饒金鵬　邱楓　蔡益婷

【摘要】 目的：通過比較密度梯度離心法（density-gradient centrifugation，DGC）、上游法（swim-up，SU）和簡單洗滌法（simple washing， SW）處理不同質(zhì)量精液標(biāo)本的效果，優(yōu)選出最合適的宮腔內(nèi)人工授精（Intrauterine insemination，IUI）精液洗滌方法。方法：選取男科實(shí)驗(yàn)室行精液常規(guī)檢查的患者中收集精液量≥3 mL的精液標(biāo)本90份，其中精子濃度<15×106/mL的少精癥患者精液標(biāo)本23份，濃度與活力正常（濃度≥15×106/mL，PR≥32%且PR+NP≥40%）的精液標(biāo)本67份，每份精液標(biāo)本各取3個(gè)1 mL分別用密度梯度離心法、上游法和簡單洗滌法處理。通過不同方法的洗滌處理，比較各組精子洗滌前后的濃度、活力（PR）及回收率。結(jié)果：3種處理方法洗滌后的PR較洗滌前均有顯著提高（P<0.05）；在處理后的精子濃度方面，簡單洗滌法處理要顯著高于其余兩類方法（P<0.05）；在處理后的PR和活率（PR+NP）方面，密度梯度離心法和上游法又要高于簡單洗滌法（P<0.05）；在回收率方面，密度梯度離心法和簡單洗滌法則顯著高于上游法組（P<0.05）。結(jié)論：在處理少精癥患者精液標(biāo)本時(shí)，上游法因其較低的回收率不適宜被采用；當(dāng)精子濃度<15×106/mL且精子總數(shù)小于正常值（39×106個(gè)）時(shí)，為保證處理后最終前向精子總數(shù)>10×106個(gè)，精子標(biāo)本不適合過多次數(shù)的洗滌處理，宜采用簡單洗滌法；而只有當(dāng)精液體積較大時(shí)，在保證IUI精子終濃度的同時(shí)，密度梯度離心法較簡單洗滌法能更好地去除白細(xì)胞和不成熟生殖細(xì)胞等雜質(zhì)，而更適宜被采用；在處理濃度活力正常精液標(biāo)本時(shí)，密度梯度離心法和上游法較之簡單洗滌法能獲得更高的精子活力（P<0.05）而更適宜被采用；同時(shí)，密度梯度離心法因較之上游法具有更高的回收率（P<0.05），且具備操作易標(biāo)準(zhǔn)化和操作時(shí)間短等特點(diǎn)而更具實(shí)用價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 密度梯度離心法； 上游法； 簡單洗滌法； 少精癥； IUI

【Abstract】 Objective：To select the most appropriate IUI sperm washing methods through comparative analysis of density-gradient centrifugation，swim-up and simple washing processing different quality of semen specimen.Method：90 semen specimens （semen volume≥3 mL）from laboratory of andrology were obtained.Among them，23 semen specimens were obtained from oligospermatism patients（sperm concentration<15×106/mL），the other 67 semen specimens were obtained from normal men（sperm concentration≥15×106/mL，PR≥32%，PR+NP≥40%）.Each semen sample were taken with 1 mL for processing by density gradient centrifugation，swim-up and simple washing methods respectively.80% and 40% pure ception were used in density-gradient centrifugation.Sperm concentration，motility and recovery rate were compared before and after treatment by the three methods.Result：Sperm motility（PR） increased obviously after treated by all the three methods（P<0.05）.Sperm concentration after treated by simple washing was significantly higher than other two methods（P<0.05）.PR after treated by density-gradient centrifugation and swim-up were significantly higher than simple washing（P<0.05）.Sperm recovery rate after treated by density-gradient centrifugation and simple washing were significantly higher than swim-up（P<0.05）.Conclusion：Swim-up is not suitable for oligospermatism patients for its low sperm recovery rate.When sperm concentration<15×106/mL and total semen count<39×106，we choose simple washing to ensure that final sperm count>10×106 and avoid frequently washing.When semen volume is large enough，for density-gradient centrifugation can reduce leukocyte and immaturity cell better than simple washing，it is more appropriate be selected.When PR and concentration are normal，density-gradient centrifugation and swim-up are both better than simple washing.However，for sperm recovery rate of density-gradient centrifugation is higher than swim-up，and it is easier be standardized and cost less time for operation，the density-gradient centrifugation is the more appropriate method for IUI.

【Key words】 Density-gradient centrifugation； Swim-up； Simple washing； Oligospermatism； IUI

First-authors address：The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou 310052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.01.017

宮腔內(nèi)人工授精（Intrauterine insemination，IUI）因具有低侵入性、操作簡單、并發(fā)癥少、費(fèi)用低等特點(diǎn)而成為諸多輔助生殖技術(shù)（Assisted reproductive technology，ART）中最為常用的助孕方式之一，但一直以來，其成功率始終不高[1-6]。影響IUI成功率的因素很多，如男方精液參數(shù)、女方年齡、IUI授精時(shí)間選擇等，但其中精子體外優(yōu)選因可達(dá)到去除精液中的精漿、細(xì)胞碎片、病原微生物等有害物質(zhì)的目的而成為影響結(jié)局的最為重要環(huán)節(jié)之一。常用的精液體外處理方法有密度梯度離心法、上游法和簡單洗滌法，3類方法各有利弊，其能達(dá)到的洗滌效果和ART妊娠結(jié)局報(bào)道也不盡相同[7-10]。本研究根據(jù)精液標(biāo)本的質(zhì)量將其分為少精組（精子濃度<15×106/mL）和正常組，分別用3類方法對(duì)其進(jìn)行處理，通過比較來決定特定條件下采取何種方法行IUI最為適宜。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源及分組 本研究中精液標(biāo)本均來自2014年12月-2016年6月在本院生殖醫(yī)學(xué)中心及泌尿外科就診，選取男科實(shí)驗(yàn)室行精液常規(guī)檢查的患者中收集精液量≥3 mL的精液標(biāo)本90份，其中精子濃度<15×106/mL精液標(biāo)本23份為少精組，濃度與活力正常（濃度≥15×106/mL，PR≥32%且PR+NP≥40%）的精液標(biāo)本67份為正常組。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 標(biāo)準(zhǔn)垂直凈化工作站（蘇州智凈SW-CJ-1FD），恒溫培養(yǎng)箱（美國THERMO 3111），高速離心機(jī)（美國THERMO SL16R），相差顯微鏡（日本OLYMPUS CX31），Markler計(jì)數(shù)板（以色列SELF-MEDICAL），彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)（北京偉力WLJY-9000），精子洗滌液（美國SIGMA EBSS，Lot：RNBD2487），精子密度梯度液（美國SAGE Pure Ception 40%，80%，Lot：16100229）。

1.3 精液處理方法

1.3.1 密度梯度離心法 將1 mL 80%的密度梯度液加入離心管底部，輕柔得將1 mL 40%的密度梯度液加在液面上，再將1 mL液化混勻的精液小心加在40%的密度梯度液液面上，離心600 r/min×

20 min后棄上清，加入5 mL洗滌液吹打混勻后離心200 r/min×5 min，洗滌步驟再重復(fù)一遍后將精子沉淀重懸于0.5 mL培養(yǎng)液中。

1.3.2 上游法 將液化混勻的1 mL精液置于試管底部，輕柔得在液面上方加入1.2 mL洗滌液，將試管傾斜45°，置37 ℃培養(yǎng)箱孵育60 min，輕輕將試管恢復(fù)直立后，將最上層1 mL液體轉(zhuǎn)移到另一支試管，再加入2 mL洗滌液吹打混勻，離心200 r/min×10 min，棄上清后將精子沉淀重懸于0.5 mL培養(yǎng)液中。

1.3.3 簡單洗滌法 將液化混勻的1 mL精液加入試管并與1 mL洗滌液充分混勻，離心200 r/min×10 min，小心吸出上清液后將沉淀重懸于1 mL培養(yǎng)液再次離心200 r/min×10 min，棄上清，將精子沉淀重懸于

0.5 mL培養(yǎng)液中。

1.4 精液分析方法 處理前液化完全的精子原液及3種方法處理后充分混勻且于37 ℃培養(yǎng)箱放置30 min的精子懸液各取10 μL，置于Markler計(jì)數(shù)板中央，蓋上蓋板，將顯微鏡總放大倍數(shù)調(diào)至200倍，借助CASA精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)計(jì)算精子濃度和活力。再根據(jù)公式：精子回收率=洗滌后活動(dòng)精子總數(shù)/洗滌前活動(dòng)精子總數(shù)×100%=（洗滌后精液體積×洗滌后精子濃度×洗滌后精子活動(dòng)率）/（洗滌前精液體積×洗滌前精子濃度×洗滌前精子活動(dòng)率）×100%計(jì)算出最終的回收率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

不論是精子濃度<15×106/mL的少精癥精液標(biāo)本，還是濃度與活力正常的精液標(biāo)本，用3種處理方法洗滌后，精子的活力（PR）和活率（PR+NP）都得到了顯著的提高（P<0.05）；在濃度方面，簡單洗滌法要顯著高于其余兩類方法（P<0.05）；在處理后的PR和PR+NP方面，密度梯度離心法和上游法又要高于簡單洗滌法（P<0.05）；在回收率方面，密度梯度離心法和簡單洗滌法則顯著高于上游法（P<0.05）。見表1。

3 討論

精子體外分離技術(shù)的目的是獲得盡可能多的活動(dòng)精子，且盡可能去除死精、白細(xì)胞和細(xì)菌等雜質(zhì)，去除有毒或活性氧類物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS），同時(shí)具備操作易標(biāo)準(zhǔn)化和快速等特點(diǎn)[11-13]。但當(dāng)前，很難找到一項(xiàng)技術(shù)能同時(shí)滿足上述所有要求，因此，為達(dá)到最佳的處理效果，應(yīng)根據(jù)精液質(zhì)量的不同選擇最合適的處理方法。本研究根據(jù)精子質(zhì)量的不同，將精液標(biāo)本分為少精組（精子濃度<15×106/mL）和濃度活力正常組，并分別用密度梯度離心法、上游法和簡單洗滌法對(duì)其進(jìn)行處理。結(jié)果顯示，不論是少精組還是正常組標(biāo)本，在精子的回收率上，上游法處理組只有30%左右，遠(yuǎn)低于其余兩種處理方法的70%，這一結(jié)論與先前的研究一致[3，8，14]。根據(jù)WHO人類精液實(shí)驗(yàn)操作手冊第5版的要求，進(jìn)行IUI洗滌后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)不少于10×106個(gè)，而本實(shí)驗(yàn)中上游法處理

1 mL少精癥精子的前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)只有（1～1.5）×106，遠(yuǎn)不能達(dá)到要求，故不適宜選用。而當(dāng)精子濃度<15×106/mL且精子總數(shù)小于正常值（39×106個(gè)）時(shí)，采用密度梯度離心法也很難使最終精子總數(shù)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，故宜采用簡單洗滌法進(jìn)行處理，只有當(dāng)精液體積足夠大時(shí)，密度梯度離心法較之簡單洗滌法能更好地去除白細(xì)胞和不成熟生殖細(xì)胞等雜質(zhì)，而更適宜被采用。在處理濃度活力正常精液標(biāo)本時(shí)，密度梯度離心法和上游法的處理后精子活力（PR）及活率（PR+NP）均要顯著高于簡單洗滌法，且簡單洗滌法不能充分洗脫精液中的白細(xì)胞、細(xì)菌和死精子等雜質(zhì)，產(chǎn)生的氧自由基會(huì)對(duì)精卵的結(jié)合造成不利的影響[15-18]，因此，在處理正常精液標(biāo)本時(shí)選用前兩種方法較為合適。但密度梯度離心法和上游法之間比較，何種更適用于宮腔內(nèi)人工授精至今尚無定論。李濤等[19]對(duì)無明顯臨床異質(zhì)性的各研究用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)上游法與梯度離心法相比，在周期妊娠率、流產(chǎn)率、精子密度、精子活力4項(xiàng)測量指標(biāo)上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。汪存利等[20]通過比較2種方法發(fā)現(xiàn)，在處理濃度與活力正常精液標(biāo)本時(shí)，上游法處理后的精子濃度顯著低于密度梯度離心法，但活力卻要顯著高于后者。但鄧俊耀等[14]通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)2種方法在洗滌后精子活力方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而密度梯度離心法在洗滌后精子密度及回收率上都要明顯高于上游法組。本研究顯示，密度梯度離心法和上游法處理濃度活力正常的精液標(biāo)本都能獲得較好的精子活力（80%～90%）。但上游法主要依賴于活動(dòng)精子在培養(yǎng)液中的運(yùn)動(dòng)能力，而一部分有潛在運(yùn)動(dòng)能力的精子可能被由多層細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)包裹而難以到達(dá)與培養(yǎng)基接觸的界面，且細(xì)胞團(tuán)內(nèi)精子與細(xì)胞碎片或白細(xì)胞接觸易產(chǎn)生高水平ROS而降低精子功能[11]，這些因素都導(dǎo)致在精子回收率方面上游法要低于密度梯度離心法，加之后者具備操作易標(biāo)準(zhǔn)化和操作時(shí)間短等特點(diǎn)，因此，筆者認(rèn)為在此情況下，密度梯度離心法更具實(shí)用價(jià)值。

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（收稿日期：2016-09-02） （本文編輯：周亞杰）