王志強(qiáng) 王劍 陜文生

·綜述與講座·

男性不育及遺傳因素研究進(jìn)展

王志強(qiáng) 王劍 陜文生

不育癥是一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題，其中男性因素所致的不育約占到所有不育癥的一半。我們計(jì)劃在近期的文獻(xiàn)的背景下探討在人類精子發(fā)生過(guò)程中起著重要的作用的在Y染色體或者常染色體上的基因。檢索以下關(guān)鍵詞：男性不育基因，精子發(fā)生的遺傳學(xué)來(lái)獲得本文所需信息。結(jié)果利用基因敲除小鼠模型闡明的生精功能機(jī)制已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展，但是該信息并未直接應(yīng)用于人。然而，已經(jīng)證實(shí)幾個(gè)重要基因的突變可以引起不育。本文中將討論Y染色體中無(wú)精子癥區(qū)域(AZF)的一些確定可導(dǎo)致不育的基因，和常染色體上的SYKP3，KLHL10，AURKC和SPATA16基因。闡明男性不育的潛在基因，可以幫助我們更好理解不育的起因，從而幫助我們更好地為患者量身定制治療策略。

男性不育；無(wú)精子癥因素；AURKC；KLHL10；SPATA16；SYCP3

據(jù)WHO調(diào)查，15%的育齡夫婦存在不育問(wèn)題，全世界約有8 000萬(wàn)對(duì)左右，并且每年以200萬(wàn)對(duì)的速度遞增。許多社會(huì)和環(huán)境因素，包括社會(huì)進(jìn)步導(dǎo)致的女性結(jié)婚年齡增大，也對(duì)導(dǎo)致不孕不育病人數(shù)量增多有影響[1]。大約有一半的不孕不育是由男性因素引起的，而男性不育癥的各種治療方法效果都比較穩(wěn)定，包括采取激素治療、營(yíng)養(yǎng)療法、抗感染等病因和支持治療，但臨床效果均不理想，尤其是對(duì)于不明原因的特發(fā)性少、弱精患者，更無(wú)特異性療法。盡管輔助生殖技術(shù)，尤其MD-TESE(顯微鏡下睪丸取精術(shù))和ICSI(單精子卵泡漿內(nèi)注射)在一定程度上解決了許多嚴(yán)重少、弱精子癥男性患者的生育問(wèn)題，但目前對(duì)于睪丸內(nèi)沒(méi)有成熟精子的病人沒(méi)有有效的辦法。盡管有證據(jù)表明，許多無(wú)精子癥患者有遺傳易感性，但大多數(shù)情況下原因仍然未知[2]。最近的基因敲除鼠的研究表明許多基因與無(wú)精子癥有關(guān)，其機(jī)制也在逐漸闡明。然而這些研究鮮有用于人體，因?yàn)樾∈蟮慕Y(jié)果與人體試驗(yàn)并不總是對(duì)等。我們這里將討論我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和與無(wú)精子癥明確相關(guān)的基因。

1 無(wú)精子癥和Y染色體

1976年，Tiepolo和Zuffardi首次提出并解釋了Y染色體在無(wú)精子癥中扮演的角色。他們?cè)陲@微鏡下檢測(cè)6例無(wú)精子癥的患者并且提出無(wú)精子癥致病基因多位于此區(qū)，他們將其命名為無(wú)精子癥因子(AZF)區(qū)[3]。隨后的研究，如Vogt等[4]的研究進(jìn)一步說(shuō)明了AZF區(qū)的特點(diǎn)，Reijo等[5]發(fā)現(xiàn)89例患有非梗阻性無(wú)精子癥(NOA)患者中12例(13%)AZF區(qū)有缺失。這些研究也表明此區(qū)有無(wú)精子癥有密切聯(lián)系。Vogt等[6]進(jìn)一步闡明了由于睪丸組織類型不同，微缺失主要集中在3個(gè)區(qū)域，其將AZF區(qū)分為三個(gè)亞區(qū)：AZFa，AZFb和AZFc。雖然使用MD-TESE從患有AZFa，AZFb或AZFb + AZFc缺失的患者中取出精子非常困難，但是在只有AZFc缺失的患者睪丸中取出精子成功率高達(dá)(約70%)[7,8]。

2 無(wú)精子癥基因群

DAZ 無(wú)精子癥缺失(DAZ)基因，1995年由Reijo等人分離出來(lái)[5]。DAZ位于AZFc區(qū)。其表達(dá)特定于睪丸，并且編碼一個(gè)含有RNP/RRM區(qū)和一個(gè)RNA結(jié)合的功能區(qū)和七個(gè)串聯(lián)重復(fù)的14個(gè)殘基的蛋白[9,10]。Tiepolo和Zuffardi在1976年第一次提出的AZF區(qū)的概念之后19年，首次確定了DAZ是人類第一個(gè)由于基因突變導(dǎo)致無(wú)精子癥的基因。該項(xiàng)研究引起了對(duì)其他無(wú)精子癥候選基因的研究，但是DAZ仍舊為最有代表性的基因[11,12]。

RBMY 1997年，Elliott等[13]報(bào)告了第二例無(wú)精子癥基因，RNA結(jié)合基序基因(RBMY，位于Y染色體)。RMBY也位于AZFb區(qū)，像DAZ一樣轉(zhuǎn)錄RNA結(jié)合蛋白。RMBY特異性表達(dá)在胎兒的生殖細(xì)胞中，青少年和成年人睪丸中，但是在體細(xì)胞如Sertoli細(xì)胞中無(wú)表達(dá)。RMBY的缺失只與生殖細(xì)胞分化早期的減數(shù)分裂有關(guān)。這項(xiàng)研究表明RBMY在精子發(fā)生過(guò)程中起到了重要的作用。

USP9Y 1999年，Sun等[14]確定了AZFa區(qū)一個(gè)新的與精子發(fā)生相關(guān)的基因，USPY9(又稱DFFRY)。應(yīng)用576個(gè)NOA患者或者嚴(yán)重的少精子癥患者(精子計(jì)數(shù)≦5百萬(wàn)/ml)還有96個(gè)健康個(gè)體的DNA，通過(guò)單鏈構(gòu)象多態(tài)性和序列分析發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)患者有一個(gè)4 bp 的內(nèi)含子剪接供體位點(diǎn)7基因缺失。該缺失導(dǎo)致了一個(gè)框架移位和外顯子7的缺乏，引起蛋白水平下降約90%。

3 常染色體

上述提到的基因是典型的位于Y染色體AZF區(qū)域的精子發(fā)生基因。這個(gè)區(qū)域已經(jīng)被深入的研究分析，最近確定的AZF基因是在1999年被確定的USP9Y。然而，有關(guān)基因敲除小鼠的研究已確定了大量的常染色體精子發(fā)生基因。這表明常染色體上也存在人類精子缺乏癥的相關(guān)基因。

SYCP3 Yuan等[15]在基因敲除鼠的研究中報(bào)道了SYCP3(SCP3)。聯(lián)會(huì)絲復(fù)合物蛋白3(SYCP3)是一種DNA結(jié)合蛋白，與突觸有關(guān)并共同參與生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的過(guò)程[16-18]。雖然雄性和雌性SYCP3基因敲除小鼠發(fā)育都正常，但是純合突變的雄性鼠沒(méi)有生殖潛力。這類基因敲除小鼠的睪丸明顯較小，組織學(xué)顯示其減數(shù)分裂阻滯，即完全沒(méi)有正常減數(shù)分裂后形成的圓形及細(xì)長(zhǎng)的精細(xì)胞，更沒(méi)有成熟的精子。與野生型雌鼠相比，雌性SYCP3基因敲除鼠即使能夠妊娠和分娩，但其生育的后代明顯少。隨后的調(diào)查顯示，由于染色體畸變導(dǎo)致胎死宮內(nèi)幾率升高，從而導(dǎo)致同窩生仔數(shù)減少，同時(shí)隨著小鼠年齡的增長(zhǎng)，死胎率也隨之增加。

我們假設(shè)SYCP3在人類精子發(fā)生過(guò)程中也同樣扮演著重要角色的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了更深入的研究。我們分離出人SYCP3的cDNA，發(fā)現(xiàn)該基因位于12號(hào)染色體(12q23)上，且在睪丸中有特異性表達(dá)[19]。該基因編碼一種236個(gè)氨基酸構(gòu)成的、有兩個(gè)卷曲螺旋域的蛋白質(zhì)。對(duì)19個(gè)由于異常減數(shù)分裂導(dǎo)致的精子缺乏癥患者的SYCP3所有編碼區(qū)域和相鄰的內(nèi)含子的突變進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中2個(gè)患者第643核苷酸位點(diǎn)存在一個(gè)腺苷基團(tuán)的雜合缺失點(diǎn)。然而來(lái)自75名健康男性的DNA測(cè)序未在這些位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變，這也排除基因多態(tài)性的可能(P=0.039)。已經(jīng)確定的是，在鼠SYCP3基因的3個(gè)區(qū)域出現(xiàn)的卷曲螺旋域在蛋白質(zhì)結(jié)合中起著重要的作用[20]。在人基因組中該缺失點(diǎn)位于卷曲螺旋域編碼區(qū)，這能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄框架轉(zhuǎn)移和終止密碼子的提前出現(xiàn)，最終導(dǎo)致一個(gè)不完整的卷曲螺旋區(qū)域形成。我們進(jìn)行了該突變的功能分析，結(jié)果顯示，截短了人的SYCP3失去了介導(dǎo)蛋白質(zhì)間相互作用的功能。

這些發(fā)現(xiàn)代表著第一個(gè)常染色體精子缺乏相關(guān)基因的識(shí)別過(guò)程，即在Y染色體AZF區(qū)域以外的，位于人12號(hào)染色體的SYCP3。Bolor等[21]隨后報(bào)道了人SYCP3基因突變與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)，26個(gè)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的女性中有2人攜帶SYCP3基因獨(dú)立的雜合核苷酸突變，這在150名可生育女性的檢測(cè)結(jié)果中是不存在的。對(duì)隱匿這2種突變之一的微基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示這兩種突變均影響正常剪接，可能導(dǎo)致c端突變蛋白的產(chǎn)生。當(dāng)在不同的系統(tǒng)中共同表達(dá)時(shí)，這種突變蛋白可在體外與其野生型相互作用，抑制SYCP3蛋白質(zhì)形成正常的纖維。已有研究顯示，這些突變可能會(huì)通過(guò)顯性抑制的方式導(dǎo)致異常的聯(lián)合絲復(fù)合物的形成，從而導(dǎo)致染色體行為異常，這可能會(huì)反過(guò)來(lái)導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。這些數(shù)據(jù)表明，SYCP3上的突變會(huì)通過(guò)減數(shù)分裂阻滯導(dǎo)致男性精子缺乏和女性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。

由于發(fā)現(xiàn)SYCP3基因突變導(dǎo)致男性不育，所以現(xiàn)在許多研究人員在尋找其他可能導(dǎo)致男性不育的常染色體基因突變。

KLHL10 2006年，Yatsenko等采用了一種新的方式來(lái)識(shí)別與男性不育有關(guān)的基因[22]。他們探索了從人精液中惰性轉(zhuǎn)錄精細(xì)胞里獲得mRNA全長(zhǎng)的可行性，以此作為從候選生殖相關(guān)基因中鑒別生殖相關(guān)突變的非侵入性診斷方式。精子濃度范圍大的不育癥患者，其多種單倍體生殖細(xì)胞表達(dá)基因的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的效率為91%～99%。使用這種方法,研究者們確定了7名少精子癥患者生殖細(xì)胞特異性基因KLHL10(位于17q21)上的錯(cuò)誤和剪接突變。鼠KLHL10是精子形成的關(guān)鍵基因，且其通過(guò)劑量敏感的方式發(fā)揮作用。雜合性的KLHL10無(wú)效突變的特點(diǎn)是生殖細(xì)胞損失和精子細(xì)胞形態(tài)缺陷[23]。270個(gè)嚴(yán)重少精癥患者中有3人存在KLHL10突變，而在395人的對(duì)照組中沒(méi)有這種情況。在酵母菌相互作用實(shí)驗(yàn)中，2個(gè)KLHL10錯(cuò)義突變(A313T和Q216P)導(dǎo)致其翻譯產(chǎn)物與野生型蛋白質(zhì)形成受損的同源二聚體，最終導(dǎo)致蛋白功能障礙。這些結(jié)果表明，少精癥患者的KLHL10突變減少了同源二聚體的形成。

Dieterich等[24,25]對(duì)10個(gè)不育癥男性進(jìn)行了全基因組微衛(wèi)星掃描分析，這10個(gè)患者有正常體細(xì)胞核型，但精子形態(tài)不典型，主要表現(xiàn)為大頭精子，不同數(shù)量的尾部以及染色體內(nèi)容增加。在這10個(gè)患者中，研究者們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)共同的純合性區(qū)域，該區(qū)域有極光激酶C基因(AURKC，位于19q13)，AURKC在睪丸中有顯著表達(dá)[26,27]，并被推測(cè)參與胞質(zhì)分裂，有絲分裂和減數(shù)分裂[28,29]。在全部10個(gè)患者中均檢測(cè)到AURKC編碼區(qū)存在單個(gè)核苷酸缺失(c.144delC)?；A(chǔ)突變(L49Wfsx22)導(dǎo)致翻譯過(guò)早終止，產(chǎn)生一種缺乏激酶結(jié)構(gòu)域的截短蛋白。體內(nèi)和體外的功能分析顯示了截短蛋白功能嚴(yán)重缺失。AURKC的純合突變導(dǎo)致大頭的多倍體精子形成，并導(dǎo)致男性不育。另有研究報(bào)道，AURKC顯著突變導(dǎo)致巨型精子癥[30,31]。

SPATA16 圓頭精子癥是一種罕見(jiàn)的疾病(在不育男性中發(fā)生率<0.1%)，為嚴(yán)重的精子畸形癥，表現(xiàn)為一次射出的精液中全部都是圓頭精子而無(wú)頂體精子，或一部分是圓頭精子、同時(shí)伴有不同比例(20%～90%)的精子頂體缺乏[32,33]。精液中全都是圓頭精子的男性是沒(méi)有生育能力的，這些患者即使是借助ICSI，生育率仍然很低。圓頭精子癥源于精子形成障礙，雖然其根本原因仍未確定，但家族病例報(bào)告[34]和逆行性小鼠模型實(shí)驗(yàn)[35,36]支持遺傳因素的病因理論。然而，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可誘發(fā)疾病的突變。Dam等[33]報(bào)道了1個(gè)家族中的3個(gè)不育癥兄弟均存在精子生成特異性基因SPATA16(位于3q26)的純合性突變。2014年，Karaca等[37]報(bào)道了第一例成功通過(guò)ICSI授孕成功的SPATA16純合子突變的29歲不育癥男性病例。

結(jié)論

男性因素不育是導(dǎo)致不孕不育的重要原因。目前男性不育的幾個(gè)原因，包括內(nèi)分泌疾病，染色體異常和Y染色體的微缺失已確定。然而，大多數(shù)的男性不育癥仍然無(wú)法解釋，非梗阻性無(wú)精子癥更是精子缺乏癥最嚴(yán)重的形式。據(jù)估計(jì)，超過(guò)2 500個(gè)基因在精子發(fā)生中發(fā)揮作用，并很可能這些基因突變或異常導(dǎo)致許多不明原因的男性不育癥患者。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，尤其是高通量測(cè)序技術(shù)和基因捕獲技術(shù)臨床應(yīng)用的發(fā)展，會(huì)有越來(lái)越多的與不育有關(guān)的新基因被發(fā)現(xiàn)，將為男性不育的遺傳學(xué)診斷開(kāi)辟新的道路。

1HvidmanHW,KathrineBirchP,LarsenEC,etal.Individualfertilityassessmentandpro-fertilitycounselling;shouldthisbeofferedtowomenandmenofreproductiveage.HumanReproduction,2015,30:9-15.

2MatzukMM,LambDJ.Geneticdissectionofmammalianfertilitypathways.NatureCellBiology,2002,4:s41-49.

3KrauszC,ChianeseC,GiachiniC,etal.TheYchromosome-linkedcopynumbervariationsandmalefertility.JournalofEndocrinologicalInvestigation,2011,34:376-382.

4VogtP,ChandleyAC,HargreaveTB,etal.Microdeletionsininterval6oftheYchromosomeofmaleswithidiopathicsterilitypointtodisruptionofAZF,ahumanspermatogenesisgene.HumanGenetics,1992,89:491-496.

5ReijoR,LeeTY,SaloP,etal.DiversespermatogenicdefectsinhumanscausedbyYchromosomedeletionsencompassinganovelRNA-bindingproteingene.NatureGenetics,1995,10:383-393.

6VogtP,EdelmannA,KirschS,etal.HumanYchromosomeazoospermiafactors(AZF)mappedtodifferentsubregionsinYq11.HumanMolecularGenetics,1996,5:933-943.

7ManuelaS,FrankT,JRgG,etal.ClinicalconsequencesofmicrodeletionsoftheYchromosome:theextendedMünsterexperience.ReproductiveBiomedicineOnline,2008,16:289-303.

8MclachlanRI,O’BryanMK.ClinicalReview#:Stateoftheartforgenetictestingofinfertilemen.JClinEndocrinolMetab,2010,95:1013-1024.

9KenanDJ,QueryCC,KeeneJD.RNArecognition:towardsidentifyingdeterminantsofspecificity.TrendsinBiochemicalSciences,1991,16:214-220.

10BurdCG,DreyfussG.ConservedstructuresanddiversityoffunctionsofRNA-bindingproteins.Science,1994,265:615-621.

11KlausD,RicardoSR,AnneKarenF,etal.HomozygousmutationofAURKCyieldslarge-headedpolyploidspermatozoaandcausesmaleinfertility.NatureGenetics,2007,39:661-665.

12DamAHDM,KoscinskiI,KremerJAM,etal.HomozygousMutationinSPATA16isAssociatedwithMaleInfertilityinHumanGlobozoospermia.AmericanJournalofHumanGenetics,2007,81:813-20.

13ElliottDJ,MillarMR,OgheneK,etal.ExpressionofRBMinthenucleiofhumangermcellsisdependentonacriticalregionoftheYchromosomelongarm.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1997,94:3848-3853.

14SunC,SkaletskyH,BirrenB,etal.AnazoospermicmanwithadenovopointmutationintheY-chromosomalgeneUSP9Y.NatureGenetics,1999,23:429-32.

15YuanL,LiuJG,ZhaoJ,etal.TheMurineSCP3GeneIsRequiredforSynaptonemalComplexAssembly,ChromosomeSynapsis,andMaleFertility.MolecularCell,2000,5:73-83.

16DobsonMJ,PearlmanRE,KaraiskakisA,etal.Synaptonemalcomplexproteins:occurrence,epitopemappingandchromosomedisjunction.JournalofCellScience,1994,107:2749-2760.

17LammersJH,OffenbergHH,AalderenMV,etal.ThegeneencodingamajorcomponentofthelateralelementsofsynaptonemalcomplexesoftheratisrelatedtoX-linkedlymphocyte-regulatedgenes.MolecularCellularBiology,1994,14:1137-1146.

18YuanL,PelttariJ,BrundellE,etal.ThesynaptonemalcomplexproteinSCP3canformmultistranded,cross-striatedfibersinvivo.JournalofCellBiology,1998,142:331-339.

19MiyamotoT,HasuikeS,YogevL,etal.AzoospermiainpatientsheterozygousforamutationinSYCP3.Lancet,2003,362:1714-1719.

20MeuwissenRL,OffenbergHH,DietrichAJ,etal.Acoiled-coilrelatedproteinspecificforsynapsedregionsofmeioticprophasechromosomes.EmboJournal,1992,11:5091-5100.

21BolorH,MoriTS,ItoY,etal.MutationsoftheSYCP3geneinwomenwithrecurrentpregnancyloss.AmericanJournalofHumanGenetics,2009,84:14-20.

22YatsenkoA,RoyAR,MaL,etal.Non-invasivegeneticdiagnosisofmaleinfertilityusingspermatozoalRNA:KLHL10mutationsinoligozoospermicpatientsimpairhomodimerization.HumanMolecularGenetics,2006,15:3411-3419.

23WeiY,LangM,BurnsKH,etal.Haploinsufficiencyofkelch-likeproteinhomolog10causesinfertilityinmalemice.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2004,101:7793-7798.

24DeniseE.Geneticapproachtomalemeioticdivisiondeficiency:thehumanmacronuclearspermatozoa.MolecularHumanReproduction,2002,8:1-7.

25EscalierD.Humanspermatozoawithlargeheadsandmultipleflagella:aquantitativeultrastructuralstudyof6cases.BiologyoftheCell,2006,86:498-499.

26BernardM,SanseauP,HenryC,etal.CloningofSTK13,athirdhumanproteinkinaserelatedtoDrosophilaauroraandbuddingyeastIpl1thatmapsonchromosome19q13.3-ter.Genomics,1998,53:406-409.

27KimuraM,MatsudaY,YoshiokaT,etal.Cellcycle-dependentexpressionandcentrosomelocalizationofathirdhumanaurora/Ipl1-relatedproteinkinase,AIK3.JournalofBiologicalChemistry,1999,274:7334-7340.

28TangCJ,ChuangCK,HuHM,etal.ThezincfingerdomainofTzfpbindstothetbsmotiflocatedattheupstreamflankingregionoftheAie1 (aurora-C)kinasegene.JournalofBiologicalChemistry,2001,276:19631-19639.

29TangCJC,Chun-YiL,TangTK.DynamiclocalizationandfunctionalimplicationsofAurora-Ckinaseduringmalemousemeiosis.DevelopmentalBiology,2006,290:398-410.

30MariemBK,RaoudhaZ,RaduH,etal.AnewAURKCmutationcausingmacrozoospermia:implicationsforhumanspermatogenesisandclinicaldiagnosis.MolecularHumanReproduction,2011,17:762-768.

31MariemBK,CharlesC,BlumMGB,etal.IdentificationofanewrecurrentaurorakinaseCmutationinbothEuropeanandAfricanmenwithmacrozoospermia.HumanReproduction,2012,27:3337-3346.

32SatarDA,NarinR.Globozoospermia.CukurovaMedicalJournal,2014,39:1-6.

33DamAHDM,FeenstraI,WestphalJR,etal.Globozoospermiarevisited.HumanReproductionUpdate,2007,13:63-75.

34ZaidK,RadwanI,SamerG,etal.Evaluationandtreatmentoffamilialglobozoospermiainfivebrothers.FertilitySterility,2004,82:1436-1439.

35Kang-DeckerN,MantchevGT,JunejaSC,etal.LackofacrosomeformationinHrb-deficientmice.Science,2001,294:1531-1533.

36RyojiY,ChizuruI,YasukoN,etal.LackofacrosomeformationinmicelackingaGolgiprotein,GOPC.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2002,99:11211-11216.

37KaracaN,YilmazR,KantenGE,etal.FirstsuccessfulpregnancyinaglobozoospermicpatienthavinghomozygousmutationinSPATA16.FertilitySterility,2014,102:103-107.

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.039

項(xiàng)目來(lái)源：甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：1606RJZA167);甘肅省中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目(編號(hào)：GZK-2014-48)

730050 蘭州市，甘肅省婦幼保健院

陜文生，730050 蘭州市，甘肅省婦幼保健院；

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