蔣婷，紀(jì)青，鄧飛

(遵義醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，貴州 遵義 563000)

·綜 述·

嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞治療惡性淋巴瘤研究進(jìn)展

蔣婷，紀(jì)青，鄧飛

(遵義醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，貴州 遵義 563000)

惡性淋巴瘤(ML)是起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，現(xiàn)有的常規(guī)治療手段主要為化療和放療，但不良反應(yīng)較大，療效欠佳。嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞(CAR-T)療法是近年來治療惡性腫瘤的一種新模式，在淋巴造血系統(tǒng)腫瘤治療上顯示了良好的抗腫瘤效應(yīng)，但CAR-T細(xì)胞也會(huì)殺傷帶有CAR相對(duì)應(yīng)抗原的正常細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞因子風(fēng)暴等副作用。本文從CAR原理及結(jié)構(gòu)及其在ML中的臨床應(yīng)用和不良反應(yīng)等方面作簡(jiǎn)要綜述。

嵌合抗原受體；T細(xì)胞；惡性淋巴瘤；進(jìn)展

惡性淋巴瘤(malignant lymphoma，ML)是起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，根據(jù)其病理、臨床特點(diǎn)及預(yù)后轉(zhuǎn)歸等分為非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)和霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma，HL)?，F(xiàn)有的常規(guī)治療手段主要為化療和放療，但不良反應(yīng)較大，療效欠佳即完全緩解率低或復(fù)發(fā)率高，例如HL雖化療后完全緩解率可達(dá)70%～80%，但20%～30%的患者對(duì)化療方案原發(fā)耐受，且其中4%～50%的患者常有預(yù)后不良伴復(fù)發(fā)[1]。因此，尋找一種毒副作用小、特異性強(qiáng)且安全有效的治療方法十分必要。嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞(chimeric antigen receptor modified T cells，CAR-T)療法是目前最具前景的腫瘤治療方法之一，CAR-T細(xì)胞通過抗原、抗體結(jié)合的原理特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原，可不受腫瘤局部微環(huán)境免疫抑制、以非MHC限制性的方式特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，相比以往的免疫治療手段有著更好的腫瘤特異性，更加高效的攻擊效應(yīng)及攻擊持久性[2]。近年來，CAR-T療法在惡性腫瘤，特別是淋巴造血系統(tǒng)腫瘤治療上顯示了良好的抗腫瘤效應(yīng)[3]。

1 CAR-T作用原理

CAR-T是通過人工手段，將識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體序列(single chain variable fragment，scFv)和T細(xì)胞的活化序列在體外進(jìn)行基因重組，形成重組質(zhì)粒，通過病毒載體、電穿孔、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)等轉(zhuǎn)染技術(shù)在體外轉(zhuǎn)染、純化、擴(kuò)增后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，這種經(jīng)過基因改造和修飾后的T細(xì)胞稱為CAR-T細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞能在體內(nèi)及體外特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原，在與目的抗原結(jié)合后直接介導(dǎo)細(xì)胞毒性，通過釋放顆粒素、穿孔酶、干擾素(IFN)和腫瘤壞死因子(TNF)等達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。

2 CAR-T結(jié)構(gòu)

CAR-T細(xì)胞由胞外抗原結(jié)合區(qū)、胞外鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)肽區(qū)組成。胞外區(qū)為單克隆抗體的單鏈可變區(qū)scFv段，可變區(qū)序列能夠識(shí)別特定腫瘤抗原，目前已有多種腫瘤抗原可用作胞外區(qū)識(shí)別，包括CD19、CD20、CD30、表皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2、CEA、GD2、碳酸酐酶Ⅸ等[4]。當(dāng)scFv與這些腫瘤抗原結(jié)合，可通過TCRζ(CD3ζ)或Fc受體的胞內(nèi)區(qū)使T細(xì)胞活化發(fā)揮效應(yīng)功能；跨膜區(qū)連接胞外與胞內(nèi)區(qū)，由同源或異源二聚體膜蛋白組成，常用的CAR跨膜區(qū)分子有CD3、CD4、CD7、CD8、CD28、4-1BB (CD137)、OX40(CD134)、DAP-10等；胞內(nèi)區(qū)具有免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)，最常見的是T細(xì)胞受體TCR/CD3ζ鏈和免疫球蛋白Fc受體FcεRIγ鏈，主要負(fù)責(zé)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。

根據(jù)CAR胞內(nèi)信號(hào)區(qū)的結(jié)構(gòu)不同將其分為三代。一代CAR由腫瘤相關(guān)抗原的單鏈抗體(scFv)和ITAM構(gòu)成，不含共刺激分子，能夠識(shí)別靶抗原并激活T細(xì)胞，但不轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖信號(hào)和誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，殺傷作用有限。于是在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了二代CAR和三代CAR，它們結(jié)構(gòu)上的區(qū)別在于：分別嵌入了一種或者多種來源于 CD28、4-1BB、OX40、DAP10、ICOS、CD27的胞內(nèi)共刺激分子信號(hào)結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建的這種二代CAR和三代CAR與一代CAR相比促進(jìn)T細(xì)胞增殖效能更好、釋放細(xì)胞因子的水平更高、抗腫瘤效能更強(qiáng)[5-6]，但其改進(jìn)的作用效果如何仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 CAR-T在ML治療中的應(yīng)用

目前臨床上應(yīng)用針對(duì)ML的CAR種類很多，主要包括構(gòu)建靶向CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD123、Kappa輕鏈等抗體的CAR來修飾外周血T細(xì)胞進(jìn)行臨床試驗(yàn)和研究[7]。

2011年，Savoldo等[8]首次報(bào)道將靶向CD30的CAR負(fù)載于EB病毒特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(EBV-CTLs)制備了CD30 CAR+)EBV-CTLs，該細(xì)胞能夠在HL SCID小鼠移植瘤模型中發(fā)揮抗腫瘤作用。2012年，Till等[9]應(yīng)用靶向CD20分子，共刺激分子包括CD28和4-1BB (CD137)的第3代CAR-T細(xì)胞治療3例套細(xì)胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)和1例濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，F(xiàn)L)患者，回輸細(xì)胞前均予以淋巴細(xì)胞清除，輸注后第14天輸入IL-2，其中1例MCL患者達(dá)完全緩解，另外兩例持續(xù)無疾病進(jìn)展期分別達(dá)12個(gè)月和24個(gè)月，F(xiàn)L總體上呈部分緩解。

相比之下，應(yīng)用靶向CD19的CAR-T細(xì)胞治療NHL患者的療效尤為突出[10-12]，2013年，Kochenderfer等[13]報(bào)道了采用異基因第2代抗CD19-CAR-T細(xì)胞治療10例B細(xì)胞淋巴瘤患者，患者在輸注細(xì)胞前未接受放療或化療處理，輸注細(xì)胞后不給予IL-2，CAR-T細(xì)胞在7～14 d達(dá)峰值，持續(xù)時(shí)間不超過1個(gè)月，大多數(shù)病情穩(wěn)定，其中1例緩解期維持達(dá)32個(gè)月，但所有患者在輸注細(xì)胞后出現(xiàn)了短暫的發(fā)熱、低血壓、乏力等反應(yīng)且均在兩周之內(nèi)緩解。2015年Kochenderfer等[14]再次將抗CD19-CAR-T細(xì)胞應(yīng)用于B細(xì)胞淋巴瘤患者，總體均獲得部分緩解。與此同時(shí)，Schuster等[15]應(yīng)用靶向CD19的CAR-T細(xì)胞免疫治療復(fù)發(fā)/難治性NHL患者的Ⅱa期臨床試驗(yàn)，總反應(yīng)率達(dá)67%(其中12例DLBCL患者的反應(yīng)率為50%，6例FL患者反應(yīng)率則為100%)，中位隨訪6個(gè)月患者的無進(jìn)展生存率為59%，其良好的抗腫瘤效應(yīng)，證明了CAR-T用來治療難治性惡性淋巴瘤的可行性和有效性，為CAR-T細(xì)胞免疫治療的進(jìn)一步發(fā)展提供了強(qiáng)有力的支撐。

4 CAR-T細(xì)胞免疫治療的主要不良反應(yīng)及解決途徑

這些由不同研究小組已經(jīng)發(fā)表的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)均證實(shí)CAR-T用來治療難治性ML的可行性和有效性，但治療過程中引起的不良反應(yīng)亦不能忽視，主要包括細(xì)胞因子釋放綜合征、脫靶效應(yīng)、插入突變、移植物抗宿主反應(yīng)等。

4.1 細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine relaease syndrome，CRS)CAR-T細(xì)胞治療過程中出現(xiàn)的首要不良反應(yīng)是CRS，臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、心動(dòng)過速、低血壓、急性呼吸窘迫綜合征或多器官功能衰竭，嚴(yán)重者可危及患者生命[17]。這與大量激活的T細(xì)胞介導(dǎo)的急性抗腫瘤反應(yīng)有關(guān)，腫瘤細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)被溶解消散的同時(shí)會(huì)啟動(dòng)一系列細(xì)胞因子的釋放，如IL-1、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α等。目前主要通過以下措施預(yù)防和減少CRS的發(fā)生：(1)低劑量多次回輸CAR-T細(xì)胞；(2)先培養(yǎng)回輸?shù)?代CAR-T細(xì)胞，待患者適應(yīng)后，再改用第2代或第3代CAR-T細(xì)胞；(3)在CAR中導(dǎo)入自殺基因以控制T細(xì)胞的過度增殖[17]；(4)適當(dāng)使用類固醇激素及免疫抑制劑拮抗劑緩解CRS癥狀。(5) CRS的嚴(yán)重程度與腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān)，通過化療或者放療預(yù)處理減小腫瘤負(fù)荷，可提高CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)并在一定程度上降低CRS反應(yīng)。

4.2 脫靶效應(yīng) CAR針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原很少，大多為腫瘤相關(guān)性抗原，因此，CAR-T細(xì)胞靶向性殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)對(duì)帶有CAR相對(duì)應(yīng)抗原的正常細(xì)胞產(chǎn)生殺傷，稱之為脫靶效應(yīng)。Kochenderfer等[18]報(bào)道了1例抗CD19-CAR治療B細(xì)胞淋巴瘤病例，觀察發(fā)現(xiàn)在持續(xù)清除外周血B細(xì)胞達(dá)39周后患者才出現(xiàn)CD19+淋巴瘤細(xì)胞清除效果，表明脫靶效應(yīng)的存在直接影響了CAR-T療法的抗腫瘤療效。現(xiàn)階段處理方案：(1)選擇特異性更高的腫瘤相關(guān)抗原；(2)構(gòu)建能夠同時(shí)識(shí)別和結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面一種以上抗原的CAR，因?yàn)檎＜?xì)胞只表達(dá)一種抗原可避免受到損傷[19]；(3)根據(jù)靶抗原表達(dá)水平,設(shè)計(jì)與靶抗原有特定親和力的CAR；(4)構(gòu)建跨信號(hào)CAR，不直接相連CAR結(jié)構(gòu)中的T細(xì)胞活化信號(hào)CD3ζ與共刺激信號(hào)CD28分子[20]；(4)對(duì)于B細(xì)胞缺乏，可通過輸注丙種球蛋白糾正[21]。

4.3 插入突變 CAR技術(shù)是將外源性基因序列整合到正常T細(xì)胞內(nèi)，理論上正常T細(xì)胞存在一定的基因突變風(fēng)險(xiǎn)，目前尚未有相關(guān)報(bào)道，但有研究中心采用mRNA直接轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的辦法以避免該風(fēng)險(xiǎn)。

4.4 移植物抗宿主反應(yīng)(graft versus host disease，GVHD)CAR-T細(xì)胞在患者體內(nèi)長(zhǎng)期存在可能會(huì)引起GVHD樣損傷，為減少GVHD的發(fā)生Hoyos等[22]的策略是在設(shè)計(jì)CAR-T細(xì)胞的同時(shí)整合入自殺基因如Caspase-9，通過化學(xué)誘導(dǎo)等方法啟動(dòng)CAR-T細(xì)胞的自殺程序。且有研究表明通過給異基因造血干細(xì)胞移植后的患者輸注特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞并無GVHD的產(chǎn)生[23]，所有這些研究為CAR-T細(xì)胞技術(shù)用于預(yù)防GVHD的發(fā)生提供了新的思路。

5 結(jié) 語

眾多研究表明CAR-T細(xì)胞技術(shù)的問世明顯改變著ML的治療模式且有著廣闊的應(yīng)用前景，然而CAR-T細(xì)胞在治療不同類型腫瘤時(shí)會(huì)表現(xiàn)出不同的作用效果，而且在攻擊腫瘤相關(guān)抗原的同時(shí)也會(huì)攻擊正常細(xì)胞和組織，由此引發(fā)的各種不良反應(yīng)不容忽視。目前國外通常的做法是選用不同的單鏈抗體序列，尋找高水平表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原，或低劑量多次回輸?shù)确椒右越鉀Q，但現(xiàn)有的臨床數(shù)據(jù)大都是小樣本研究，CAR-T治療方法在技術(shù)和大規(guī)模臨床應(yīng)用方面仍然存在著巨大的挑戰(zhàn)。因此需要更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)來證實(shí)這一新治療策略的安全性和有效性，相信隨著研究的深入和技術(shù)的不斷改進(jìn)，CAR-T細(xì)胞免疫治療將會(huì)為更多的腫瘤患者帶來福音。

[1]Vaklavas C,Forero-Torres A.Safety and efficacy of brentuximab vedotin in patients with Hodgkin lymphoma or systemic anaplastic large cell lymphoma[J].TherAdv Hematol,2012,3(4):209-225.

[2]Butler MO,Hirano N.Human cell-based artificial antigen-presenting cells for cancer immunotherapy[J].Immunol Rev,2014,257(1): 191-209.

[3]Chapuis AG,Thompson JA,Margolin KA,et al.Transferred melanoma-specific CD8+T cells persist,mediate tumor regression, and acquire central memory phenotype[J].Proc Natl Acad Sci US A, 2012,109(12):4592-4597.

[4]Turtle CJ,Riddell SR.Genetically retargeting CD8+lymphocyte subsets for cancer immunotherapy[J].Curr Opin Immunol,2011,23 (2):299-305.

[5]Kalos M1,Levine BL,Porter DL,et al.T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced Leukemia[J].Sci Transl Med,2011,3(95): 95ra73.

[6]Terakura S,Yamamoto TN,Gardner RA,et al.Generation of CD19-chimeric antigen receptormodified CD8+T cells derived from virus-specific centralmemory T cells[J].Blood,2012,119(1):72-82.

[7]Maus MV,Fraietta JA,Levine BL,et al.Adoptive immune-therapy for cancer or viruses[J].Annu Rev Immunol,2014,32:189-225.

[8]Savoldo B,Ramos CA,Liu E,et al.CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients[J].J Clin Invest,2011,121(5): 1822-1826.

[9]Till BG,Jensen MC,Wang J,et al.CD20-specific adoptive immunotherapy for lymphoma using a chimeric antigen receptor with both CD28 and 4-1BB domains:pilot clinical trial results[J].Blood, 2012,119(17):3940-3950.

[10]Ramos CA,Ballard B,Liu E,et al.Chimeric T cells for therapy of CD30+Hodgkin and non-Hodgkin lymphomas[J].Blood,2015,126 (23):185.

[11]Gill S,Maus MV,Porter DL.Chimeric antigen receptor T cell therapy:25 years in the making[J].Blood Rev,2016,30(3):157-167.

[12]Maude S,Barrett DM.Current status of chimeric antigen receptor therapy for haematological malignancies[J].Br J Haematol,2016, 172(1):11-22.

[13]Kochenderfer JN,Dudley ME,Carpenter RO,et al.Donor-derived CD19-targeted T cells cause regression of malignancy persisting after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation[J].Blood, 2013,122(25):4129-4139.

[14]Kochenderfer JN,Dudley ME,Kassim SH,et al.Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor[J].J Clin Oncol,2015,33(6): 540-549.

[15]Schuster SJ,Svoboda J,Nasta S,et al.PhaseⅡa trial of chimeric antigen receptor modified T cells directed against CD19(CTL019)in patients with relapsed or refractory CD19+lymphomas[J].Blood, 2014,124:3087

[16]Brentjens R,Yeh R,Bernal Y,et al.Treatment of chronic lymphocytic leukemia with genetically targeted autologous T cells:case report of an unforeseen adverse event in a phase I clinical trial[J].Mol Ther,2010,18(4):666-668.

[17]Di Stasi A,Tey SK,Dotti G,et al.Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy[J].New England Journal of Medicine,2011,365(18):1673-1683.

[18]Kochenderfer JN,Wilson WH,Janik JE,et al.Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19[J].Blood, 2010,116(20):4099-4102.

[19]Wang Y,Zhang WY,Han QW,et al.Effective response and delayed toxicities of refractory advanced diffuse large B-cell lymphoma treated by CD20-directed chimeric antigen receptor-modified T cells[J]. Clin Immunol,2014,155(2):160-175.

[20]Davila ML,Kloss CC,Gunset G,et al.CD19 CAR-targeted T cells induce long-term remission and B Cell Aplasia in an immunocompetent mouse model of B cell acute lymphoblastic leukemia[J].PLoS one,2013,8(4):e61338.

[21]Lanitis E,Poussin M,Klattenhoff AW,et al.Chimeric antigen receptor T cells with dissociated signaling domains exhibit focused antitumor activity with reduced potential for toxicity in vivo[J].Cancer Immunol Res,2013,1(1):43-53.

[22]Hoyos V,Savoldo B,Quintarelli C,et al.Engineering CD19-specific T lymphocytes with interleukin-15 and a suicide gene to enhance their anti-lymphoma/leukemia effects and safety[J].Leukemia, 2010,24(6):1160-1170.

[23]Cruz CR,Micklethwaite KP,Savoldo B,et al.Infusion of donor-derived CD19-redirected virus-specific T cells for B-cell malignancies relapsed after allogeneic stem cell transplant:a phase 1 study[J]. Blood,2013,122(17):2965-2973.

Research progress of chimeric antigen receptor modified T cells in malignant lymphoma.

JIANG Ting,JI Qing, DENG Fei.Department of Pathology,Zunyi Medical College,Zunyi 563000,Guizhou,CHINA

Malignant lymphoma(ML)is a malignant tumor originating in the lymphoid hematopoietic system. Current conventional treatment methods to ML are mainly chemotherapy and radiotherapy,but they both cause many adverse reactions,and the therapeutic efficacy is unsatisfactory.The modified chimeric antigen receptor T cells(CAR-T) therapy is a kind of new pattern of malignant tumor therapy in recent years.It shows great effect on lymphatic hematopoietic system,but CAR-T cells will also kill the normal cells that wearing CAR antigen,which can cause cytokine storm and other risks.In this review,CAR principle and its structure,and its clinical use and existing problems in malignant lymphoma treatment are summarized.

Chimeric antigen receptor;T cells;Malignant lymphoma;Progress

R733.4

A

1003-6350（2017）04-0612-03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.04.031

2016-09-01)

國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81160300)

鄧飛。E-mail：mdproffeideng@hotmail.com