劉燕霏，楊建德

近年來(lái)我國(guó)奶牛業(yè)有了長(zhǎng)足的發(fā)展，已成為畜牧業(yè)的重要組成部分。制約我國(guó)奶業(yè)發(fā)展的因素有奶牛品種、飼草飼料結(jié)構(gòu)、原奶質(zhì)量及飼養(yǎng)管理水平等。主要因素涉及養(yǎng)殖工藝粗放，優(yōu)質(zhì)飼草匱乏，疫病防制體系薄弱，乳品加工技術(shù)落后，牛奶質(zhì)量監(jiān)控體系不健全等諸多方面。奶牛乳房炎是奶牛乳腺組織的炎癥，是一個(gè)世界性難題，它的發(fā)生和奶牛遺傳因素、病原微生物、環(huán)境因素及管理因素等密切相關(guān)[1-2]。乳房炎是奶牛最為常見(jiàn)，也是造成奶牛飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的疾病之一，可直接影響奶汁品質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降，乳汁稀薄，品質(zhì)降低，造成奶牛業(yè)較大的經(jīng)濟(jì)損失。如何控制奶牛乳房炎是擺在全球各國(guó)專家面前的課題。研究和預(yù)防奶牛乳房炎涉及遺傳、病原微生物及環(huán)境管理等諸多方面，本文結(jié)合近些年這方面的文獻(xiàn)，重點(diǎn)闡述乳腺的結(jié)構(gòu)與免疫學(xué)在控制乳房炎方面的作用機(jī)制。

1 奶牛乳腺組織結(jié)構(gòu)

不同品種的奶牛，乳房大小可存在差異。乳房的左右兩部分被中間韌帶隔開(kāi)，而前后兩部分被分隔得更加明顯。奶牛乳房一般由4個(gè)乳區(qū)構(gòu)成，一個(gè)乳區(qū)中產(chǎn)生乳汁不能轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)乳區(qū)中。每個(gè)乳區(qū)對(duì)應(yīng)一個(gè)乳頭，每個(gè)區(qū)包括乳腺分泌細(xì)胞、腺泡、乳導(dǎo)管、乳池等[3]。乳腺由泌乳組織和結(jié)締組織組成。泌乳組織的數(shù)量，即泌乳細(xì)胞的數(shù)量，是制約產(chǎn)奶能力的因素之一，但是乳房的大小并不一定和產(chǎn)奶量成正比，因?yàn)槿榉砍橄偻?，還可能存在有大量的結(jié)締組織。泌乳細(xì)胞呈單層排列，位于類似于氣泡的球形結(jié)構(gòu)的基膜上，氣泡直徑約為50～250 mm，多個(gè)氣泡就可以組成類似于肺泡的小葉結(jié)構(gòu)。合成的乳汁儲(chǔ)存在氣泡、泌乳管、乳房和乳池中。乳頭由乳池和乳導(dǎo)管組成，乳池和乳導(dǎo)管匯合處有6～10條縱向的褶皺形成所謂的病原體屏障（稱之為Furstenberg’s rosette）來(lái)抵御病原菌的入侵。乳導(dǎo)管由很多縱向或環(huán)狀的平滑肌纖維包圍，平滑肌纖維的作用是保證非擠奶期間乳導(dǎo)管處于關(guān)閉狀態(tài)，乳導(dǎo)管帶有角蛋白也能起到免受病原體細(xì)菌感染的作用。乳腺特別是乳頭上有密集的神經(jīng)末梢，對(duì)幼崽的吮吸或接觸等比較敏感。乳房也有神經(jīng)組織，這些神經(jīng)組織與血液循環(huán)系統(tǒng)和乳導(dǎo)管的平滑肌相連，但是沒(méi)有直接控制泌乳組織的神經(jīng)。乳腺有密集的動(dòng)脈和靜脈系統(tǒng)，不斷地為細(xì)胞提供合成乳汁的養(yǎng)分。每1 L牛奶需要流過(guò)乳房的血液約為500 L，乳房淋巴系統(tǒng)負(fù)責(zé)清除外來(lái)雜質(zhì)殘留，也可啟動(dòng)免疫反應(yīng)來(lái)防止細(xì)菌感染[4-6]。

2 固有免疫

2.1 屏障結(jié)構(gòu)

乳腺組織因具有獨(dú)特的生理構(gòu)造，起到抗感染保護(hù)作用。乳頭管括約肌和乳頭管內(nèi)上皮細(xì)胞分泌的角蛋白能阻止病原菌粘附在上皮細(xì)胞表面，還可分泌抗菌活性的蛋白質(zhì)和有機(jī)酸類，如棕櫚酸、豆蔻酸、亞油酸等脂肪酸具有抗菌作用，因而構(gòu)成了乳腺抗感染的第一道防線[2]。同時(shí)，乳頭管周?chē)s肌在擠奶間隔期處于收縮狀態(tài)，可防止病原菌入侵，并在擠奶時(shí)將乳頭管內(nèi)角蛋白上的病原菌固定在局部，在擠奶時(shí)隨角質(zhì)層脫落被擠出。

2.2 乳汁中抗微生物物質(zhì)

乳汁中含有的補(bǔ)體蛋白、溶菌酶、乳鐵蛋白和乳過(guò)氧化物酶系統(tǒng)等抗菌活性物質(zhì)發(fā)揮保護(hù)乳腺和維持乳腺功能的重要作用。

補(bǔ)體是存在于血清和乳汁當(dāng)中具有酶活性的一組不耐熱的蛋白質(zhì)，主要由肝細(xì)胞、單核細(xì)胞或組織中的巨噬細(xì)胞等合成。一些病原微生物成分可直接激活補(bǔ)體替代途徑，達(dá)到溶解病原微生物的目的。此外補(bǔ)體還可以起到調(diào)理作用及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，補(bǔ)體活化后釋放的小片段可吸引吞噬細(xì)胞抵達(dá)感染部位。在抵抗大腸桿菌性乳房炎的炎癥中，補(bǔ)體發(fā)揮重要作用[7]。補(bǔ)體在健康乳汁中濃度含量較低，而炎性乳汁中補(bǔ)體濃度大幅提高，來(lái)共同對(duì)付入侵微生物。

溶菌酶（lysozyme）又稱胞壁質(zhì)酶（muramidase），是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。主要通過(guò)破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。有研究報(bào)道，采用溶酶體轉(zhuǎn)基因到奶山羊乳腺能明顯抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)速度[8]，溶菌酶含量在臨床型乳房炎乳樣中可高達(dá)15.6 mg/mL，在亞臨床乳房炎乳樣中含量為11.2 mg/mL，而健康奶樣中含量為6.9 mg/mL[9]，這表明乳汁中溶菌酶含量與乳腺炎癥有關(guān)。

1939年，Sorensen等人在分離乳清蛋白時(shí)得到一種紅色蛋白，但至1959年Groves用色譜得到純的紅色物質(zhì)后，才確認(rèn)這種紅色物質(zhì)是一種與鐵結(jié)合的糖蛋白，稱之為乳鐵蛋白 （lactoferrin，LF）。LF是乳汁中一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，是中性粒細(xì)胞顆粒中具有殺菌活性的單體糖蛋白，其分子量為80 kDa，主要由乳腺上皮細(xì)胞和白細(xì)胞表達(dá)和分泌。LF有效抑制大腸桿菌和沙門(mén)氏菌等需鐵性革蘭氏陰性菌及金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)繁殖[5]。LF不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，而且具有廣譜抗菌、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等強(qiáng)大生物功能。Barreto等證實(shí)，奶牛LF能夠降低腸炎沙門(mén)氏菌對(duì)Hep-2細(xì)胞的侵襲。泌乳期LF含量低于干奶期和炎癥期，在干奶期阻止大腸桿菌侵染，起到防御作用[7]。

乳過(guò)氧化物酶（Lactoperoxidase，LP）是乳汁中抵抗病原菌的過(guò)氧化物酶，免疫學(xué)上與哺乳動(dòng)物血紅素有關(guān)。LP也存在于哺乳動(dòng)物的淚液和唾液中，對(duì)許多病原菌具有殺滅作用。這種酶依賴于過(guò)氧化氫（H2O2）和硫氰酸鹽（SCN）發(fā)揮作用。LP在過(guò)氧化氫作用下，催化的硫氰酸鹽（SCN-）轉(zhuǎn)換形成氧化硫氰酸鹽（OSCN）。OSCN是硫氰酸鹽的主要中間氧化產(chǎn)物，它是LP抗菌成分。LP與SCN-和OSCN合稱為L(zhǎng)P系統(tǒng)（LP-S），LP-S是乳汁中天然的抵抗微生物物質(zhì)，可殺滅存在于乳汁的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌等[5，7]。

2.3 細(xì)胞因子

在正常和乳房炎奶牛乳腺中，細(xì)胞因子微妙和敏感的變化可能促進(jìn)其在乳房的健康預(yù)后診斷中的應(yīng)用。有些學(xué)者推測(cè)，檢測(cè)細(xì)胞因子可能成為乳房健康的重要指標(biāo)。隨著人們對(duì)牛乳腺細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和有效細(xì)胞因子診斷技術(shù)認(rèn)識(shí)的深入，細(xì)胞因子的免疫治療、診斷乳腺炎的作用會(huì)進(jìn)一步顯現(xiàn)。

目前，有多種乳腺細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、γ-干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）和IL-6等。研究證實(shí)，乳腺內(nèi)注射的IL-2誘導(dǎo)血液中嗜中性粒細(xì)胞遷移至乳汁而導(dǎo)致乳汁中體細(xì)胞數(shù)升高；還可加速干奶期乳腺組織退化，增加IgG的局部合成能力，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，降低乳房?jī)?nèi)感染；臨近分娩期和初乳中IL-2的活性較低，使分娩前后乳房炎的發(fā)病率大幅提高。IFN-γ是由T細(xì)胞與分裂素或抗原在免疫識(shí)別應(yīng)答過(guò)程中起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。IFN-γ可增強(qiáng)乳腺吞噬細(xì)胞的生物學(xué)活性，進(jìn)而有效控制乳腺炎的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ對(duì)實(shí)驗(yàn)性大腸桿菌型乳房炎治療有效，單獨(dú)使用γ-干擾素或乳酸環(huán)丙沙星均對(duì)金黃色葡萄球菌型臨床乳房炎有作用，二者配合效果更好[7，9-10]。TNF-α在急性炎癥過(guò)程中產(chǎn)生，特別是大腸桿菌引起的嚴(yán)重乳腺炎乳汁和血清中表達(dá)水平很高，原因可能是由于應(yīng)激引起TNF大量產(chǎn)生，進(jìn)入微循環(huán)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損害。TNF-α能增強(qiáng)部分抗生素殺傷金黃色葡萄球菌的能力，可用作抗生素的輔佐治療劑。CSF在細(xì)胞增殖和分化中起著重要作用。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)CSF（GM-CSF）可預(yù)防乳腺內(nèi)的新型感染以及增強(qiáng)粒細(xì)胞的趨化性和巨噬細(xì)胞的吞噬作用。Takahashi等發(fā)現(xiàn)，重組GM-CSF在治療金黃色葡萄球菌亞臨床型乳房炎方面具有很大潛力[11]。臨床型乳房炎乳樣IL-6含量可高達(dá)18 ng/mL，亞臨床乳樣含量為30.8 ng/mL，而健康奶樣IL-6含量為5.2 ng/mL[12]，這表明IL-6在臨床和亞臨床乳房炎中可能起一定的作用。

3 適應(yīng)性免疫

3.1 細(xì)胞免疫

乳腺內(nèi)部的細(xì)胞免疫防御功能廣義地講包括T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等發(fā)揮的作用。 巨噬細(xì)胞主要通過(guò)蛋白酶和活性氧吞噬和殺傷病原微生物，來(lái)維持乳腺和乳汁健康。當(dāng)病原菌侵入乳腺后，乳腺巨噬細(xì)胞主要釋放前列腺素、白三烯和細(xì)胞因子等化學(xué)物質(zhì)，吸引大量多核巨細(xì)胞（PMN）進(jìn)入感染部位，加劇炎性反應(yīng)并中和毒性產(chǎn)物，同時(shí)在乳區(qū)周?chē)淌珊拖≡?，減少病原菌數(shù)量[4-5]。

特異性T細(xì)胞包括 CD4＋、CD8＋T細(xì)胞和γδT淋巴細(xì)胞。雖然T細(xì)胞進(jìn)入乳腺是母牛對(duì)抗乳房?jī)?nèi)入侵病原體的關(guān)鍵，但是何種淋巴細(xì)胞亞群起作用仍有待于研究。乳腺發(fā)生炎癥時(shí)，外周血中的 CD4＋T細(xì)胞占主導(dǎo)地位，激活其他細(xì)胞如巨噬細(xì)胞或B細(xì)胞參與免疫反應(yīng)，血液中分泌修復(fù)受感染部分生長(zhǎng)因子的 γδT細(xì)胞數(shù)量增加。但在金黃色葡萄球菌引起慢性感染的乳腺中，CD8＋T數(shù)量大于CD4＋T，因此 CD8＋T占主導(dǎo)作用。為了研究淋巴細(xì)胞亞群動(dòng)力學(xué)，有試驗(yàn)對(duì)大腸桿菌性乳房炎初產(chǎn)奶牛乳汁及血液中T淋巴細(xì)胞亞群、CD4+/CD8+比率、CD21+T細(xì)胞及淋巴細(xì)胞增殖情況進(jìn)行了研究。乳腺內(nèi)接種104CFU大腸桿菌（A組）和106CFU（B組），與A組相比，在感染后6～24 h的B組更多的淋巴細(xì)胞遷移到感染區(qū)，而CD8+T是第一個(gè)被吸引至感染乳汁中的T細(xì)胞。在感染后 6～24 h B組 CD4+/CD8+比率顯著下降，CD4+/CD8+大幅下降主要因?yàn)槿橹蠧D8+T細(xì)胞濃度的升高。相反，在感染后72 h，CD4+/CD8+比值增加，兩組均增加了約2倍。這一增長(zhǎng)主要是由于CD4+T細(xì)胞濃度的增加。CD4+T細(xì)胞濃度的增加正好與乳汁的CD21+T細(xì)胞數(shù)量增加相一致。在血液和乳汁中，B組比A組CD8+T細(xì)胞的增殖快很多，這也表明大腸桿菌接種劑量的增加能夠加速CD8+細(xì)胞在炎癥區(qū)域積聚，而這些細(xì)胞是引起大腸桿菌性早期乳房炎乳腺和乳汁中主要的T細(xì)胞[13]。乳腺抗原特異性炎癥取決于CD4+分泌的IL17A和IFN-γ[14]。炎癥NK細(xì)胞介導(dǎo)乳腺產(chǎn)生免疫應(yīng)答過(guò)程，主要起殺滅靶細(xì)胞、保護(hù)乳腺組織的作用。

3.2 體液免疫

奶牛乳腺中B細(xì)胞是參與體液免疫應(yīng)答的重要成分。B細(xì)胞對(duì)復(fù)雜抗原及多種有絲分裂原的識(shí)別均需要T細(xì)胞協(xié)助。患乳房炎時(shí)，血液中的B細(xì)胞數(shù)量降低，而乳房淋巴結(jié)中的該細(xì)胞數(shù)量則升高，可能原因是炎癥發(fā)展過(guò)程中B細(xì)胞從血液進(jìn)入乳腺和乳汁中。

3種主要免疫球蛋白 IgG、IgM和IgA，通過(guò)血液選擇性進(jìn)入乳腺內(nèi)對(duì)侵入的致病菌起到重要的殺滅和抑制作用[6]?？贵w的滴度高低與奶牛的泌乳階段和乳房炎癥病程發(fā)展有關(guān)。泌乳初期免疫球蛋白濃度一般較低；接近干乳期和分娩時(shí)，乳汁中免疫球蛋白含量逐漸增加，使初乳中免疫球蛋白達(dá)到較高水平，可為新生犢牛提供早期被動(dòng)保護(hù)。乳房炎發(fā)生時(shí)，乳汁中的免疫球蛋白濃度上升。健康乳汁中，IgG1調(diào)理作用較弱，不能有效發(fā)揮促進(jìn)中性粒細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌的吞噬。但乳汁中IgG2的濃度會(huì)隨炎癥的發(fā)展而增加。IgM不是乳汁中抵抗病原菌的主力，僅在感染后早期存在[7]。乳汁中IgG2的含量少，但在金黃色葡萄球菌及鏈球菌感染中起調(diào)理作用。正常乳汁中IgA含量低，但能有效阻止病原黏附乳腺上皮細(xì)胞，在局部黏膜免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。乳頭管黏膜和乳頭管近端產(chǎn)生的局部IgA抗體和淋巴因子均有抵抗細(xì)菌入侵的能力[3]。

4 結(jié)語(yǔ)

乳腺不是一個(gè)獨(dú)立的組織器官，受機(jī)體遺傳、環(huán)境及管理因素影響。鑒于奶牛乳腺獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)，以及產(chǎn)生具有豐富蛋白乳汁的功能特點(diǎn)，使得乳腺易遭受病原菌的侵入，侵入的病原菌易于受到乳蛋白的保護(hù)而不易被機(jī)體清除。為了應(yīng)付各種病原微生物入侵，乳腺首先采用固有免疫機(jī)制，如屏障結(jié)構(gòu)和重要抗微生物物質(zhì)如補(bǔ)體蛋白、溶菌酶、乳鐵蛋白和乳過(guò)氧化物酶系統(tǒng)等清除病原菌；必要時(shí)需要激發(fā)機(jī)體的適應(yīng)性免疫如細(xì)胞免疫和體液免疫協(xié)調(diào)作用機(jī)制。

[1]徐繼英，劉俊林，李宏勝，等.奶牛乳腺炎病因?qū)W與發(fā)病機(jī)理研究概況[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2012（3）：25-27.

[2]Wang D，Zhang L，Zhou X，et al.Antimicrobial susceptibility， virulence genes， and randomly amplified polymorphicDNAanalysisofStaphylococcusaureus recovered from bovine mastitis in Ningxia[J].J Dairy Sci，2016，99（12）：9560-9569.

[3]張喜豐，張秀英，蘇景，等.奶牛乳腺免疫與乳腺炎易感性研究進(jìn)展[J].吉林畜牧獸醫(yī)，2006，27（8）：13-16.

[4]程艷，劉大程，張智勇.奶牛乳房炎與乳腺免疫[J].畜牧與飼料科學(xué)，2006，27（4）：1-4.

[5]Alluwaimi A M.The cytokines of bovine mammary gland：prospects for diagnosis and therapy[J].Res Vet Sci，2004，77（3）：211-22.

[6]葛影影，李靜茹，王根林，等.奶牛乳腺防御機(jī)理及乳房炎防治研究[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2016（8）：11-14.

[7]Pascal R，Celine R.Innate immunity of the bovine mammary gland[J].Vet Res，2006，37：369-400.

[8]Maga E A，Cullor J S，Smith W，et al.Human lysozyme expressed in the mammary gland of transgenic dairy goats can inhibit the growth of bacteria that cause mastitis and the cold-spoilage of milk[J].Foodborne Pathog Dis，2006，3（4）：384-92.

[9]Kayitsinga J，Schewe R L，Contreras G A，et al.Antimicrobial treatment of clinical mastitis in the eastern United States：The influence of dairy farmers'mastitis management and treatment behavior and attitudes[J].J Dairy Sci，2017，100（2）：1388-1407.

[10]伍杰.γ-干擾素對(duì)金黃色葡萄球菌性臨床型乳房炎的療效研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38（7）：206-209.

[11]Takahasi H，OdaiI M，Mitani K，et al.Effect of intra-mammary injection of rboGM-CSF on milk levels of chemilu-minescence activity，somatic cell count，and Staphylococcus aureuscount in Holstein cows withS.aureussubclinicalmastitis[J].CanadianJournalof Veterinary Research，2004，68（3）：182-187.

[12]Osman K M，Hassan H M，Ibrahim I M，et al.The impact of taphylococcal mastitis on the level of milk IL-6，lysozyme and nitric oxide[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis，2010，33（1）：85-93.

[13]Mehrzad J，Janssen D， Duchateau L，et al.Increase in Escherichia coliinoculum dose accelerates CD8+T-cell trafficking in the primiparous bovine mammary gland[J].J Dairy Sci，2008，91（1）：193-201.

[14]Rainard P，Cunha P，Ledresseur M，et al.Antigenspecific mammary inflammation depends on the production of IL-17 and IFN-γ by bovine CD4+T lymphocytes[J].PLoS One，2015，10（9）：e0137755.