等屬),所以可以排除厭氧氨氧化作用的存在.

圖5 根據(jù)不同處理16S rRNA高通量測(cè)序所獲得的微生物群落的Beta多樣性Fig.5 Beta diversities of microbial communities from different treatments based on 16S rRNA Illumina high-throughput sequencing

2.5 Beta多樣性分析

如圖5所示,Soil+Fe(II)和Soil處理相比,微生物群落結(jié)構(gòu)的差異不明顯,表明單純添加Fe(II)不能有效改變土壤的微生物群落結(jié)構(gòu).Soil+ Fe(II)+NO3

-、Soil+NO3-和Soil+Fe(II) 3種不同處理所富集的微生物群落組成在物種水平上呈現(xiàn)出明顯的差異,尤其是 Soil+Fe(II)+NO3-和 Soil+ NO3-2個(gè)處理之間的差異,說明 Fe(II)的加入能有效改變硝酸鹽還原菌的群落結(jié)構(gòu)組成.在人為添加NO3-的 2個(gè)體系中(即 Soil+NO3-和 Soil+ Fe(II)+NO3-),優(yōu)勢(shì)微生物均為硝酸鹽還原菌.盡管硝酸鹽還原菌是廣泛存在于自然界中,并且其可以通過反應(yīng)式(1～2)間接地耦合 Fe(II)氧化過程,使人無法確認(rèn)微生物直接介導(dǎo)的亞鐵氧化過程的貢獻(xiàn)[30].然而 Fe(II)的加入還是能夠顯著改變硝酸鹽還原菌的種類和豐度,表明這些具有Fe(II)氧化功能(不管是直接或者間接介導(dǎo))的硝酸鹽還原菌是有區(qū)別于其他的硝酸鹽還原菌的.以上結(jié)果,加深了人們對(duì)厭氧中性水稻土中驅(qū)動(dòng)硝酸鹽還原與亞鐵氧化耦合過程的優(yōu)勢(shì)微生物的了解,有助于理解整個(gè)水稻生態(tài)系統(tǒng)中鐵循環(huán)和氮循環(huán)之間的關(guān)系.

3 結(jié)論

3.1 在中性厭氧水稻土中,Fe(II)在 Soil+Fe(II)體系中不能發(fā)生氧化,只有在Soil+Fe(II)+NO3-體系中 Fe(II)才能發(fā)生氧化;在 Soil+NO3-體系中, NO3-可以在 4d內(nèi)被還原 72%,在 Soil+Fe(II)+ NO3-處理中 Fe(II)的存在減緩了 NO3-的還原.NO3-的還原主要經(jīng)過反硝化途徑完成,少部分經(jīng)過異化硝酸鹽還原途徑生成NH4+. 3.2 Soil+NO3-和 Soil+Fe(II)+NO3-體系的優(yōu)勢(shì)微生物,在門水平上差異不明顯,但在屬水平上差異顯著.

3.3 Soil+ NO3-體系中的優(yōu)勢(shì)菌群以Pseudogulbenkiania、Flavobacterium和Rhodocyclus等屬為主.

3.4 Soil+ Fe(II)+NO3-體系中優(yōu)勢(shì)微生物群落由第0～2d的Azovibro、Azonexus和Zoogloea等屬逐漸變成第 6～8d的 Zoogloea、Geothrix、Sunxiuqinia和Vulcanibacillus等屬.

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Shifts of microbial communities during Fe(II) oxidation coupled to nitrate reduction in paddy soil.

CHEN Peng-cheng1,2,3*, LI Xiao-min2, LI Fang-bai2*
(1.Guangzhou Institute of Geochemistry, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510640, China；2.Guangdong Institute of Eco-Environmental and Soil Sciences, Guangzhou 510650, China；3.Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China). China Environmental Science, 2017,37(1)：358～366

A paddy soil which was collected from South China was cultivated in different treatments (Soil, Soil+Fe(II), Soil+NO3

X172

A

1000-6923(2017)01-0358-09

陳鵬程(1986-),男,廣東汕頭人,中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所博士研究生,主要從事土壤微生物環(huán)境生態(tài)研究.

2016-05-08

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41330857) * 責(zé)任作者, 研究員, cefbli@soil.gd.cn