高薇薇，張青，馮佳，黃芳，王偉，張曙

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001)

宮頸鱗癌組織中跨膜受體蛋白Notch3的表達(dá)變化及其意義

高薇薇，張青，馮佳，黃芳，王偉，張曙

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001)

目的 觀察宮頸鱗癌組織中跨膜受體蛋白Notch3的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 收集宮頸鱗癌組織石蠟標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)的正常宮頸組織石蠟標(biāo)本各116例、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ+Ⅱ級(jí)病灶石蠟標(biāo)本53例及CINⅢ級(jí)病灶石蠟標(biāo)本41例，采用免疫組化法檢測(cè)各標(biāo)本中的Notch3，分析Notch3表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 宮頸鱗癌組織、正常宮頸組織、CIN Ⅲ級(jí)組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級(jí)組織中Notch3的陽(yáng)性表達(dá)率分別為52.6%、21.6%、43.9%和41.5%，宮頸鱗癌組織中Notch3的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常宮頸組織、CIN Ⅲ級(jí)組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級(jí)組織，CIN Ⅲ級(jí)組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級(jí)組織中Notch3的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常宮頸組織(P均<0.01)。Notch3表達(dá)與宮頸鱗癌肌層浸潤(rùn)深度、組織分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。Notch3表達(dá)陽(yáng)性者和Notch3表達(dá)陰性者中位生存期分別為43、62.3個(gè)月，兩者相比，P<0.05。Notch3表達(dá)陽(yáng)性者1年生存率為93.4%、3年生存率為60.7%、5年生存率為31.1%，Notch3表達(dá)陰性者分別為98.2%、83.6%、60.0%，二者1、3、5年生存率相比，P均<0.05。結(jié)論 宮頸鱗癌組織中Notch3陽(yáng)性表達(dá)率升高，Notch3表達(dá)與腫瘤肌層浸潤(rùn)深度、組織分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，Notch3可能參與了宮頸鱗癌的發(fā)生及發(fā)展。

宮頸癌；宮頸鱗癌；跨膜受體蛋白；Notch3；Notch信號(hào)通路；宮頸上皮內(nèi)瘤變

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)呈現(xiàn)發(fā)病年輕化趨勢(shì)。鱗癌是宮頸癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型[1]。早期宮頸鱗癌患者預(yù)后較好，手術(shù)治療、放化療、免疫治療及中醫(yī)藥治療等方式有助于延長(zhǎng)患者生命，故宮頸鱗癌的早期診斷意義重大[2]。跨膜受體蛋白Notch信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用是近年研究的熱點(diǎn)，現(xiàn)已證實(shí)Notch信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等過(guò)程[3]。Notch3是Notch受體家族的重要成員，廣泛存在于多種組織細(xì)胞中。本研究觀察了宮頸鱗癌組織中Notch3的表達(dá)變化，探討Notch3與宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及與宮頸鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 宮頸鱗癌組織標(biāo)本及其來(lái)源 收集南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2009年1月～2010年12月獲取并留存的宮頸鱗癌組織石蠟標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)的正常宮頸組織石蠟標(biāo)本各116例，宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ+Ⅱ級(jí)病灶石蠟標(biāo)本53例及CIN Ⅲ級(jí)病灶石蠟標(biāo)本41例。宮頸鱗癌標(biāo)本來(lái)源病例均為原發(fā)病例，術(shù)前未經(jīng)過(guò)放化療、免疫治療或中藥治療。宮頸鱗癌患者年齡27～74歲，年齡<46歲61例、≥46歲55例；97例患者術(shù)后采取單純放療、放化療聯(lián)合治療、免疫治療或中藥治療，19例患者術(shù)后未采取輔助治療。CIN Ⅰ+Ⅱ級(jí)患者年齡26～69歲，<49歲31例、≥49歲22例。CIN Ⅲ級(jí)患者年齡29～77歲，<47歲19例、≥47歲22例。所有病例均具有完整的臨床病理資料，隨訪(fǎng)日期截止至2015年12月31日，所有患者均獲得隨訪(fǎng)。

1.2 宮頸鱗癌組織中Notch3的檢測(cè) 采用免疫組化EnVision法，所有標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片；切片經(jīng)70 ℃烘烤45 min，二甲苯脫蠟，檸檬酸修復(fù)液(pH 6.0)高溫高壓修復(fù)20 min，30%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加一抗(兔抗人Notch3多克隆抗體，1∶200)，冰箱內(nèi)4 ℃過(guò)夜，滴加二抗；DAB顯色，復(fù)染，0.1%鹽酸酒精分化，脫水，封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。Notch3可定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核，陽(yáng)性染色表現(xiàn)為細(xì)胞核出現(xiàn)黃色至棕黃色細(xì)小顆粒。在每張切片選取具有代表意義的5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)250個(gè)細(xì)胞。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度綜合判定結(jié)果：陽(yáng)性細(xì)胞百分比<5%計(jì)0分，5%～<25%計(jì)1分，25%～<50%計(jì)2分，50%～<75%計(jì)3分，≥75%計(jì)4分；染色強(qiáng)度為淺黃色或無(wú)色計(jì)0分，黃色計(jì)1分，深棕色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；上述兩項(xiàng)得分乘積為0～6判定為Notch3無(wú)或低表達(dá)(即陰性)，7～12判定為Notch3高表達(dá)(即陽(yáng)性)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。做Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)進(jìn)行預(yù)后分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸鱗癌組織中Notch3的表達(dá)變化 宮頸鱗癌組織、正常宮頸組織、CIN Ⅲ級(jí)組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級(jí)組織中Notch3的陽(yáng)性表達(dá)率分別為52.6%(61/116)、21.6%(25/116)、43.9%(18/41)和41.5%(22/53)，宮頸鱗癌組織中Notch3的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常宮頸組織、CIN Ⅲ級(jí)組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級(jí)組織，CIN Ⅲ級(jí)組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級(jí)組織中Notch3的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常宮頸組織(P均<0.01)。

2.2 Notch3表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Notch3表達(dá)與宮頸鱗癌肌層浸潤(rùn)深度、組織分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、腫瘤最大徑無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 Notch3表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 Notch3表達(dá)與宮頸鱗癌預(yù)后的關(guān)系 Notch3表達(dá)陽(yáng)性者中位生存期為43個(gè)月，Notch3表達(dá)陰性者中位生存期為62.3個(gè)月，兩者相比，P<0.05。Notch3表達(dá)陽(yáng)性者1年生存率為93.4%、3年生存率為60.7%、5年生存率為31.1%，Notch3表達(dá)陰性者分別為98.2%、83.6%、60.0%，二者1、3、5年生存率相比，P均<0.05(見(jiàn)圖1)。

圖1 Notch3表達(dá)與宮頸鱗癌患者生存時(shí)間的關(guān)系

3 討論

宮頸鱗癌的發(fā)生是多種因素、多基因參與的過(guò)程，宮頸鱗癌預(yù)后影響因素很多，治療效果并不十分理想[4]。因此，尋找宮頸鱗癌的特異性治療靶點(diǎn)意義重大。Notch信號(hào)通路是近年討論的熱點(diǎn)。Notch信號(hào)通路是哺乳動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的信號(hào)通路，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Notch受體與配體結(jié)合后可發(fā)生活化，活化的Notch受體直接轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合，激活靶基因，此過(guò)程不依賴(lài)第二信使的信號(hào)通路發(fā)揮作用，具有自身特殊性。但由于Notch信號(hào)通路中含有多個(gè)受體與配體，激活Notch同時(shí)可激活其他多種信號(hào)通路[5,6]。Notch信號(hào)通路在腫瘤及神經(jīng)退行性變發(fā)病、免疫功能調(diào)控、胚胎發(fā)育、血管生成等病理生理過(guò)程中起著重要作用[7,8]。由Notch基因編碼的Notch受體在細(xì)胞分化進(jìn)程中起整體協(xié)調(diào)作用，在細(xì)胞發(fā)育成熟后則呈現(xiàn)低水平表達(dá)。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，Notch受體是在細(xì)胞表面表達(dá)的Ⅰ型跨膜蛋白，主要含有Notch1、2、3、4四個(gè)亞型。其中，Notch3最早在增生的神經(jīng)上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，19號(hào)染色體易位往往會(huì)導(dǎo)致Notch3過(guò)表達(dá)。Notch3與Notch家族其他成員存在高度相似性，但在結(jié)構(gòu)上有所差異，主要是其胞內(nèi)段的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(TAD)較其他成員明顯縮短，因此，Notch3的轉(zhuǎn)錄激活性能相對(duì)較弱[3]。

目前，多項(xiàng)研究[9～11]發(fā)現(xiàn)Notch3涉及人類(lèi)多種實(shí)體腫瘤的生成過(guò)程，如非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、食管鱗癌、急性T淋巴細(xì)胞白血病、卵巢漿液性癌等。研究[12,13]發(fā)現(xiàn)Notch1能誘導(dǎo)HIF-1表達(dá)，調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成，促進(jìn)NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移。Ohashi等[14～16]的研究結(jié)果顯示，特異性阻斷Notch3表達(dá)后NSCLC細(xì)胞增殖受到明顯限制，推測(cè)機(jī)制是腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑的敏感性增強(qiáng)，減少腫瘤細(xì)胞中MAPK磷酸化水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Liu等[17]發(fā)現(xiàn)食管鱗癌細(xì)胞中Notch3呈高表達(dá)，Notch3參與誘導(dǎo)鱗狀細(xì)胞分化和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。學(xué)者們?cè)陉P(guān)于急性T淋巴細(xì)胞白血病的研究[18]和關(guān)于卵巢漿液性癌的研究[19]中也得出了類(lèi)似結(jié)論。還有研究[20,21]發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細(xì)胞株OVCA429中，激活Notch3能激活Slug、Snail信號(hào)通路，降低E-鈣黏蛋白表達(dá)，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。我們推測(cè)在宮頸鱗癌組織中的Notch3陽(yáng)性率可能同樣增加，Notch3表達(dá)與宮頸鱗癌患者的預(yù)后可能存在一定關(guān)聯(lián)。

本研究分別檢測(cè)了宮頸鱗癌、CIN Ⅰ+Ⅱ級(jí)病灶、CIN Ⅲ級(jí)病灶及正常宮頸組織中的Notch3，結(jié)果顯示，宮頸鱗癌組織中Notch3的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常宮頸組織、CIN Ⅲ級(jí)組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級(jí)組織，CIN Ⅲ級(jí)組織及CIN Ⅰ+Ⅱ級(jí)組織中Notch3的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常宮頸組織，Notch3表達(dá)與宮頸鱗癌肌層浸潤(rùn)深度、組織分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示Notch3可能參與了宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步分析顯示，Notch3表達(dá)陽(yáng)性者中位生存期短于Notch3表達(dá)陰性者，Notch3表達(dá)陽(yáng)性者1、3、5年生存率小于Notch3表達(dá)陰性者，提示Notch3的表達(dá)預(yù)示著宮頸鱗癌患者預(yù)后不良，可能是由于Notch3促進(jìn)了上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，具體機(jī)制待進(jìn)一步證實(shí)。

盡管已有許多研究對(duì)宮頸鱗癌的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行闡述，但仍未有重大突破。結(jié)合本研究結(jié)果，我們認(rèn)為，Notch3可能有癌基因的性質(zhì)，其高表達(dá)與宮頸鱗癌的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)，Notch3有望作為宮頸鱗癌潛在的治療靶點(diǎn)。

[1] 張國(guó)楠.重視子宮頸癌嗜神經(jīng)侵襲的基礎(chǔ)與臨床病理研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2015,50(12):923-925.

[2] Sadalla JC, Andrade JM, Genta ML, et al. Cervical cancer: what′s new[J]. Rev Assoc Med Bras(1992), 2015,61(6):536-542.

[3] Chitnis A, Balle-Cuif L. The Notch meeting: an odyssey from structure to function[J]. Development, 2016,143(4):547-553.

[4] Rechberger T, Perzylo K, Miotla P, et al. Carcinoma of the cervical stump--multicenter study[J]. Ginekol Pol, 2014,85(6):435-440.

[5] Sun JJ, Wang ZY, Li LS,et al. Prevention against diffuse spinal cord astrocytoma: can the Notch pathway be a novel treatment target[J]. Neural Regen Res,2015,10(2):244-251.

[6] Mori M, Mahoney JE, Stupnikov MR, et al. Notch3-Jagged signaling controls the pool of undifferentiated airway progenitors[J]. Development, 2015,142(2):258-267.

[7] Pakkiriswami S, Couto A, Nagarajan U, et al. Glycosylated Notch and Cancer[J]. Front Oncol, 2016(6):37.

[8] Rutten-Jacobs LC, Traylor M, Adib-Samii P, et al. Common NOTCH3 Variants and Cerebral Small-Vessel Disease[J]. Stroke, 2015,46(6):1482-1487.

[9] Gripp KW, Robbins KM, Sobreira NL, et al. Truncating mutations in the last exon of NOTCH3 cause lateral meningocele syndrome[J]. Am J Med Genet A , 2015,167(2):271-281.

[10] Zhu Y, Wang J, Wu Y, et al. Two novel mutations in NOTCH3 gene causes cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcritical infarct and leucoencephalopathy in two Chinese families[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(2):1321-1327.

[11] Jamal M, Chogle SM, Karam SM, et al. NOTCH3 is expressed in human apical papilla and in subpopulations of stem cells isolated from the tissue[J]. Genes Dis, 2015,2(3):261-267.

[12] 姜昕,周建華,鄧征浩,等.Notch1, Jagged1和VEGF蛋白在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)及其意義[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007,32(6):1031-1036.

[13] Cheng Z, Tan Q, Tan W, et al. Cigarette smoke induces the expression of Notch3, not Notch1, protein in lung adenocarcinoma[J]. Oncol Lett, 2015,10(2):641-646.

[14] Ohashi S, Natsuizaka M, Yashiro-Ohtani Y, et al. NOTCH1 and NOTCH3 coordinate esophageal squamous differentiation through a CSL-dependent transcriptional network[J]. Gastroenterology, 2010,139(6):2113-2123.

[15] Arasada RR, Amann JM, Rahman MA, et al. EGFR blockade enriches for lung cancer stem-like cells through Notch3-dependent signaling[J]. Cancer Res, 2014,74(19):5572-5584.

[16] Ye YZ, Zhang ZH, Fan XY, et al. Notch3 overexpression associates with poor prognosis in human non-small-cell lung cancer[J]. Med Oncol, 2013,30(2):595.

[17] Liu J, Fan H, Ma Y, et al. Notch1 is a 5-fluorouracil resistant and poor survival marker in human esophagus squamous cell carcinomas[J]. PLoS One, 2013,8(2):e56141.

[18] Indraccolo S, Minuzzo S, Masiero M, et al. Cross-talk between tumor and endothelial cells involving the Notch3-Dll4 interaction marks escape from tumor dormancy[J]. Cancer Res, 2009,69(4):1314-1323.

[19] Park JT, Li M, Nakayama K, et al. Notch3 gene amplification in ovarian cancer[J]. Cancer Res, 2006,66(12):6312-6318.

[20] Gupta N, Xu Z, El-Sehemy A, et al. Notch3 induces epithelial-mesenchymal transition and attenuates carboplatin-induced apoptosis in ovarian cancer cells[J]. Gynecol Oncol, 2013,130(1):200-206.

[21] Ohashi S, Natsuizaka M, Naganuma S, et al. A NOTCH3-mediated squamous cell differentiation program limits expansion of EMT-competent cells that express the ZEB transcription factors[J]. Cancer Res, 2011,71(21):6836-6847.

張曙(E-mail: tdfyzs@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.022

R737.33

B

1002-266X(2017)03-0070-03

2016-08-12)