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鐵蛋白基因Fth1的克隆及其在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)

2017-02-22 06:51:31劉偉朱修良李清海
生物技術(shù)通報(bào) 2017年2期
關(guān)鍵詞:報(bào)告基因鐵蛋白充質(zhì)

劉偉朱修良李清海

(1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所,杭州 310021;2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院放射科,杭州 310009)

鐵蛋白基因Fth1的克隆及其在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)

劉偉1朱修良2李清海2

(1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所,杭州 310021;2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院放射科,杭州 310009)

旨在構(gòu)建編碼大鼠鐵蛋白重鏈多肽1(ferritin heavy chain 1,F(xiàn)th1)的慢病毒,并檢測(cè)其在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(RMSC)中的表達(dá)。PCR擴(kuò)增大鼠Fth1基因,克隆至pLenti-GFP-C慢病毒表達(dá)載體,包裝慢病毒,感染RMSC細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)GFP熒光情況,Western blot檢測(cè)Fth1的表達(dá)情況,WST-1試劑檢測(cè)Fth1慢病毒感染組(RMSC-Fth1)和空載體組(RMSC-GFP)的細(xì)胞增殖活性。DNA測(cè)序結(jié)果表明,pLenti-GFP-C-Fth1慢病毒載體構(gòu)建成功。包裝慢病毒感染RMSC細(xì)胞后,熒光顯微鏡下可見明顯綠色熒光,表明感染成功。Western blot結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞裂解液中可檢測(cè)到特異的Fth1表達(dá)條帶。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,與空載體組相比,過表達(dá)Fth1并不影響RMSC細(xì)胞生長。成功構(gòu)建并包裝攜帶大鼠Fth1基因的慢病毒,其能夠成功感染RMSC細(xì)胞并表達(dá)Fth1蛋白,且對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響。

Fth1;磁共振報(bào)告基因;慢病毒載體;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

核磁共振成像(MRI)由于具有很高的空間分辨率和軟組織對(duì)比,能夠靈活、無創(chuàng)地觀察被MR,對(duì)比劑標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞在體內(nèi)的遷移、分化及增殖情況[1-5],已成為當(dāng)前活體檢測(cè)和干細(xì)胞移植監(jiān)測(cè)研究的熱點(diǎn)。目前使用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體探針(轉(zhuǎn)鐵蛋白-單晶氧化鐵超微粒、抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體-單晶氧化鐵超微粒)標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行MRI 觀察,存在一定的缺陷[6-8],因此,迫切需要發(fā)展一種新的標(biāo)記方法,實(shí)現(xiàn)MRI 技術(shù)對(duì)活體標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行長期監(jiān)測(cè)。鐵蛋白可以作為MRI 分子影像學(xué)研究的報(bào)告分子。除標(biāo)記后的細(xì)胞移植不存在近期和遠(yuǎn)期毒副作用外,其對(duì)細(xì)胞活性、功能、增殖能力、分化能力、凋亡率和氧自由基生成情況均無明顯改變,引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注[9-13]。鐵蛋白儲(chǔ)存了機(jī)體鐵含量的20%-30%,其由重鏈蛋白和輕鏈蛋白兩個(gè)亞基構(gòu)成,二者的編碼基因分別定位于不同染色體[14]。研究表明,重鏈蛋白(ferritin heavy chain 1,F(xiàn)TH1)是鐵蛋白行使功能的主要亞單位,含有鐵氧化酶活性中心,負(fù)責(zé)鐵離子的氧化和整合[15]。目前已經(jīng)有成功的案例,分別在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞[16]、人乳腺癌細(xì)胞[17]和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞D1細(xì)胞系[18]中成功表達(dá)Fth1報(bào)告基因。另一方面,通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)移植可明顯改善腎病患者的腎臟功能,但BMSCs 移植后,必須明確移植細(xì)胞的遷移、成活和分化狀態(tài),以確認(rèn)其對(duì)疾病癥狀緩解的貢獻(xiàn)[19]。本研究通過構(gòu)建攜帶大鼠Fth1基因的慢病毒,感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(RMSC),體外觀察Fth1的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞生存及增殖的影響,旨為進(jìn)一步研究移植細(xì)胞的活體示蹤奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞RMSC和HEK 293T細(xì)胞購自ScienCell生物公司。

1.1.2 目的基因、慢病毒載體及慢病毒包裝系統(tǒng) 大鼠Fth1基因由省心科技有限公司合成。慢病毒載體pLenti-GFP-C(含有GFP報(bào)告基因和C-端HA標(biāo)簽)及慢病毒包裝系統(tǒng)由南京愛必夢(mèng)公司提供。

1.1.3 主要試劑 引物合成和測(cè)序委托擎科生物有限公司完成。限制性內(nèi)切酶和T4連接酶為NEB公司產(chǎn)品。DNA Marker、小鼠抗HA標(biāo)簽單克隆抗體及HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗購自abm生物公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)為Gibco公司產(chǎn)品。2 × super HIFI-MIX II,DNA膠回收試劑盒,WST-1細(xì)胞增殖試劑盒購自Sigma公司。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1購自全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠Fth1基因序列及擴(kuò)增 根據(jù)從NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得的Rattus norvegicus ferritin heavy chain 1,mRNA序列(Fth1,GenBank:NM_012848.2),人工合成其cDNA序列,以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用正向引物為Fth1F:5'-CAGTGTGGTGGCCTGCAGGTGAATTCG CCACCATGACCACCGCGTCTCCCTC-3'(下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn)),反向引物為Fth1R:5'-CTTGCT CACCATCTCGAGTTTTCTAGAGCTCTCATCACCGTG TCCCAG-3'(下劃線為Xho I酶切位點(diǎn))。PCR擴(kuò)增體系為:模板1 μL,上下游引物各1 μL,2×super HIFI-MIX II 25 μL,滅菌的雙蒸水20 μL。PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸60 s,共32個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。

1.2.2 慢病毒載體構(gòu)建 大鼠Fth1 PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化回收,與慢病毒載體pLenti-GFP-C分別經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切、膠回收,獲得帶有黏性末端的目的片段及載體,16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1中,將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布含卡那霉素(50 μg/mL)抗性的LB固體培養(yǎng)基平板篩選,37℃,過夜培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化子用Fth1F、Fth1R引物進(jìn)行菌落PCR,挑取擴(kuò)增出目的大小片段的轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒后使用EcoR I和Xba I雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序,正確的重組質(zhì)粒命名為pLenti-GFP-C-Fth1。

1.2.3 慢病毒包裝和滴度測(cè)定 將重組慢病毒質(zhì)粒pLenti-GFP-C-Fth1或空載體質(zhì)粒pLenti-GFP-C及包裝質(zhì)粒進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提后共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞,獲得攜帶大鼠Fth1基因的重組慢病毒,以及作為對(duì)照的空載體慢病毒,并采用逐孔稀釋法測(cè)定病毒滴度。

1.2.4 RMSC細(xì)胞的培養(yǎng)及感染 RMSC細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中。感染前一天,將細(xì)胞鋪于24孔板中,每孔10 000個(gè)細(xì)胞/500 μL。培養(yǎng)24 h后,分別用Fth1慢病毒及空載體慢病毒以不同的MOI值感染RMSC細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)2-6 d。觀察細(xì)胞形態(tài)及綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 使用Western blot檢測(cè)驗(yàn)證FTH1在RMSC細(xì)胞中的表達(dá)情況。收獲病毒感染(MOI=100)的RMSC細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,HA一抗(1∶1 000)和FTH1細(xì)胞溶液(1∶500)4℃孵育過夜,TBST(TBS + 0.1% Tween 20)洗膜3次后二抗(1∶100 000)室溫孵育1 h,徹底洗膜后使用ECL發(fā)光試劑顯影,曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 細(xì)胞增殖檢測(cè) 將RMSC細(xì)胞以5 000細(xì)胞/100 μL/孔的密度鋪于96孔板,分別使用Fth1慢病毒(RMSC-Fth1)及空載體慢病毒(RMSC-GFP)進(jìn)行感染后繼續(xù)培養(yǎng)3 d。每天觀察細(xì)胞生長情況。感染后第3天,每孔加入10 μL的WST試劑,繼續(xù)孵育30 min,1 h和4 h,分別在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用酶標(biāo)儀在OD450nm下測(cè)量各孔光密度值。

2 結(jié)果

2.1 pLeni-GFP-C-Fth1載體的構(gòu)建及鑒定

大鼠Fth1基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析后,在500-600 bp之間有一條特異性條帶,大小與目的基因長度相符(圖1)。產(chǎn)物經(jīng)純化、EcoR I和Xba I雙酶切后,與含有相同黏性末端的pLeni-GFP-C載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1,通過菌落PCR篩選陽性克隆。提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證(圖2),切下的小片段與Fth1基因PCR產(chǎn)物大小吻合,而大片段與pLeni-GFP-C載體的長度吻合,說明基因片段與載體正確連接。進(jìn)一步經(jīng)DNA測(cè)序確定連入的基因片段正確無誤,慢病毒載體構(gòu)建成功。

圖1 PCR擴(kuò)增大鼠Fth1結(jié)果

圖2 pLeni-GFP-C-Fth1載體酶切電泳圖

2.2 慢病毒包裝及滴度測(cè)定

將慢病毒質(zhì)粒pLenti-GFP-C-Fth1或空載體質(zhì)粒pLenti-GFP-C及包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞,獲得攜帶大鼠Fth1基因的重組慢病毒,以及作為對(duì)照的空載體慢病毒。采用逐孔稀釋法測(cè)定病毒滴度約為3×108TU/mL。

2.3 慢病毒感染RMSC細(xì)胞以及目的基因表達(dá)的檢測(cè)

2.3.1 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá) 分別將Fth1重組慢病毒和空載體慢病毒以不同MOI值感染RMSC細(xì)胞。感染后72 h,熒光顯微鏡下觀察顯示RMSC細(xì)胞內(nèi)可見明顯的綠色熒光(圖3),表明慢病毒成功感染RMSC細(xì)胞。MOI=100時(shí),細(xì)胞毒性相對(duì)較小并可取得較滿意的感染效果,感染陽性率>80%。

2.3.2 Western blot檢測(cè)Fth1蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果(圖4)顯示,與空載體慢病毒感染細(xì)胞相比,F(xiàn)th1重組慢病毒感染細(xì)胞在42 kD處檢測(cè)到特異條帶。該條帶與目的蛋白FTH1的預(yù)計(jì)分子量(21.2 kD)不符,但正好為其2倍,推測(cè)可能是FTH1蛋白形成了二聚體。

圖3 熒光顯微鏡觀察慢病毒感染RMSC細(xì)胞72 h后綠色熒光蛋白表達(dá)情況

圖4 Western blot檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中Fth1表達(dá)

2.4 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)顯示,鋪板后72 h,與空載體對(duì)照組相比,F(xiàn)th1慢病毒感染并未影響細(xì)胞增殖,加入WST-1試劑后30 min、1 h及4 h時(shí)的吸光度測(cè)量結(jié)果均無顯著差異。30 min內(nèi)感染與未感染的細(xì)胞增殖速度有所不同,隨著時(shí)間延長,1 h和4 h之間含有Fth1基因的慢病毒對(duì)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞增殖無顯著影響。

圖5 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

3 討論

IgA 腎病是慢性腎小球腎炎中最常見的一種類型,在我國約占腎活檢患者總數(shù)的40%-47%[20,21]。Herrera和Qian等[22,23]的研究表明,BMSCs 參與了腎臟損傷的修復(fù),為IgA腎病的治療提供了新的策略。本研究的主要目的就是選擇鐵蛋白作為報(bào)告基因,將鐵蛋白和GFP修飾的BMSCs移植到IgA腎病模型鼠體內(nèi),以期未來通過磁敏感加權(quán)成像(SWI)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)干細(xì)胞在腎臟區(qū)域的分布、增殖及分化情況;同時(shí)通過相位值的測(cè)定來評(píng)估BMSCs在體內(nèi)的增殖情況,為干細(xì)胞移植治療效果的長期隨訪評(píng)估提供一種無創(chuàng)性的影像學(xué)手段。

以往大部分研究主要集中在Fth1報(bào)告基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)[24-28],在干細(xì)胞中進(jìn)行重鏈蛋白表達(dá)的研究很少,在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中目前還未見報(bào)道。在實(shí)驗(yàn)前期,我們采用了腺病毒感染的方式進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染,但是只有血清型4和8有陽性信號(hào),且感染陽性率僅為5%。而使用慢病毒大大提高了感染效率。Pereira等[18]研究了兩種報(bào)告基因鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在小鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞中過表達(dá)對(duì)細(xì)胞鐵的平衡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fth1基因的過表達(dá),在鐵含量供應(yīng)不足的情況下,影響了鐵的平衡,導(dǎo)致了細(xì)胞的表型發(fā)生變化。而本實(shí)驗(yàn)表明,在大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞中過表達(dá)Fth1,正常培養(yǎng)條件下對(duì)于細(xì)胞的形態(tài)、活力及生長增殖均無顯著影響。至于過表達(dá)的Fth1在RMSC中的聚鐵能力以及所聚集的鐵離子對(duì)細(xì)胞的影響,還需要進(jìn)一步的研究。雖然鐵蛋白作為內(nèi)源性報(bào)告基因具有不可比擬的優(yōu)勢(shì),但是轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)特性如BMSC的成骨、成軟骨、成脂誘導(dǎo)分化情況的影響,都還需要進(jìn)行考慮。此外,利用MRI對(duì)動(dòng)物體內(nèi)成像顯示的條件也需做更多的探索,這些都為以后采用SWI取代傳統(tǒng)的T2*WI 進(jìn)行在體標(biāo)記干細(xì)胞的示蹤研究,以期提高標(biāo)記干細(xì)胞檢出的敏感性和進(jìn)行定量分析提供了技術(shù)條件和奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究使用慢病毒感染系統(tǒng),構(gòu)建了含有GFP標(biāo)簽的Fth1基因表達(dá)載體,并在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中成功表達(dá)了核磁報(bào)告基因Fth1;明確了Fth1基因轉(zhuǎn)染BMSC時(shí)不影響細(xì)胞的形態(tài)和正常增殖,完全可以用于后續(xù)細(xì)胞分化及細(xì)胞移植研究。

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(責(zé)任編輯 馬鑫)

Cloning of Ferritin Gene Fth1 and Its Expression in the Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells of Rat

LIU Wei1ZHU Xiu-liang2LI Qing-hai2
(1. Institute of Plant Protection and Microbiology,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021;2. Department of Radiology,the Second Affiliated Hospital,College of Medical Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310009)

Aims are to construct a lentivirus encoding rat ferritin heavy chain 1(Fth1)and to detect its expression in rat bone mesenchymal stem cells(RMSCs). The rat Fth1 gene was amplified by PCR and cloned into the lentivirus expression vector pLenti-GFP-C. The lentivirus carrying pLenti-GFP-C-Fth1 or empty vector was then packaged in HEK 293T cells,by which the RMSCs were infected. GFP expression was observed under a fluorescence microscope. Fth1 expression was detected by Western blot. WST-1 reagent was used to analyze the proliferation of infected cells(RMSC-Fth1)and empty vector(RMSC-GFP). Results of DNA sequencing showed that the pLenti-GFP-CFth1 lentivirus expression vector was successfully constructed. After RMSCs were infected by the packaged lentivirus,GFP was observed under a fluorescence microscope,indicating the infection was achieved. A specific band of Fth1 in the lysate of Fth1-lentivirus infected cells(RMSCFth1)was detected by Western blot. Cell proliferation assay showed that the growth of RMSC was not affected by overexpressing Fth1 compared with RMSC-GFP. As conclusion,the recombinant lentivirus vector carrying rat Fth1 gene was successfully constructed,infected RMSC as expected,and expressed FTH1 protein even without significant impacts on the cell proliferation.

Fth1;MRI reporter;lentivirus vector;rat bone mesenchymal stem cell

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.026

2016-10-11

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY15H180004),浙江省公益項(xiàng)目(2015C32020)

劉偉,男,博士,研究方向:分子生物學(xué);E-mail:biolwei@sina.com

李清海,男,博士,研究方向:分子影像學(xué);E-mail:liqinghai1978@163.com

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