宋子杰 孫鑫鵬 王 妍 韓先杰 （青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 山東 青島 266109）

豬鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗

宋子杰 孫鑫鵬 王 妍 韓先杰*（青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 山東 青島 266109）

為了確定某豬場仔豬死亡的主要病原菌，分析該病原菌的耐藥性，本試驗對病死豬進行剖檢，并從肺臟、脾臟中分離到一株細菌，隨后進行分離菌形態(tài)觀察、生化試驗、細菌16S rRNA基因測序與藥敏試驗。結果表明該株分離菌為革蘭氏陽性鏈狀球菌，生化試驗結果與鏈球菌的生化試驗結果大致相符；細菌的16S rRNA基因序列經(jīng)Blast同源性比較，與豬鏈球菌(GenBank CP007497.1)同源性為99%；藥敏試驗結果表明該株分離菌對氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類多種藥物敏感。細菌分離鑒定和藥敏試驗的結果為豬場發(fā)生該病時藥物治療提供參考依據(jù)。

豬鏈球菌 分離鑒定 藥敏試驗

豬鏈球菌病是由多種不同群的鏈球菌引起不同臨診類型的傳染病的總稱，臨床上引起豬鏈球菌病的主要是豬鏈球菌[1-3]。2016年8月，青島某豬場65日齡左右的仔豬突然發(fā)生死亡。經(jīng)調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，病豬生前的精神狀態(tài)、食欲無明顯異?！，F(xiàn)場對部分病死豬進行尸體剖檢，病死豬的解剖病變大致相同，主要表現(xiàn)為心包積液、混有黃色膠凍樣滲出物；肺部腫脹、淤血；肝臟腫脹、淤血；脾臟明顯腫大、淤血，顏色呈藍紫色。發(fā)病已持續(xù)

20d左右，造成5頭仔豬死亡，給養(yǎng)殖場造成較大的經(jīng)濟損失。為探明病因，進一步做好該病的防治工作，本文對病死仔豬進行了病原菌分離鑒定與藥敏試驗，以期為豬場用藥治療該病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源 青島市某豬場送檢的病死仔豬，無菌采集病變明顯的肺臟、肝臟。

1.1.2 主要試劑 PCR試劑(10×PCR Buffer、dNTPs、Ex Taq酶)、DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；腦心浸液培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司；通用型柱式基因組提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；藥敏紙片、細菌微量發(fā)酵管購自杭州濱和微生物試劑有限公司；綿羊鮮血瓊脂平板(80ml/L)為青島農(nóng)業(yè)大學山東省預防獸醫(yī)學重點實驗室自制。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離 無菌取病死豬的肺、脾組織，劃線接種于綿羊鮮血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h，觀察細菌生長特性。挑取單個菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，觀察細菌的形態(tài)。

1.2.2 生化試驗 挑取單個分離菌接種于細菌微量發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察、記錄生化反應結果。

1.2.3 16S rRNA基因的PCR擴增 按照通用型柱式基因組提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA。參照文獻報道的方法合成一對用于擴增細菌16S rRNA基因序列的通用引物[4]，上游引物：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；下游引物：5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT -3′，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。以基因組DNA為模板進行PCR反應，PCR反應體系(50μl)包括：DNA模板2.0 μl，上、下游引物各2.0μl，Ex Taq酶1.0μl，dNTP 4.0μl，10×PCR Buffer5.0μl，去離子水34.0μl。PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1.5min，擴增32個循環(huán)；72℃延伸7min，4℃終止反應。PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測序 將純化的PCR擴增產(chǎn)物送交寶生物工程(大連)有限公司測序，利用NCBI的BLAST工具將分離菌的16S rRNA的基因序列進行同源性比對。

1.2.5 動物試驗 將分離菌的純培養(yǎng)物接種于已滅菌的腦心浸液培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)18～24h，并計算活菌數(shù)。選取3只健康ICR小白鼠，每只腹腔注射菌液0.2ml (1.8×108CFU/ml)；另取3只體重相近的健康ICR小白鼠，每只腹腔注射等量滅菌腦心浸液。小鼠攻毒后連續(xù)觀察7d，記錄其臨床癥狀及死亡情況。

1.2.6 藥敏試驗 參照Kirby-Bauer瓊脂擴散法進行分離菌的藥敏試驗[5]，按照文獻報道的方法進行藥物敏感性的判定[5, 6]。

2 結果

2.1 細菌分離與形態(tài)觀察

37℃培養(yǎng)24h后，綿羊鮮血瓊脂平板上長出針尖大小、灰白色、半透明、邊緣整齊的小菌落，呈β型溶血。經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢，結果為革蘭氏陽性球菌，多呈單個雙球型或短鏈狀排列。

2.2 生化試驗結果

該株分離菌能夠發(fā)酵乳糖、甘露醇、蔗糖等，不產(chǎn)硫化氫，MR試驗為陽性，VP試驗為陰性(見表1)。該分離菌的生化反應結果與鏈球菌的生化反應結果大致相符[6,7]。

表1 細菌的生化試驗結果

2.3 16S rRNA基因的PCR擴增

分離菌16S rRNA基因序列的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，出現(xiàn)與預期大小相符、大小約1500bp的目的條帶(附圖)。

附圖 PCR 擴增分離菌16S rRNA 基因結果M. DNA標準DL2000； 1. 分離菌；2，陰性對照M. DNA Marker DL2000; 1. isolated bacterial strain; 2. negative control

2.4 基因測序分析

利用NCBI的BLAST工具將分離菌16S rRNA基因序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進行了同源性比對分析，結果顯示該菌與豬鏈球菌序列(GenBank序列號CP007497.1)同源性為99%，因此可確定分離菌株為豬鏈球菌。

2.5 動物試驗

攻毒的小鼠出現(xiàn)精神沉郁、不愿活動、呼吸困難，于24h內(nèi)全部死亡。剖檢死亡的小鼠可發(fā)現(xiàn)心包和腹腔積液，肝臟、脾臟、腎臟腫大。取病變組織涂片、革蘭氏染色鏡檢，可發(fā)現(xiàn)大量革蘭氏陽性短鏈狀球菌，而腹腔注射腦心浸液肉湯的小鼠在觀察期內(nèi)一直健康存活。

2.6 藥敏試驗

分離菌各種藥敏紙片的抑菌直徑測量結果見表2。結果表明該株分離菌對氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類等多種藥物高度敏感，對多粘菌素B、林可霉素耐藥。

表2 分離菌的藥敏試驗 (μg、mm)

3 討論

（1）鏈球菌廣泛分布于自然界，可以引起多種化膿創(chuàng)和敗血癥，也可表現(xiàn)為各種局限性感染[8]。仔豬感染鏈球菌，多是由母豬作為傳染源引起的，主要經(jīng)呼吸道和受損的皮膚及黏膜感染[9]。本研究的病料來自2016年8月青島某養(yǎng)豬場的病死仔豬，根據(jù)解剖病變結果，進一步結合細菌分離、生化試驗和分子生物學技術鑒定，最終確診為鏈球菌感染，分離菌對小鼠有一定的致病力。（2）鏈球菌一般要在一系列的誘因作用下才能發(fā)病，因此，建議養(yǎng)殖場定期打掃衛(wèi)生、及時消毒，減少鏈球菌發(fā)病的誘因[10-12]。對發(fā)病豬用含增效劑的阿莫西林按100mg/L飲水給藥，用百毒殺對豬舍進行消毒，及時清理豬舍內(nèi)的糞尿。采用上述方法1周內(nèi)無仔豬發(fā)病，隨訪4周，無新病例出現(xiàn)，說明該豬場中豬鏈球病得到控制。由于豬鏈球病的傳染性比較強，容易由散發(fā)變?yōu)榧w大規(guī)模發(fā)病，所以這次病理診斷及治療也為后續(xù)的豬群飼養(yǎng)中該病的防控提供參考，防止該場豬鏈球菌病的大規(guī)模發(fā)生。另外，當豬場發(fā)生細菌性疾病時，應當結合藥敏試驗，選擇敏感藥物進行治療，注意交替用藥，避免產(chǎn)生耐藥性。

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1007-1733(2017)02-0001-02

2016–10–21）

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