朱 磊 韓 麗 朱亞楠 龍翠英 鄭春玲(通訊作者)

1)河南漯河市中心醫(yī)院 漯河 462000 2)漯河醫(yī)專二附院 漯河 462000

骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植對缺血性大鼠治療效果及VEGF表達(dá)的影響

朱 磊1)韓 麗1)朱亞楠2)龍翠英1)鄭春玲1)(通訊作者)

1)河南漯河市中心醫(yī)院 漯河 462000 2)漯河醫(yī)專二附院 漯河 462000

目的 研究骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)對缺血性大鼠的治療效果。方法 將30只成年雌性SD大鼠制備成大腦中動脈缺血2 h再灌注24 h動物模型，按隨機(jī)原則分為對照組和實驗組，對照組模型制備成功后，不給予任何干預(yù)，自由飲食。實驗組于缺血再灌注24 h后經(jīng)尾靜脈給予BMSCs 3×106，所有大鼠于缺血再灌注1 d、3 d和7 d進(jìn)行神經(jīng)功能評分，免疫組化法測定VEGF表達(dá)水平。結(jié)果 神經(jīng)功能評分：再灌注3 d、7 d后實驗組神經(jīng)功能評分明顯低于梗死對照組(P<0.05)。VEGF免疫組織化學(xué)染色：再灌注后3 d、7 d實驗組缺血區(qū)表達(dá)VEGF的細(xì)胞較梗死對照組明顯增多(P<0.05)。結(jié)論 BMSCs可顯著促進(jìn)腦缺血大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)，促進(jìn)VEGF的表達(dá)，以減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

腦梗死；大腦中動脈閉塞；骨髓基質(zhì)細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子

近年來，腦卒中的發(fā)病率、致殘率及病死率逐年增高。衛(wèi)計委完成的《全國第三次死因回顧抽樣調(diào)查報告》提示，腦血管病已上升為我國居民的首位死亡原因[1]。既往觀點(diǎn)認(rèn)為，神經(jīng)細(xì)胞受損后不能再生，因此，目前缺血性腦卒中的溶栓、抗凝及營養(yǎng)神經(jīng)等治療手段不能有效修復(fù)損傷的神經(jīng)細(xì)胞。而骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是一類多能干細(xì)胞，具有多向分化的性質(zhì)[2]。研究顯示BMSCs能改善多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的神經(jīng)功能[3]，其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用前景越來越受到人們的關(guān)注。

1 材料與方法

1．1 材料 30只SD雌性大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，10%水合氯醛、4%多聚甲醛、PBS緩沖夜、2% TTC染液、3% H2O2溶液，碘伏、抗原修復(fù)液、VEGF一抗、兔二抗。

1．2 BMSCs制備 在無菌條件下取出SD大鼠雙側(cè)股骨，暴露骨髓腔。貼壁+胰酶消化法分離培養(yǎng)大鼠 BMSCs，取第4代細(xì)胞進(jìn)行 Brdu標(biāo)記，收集、調(diào)整濃度后備用。

1．3 動物分組、 造模、 移植 將 30只 SD大鼠均分為2組，各組動物均采用Zea-Longa線栓法制成右側(cè)大腦中動脈梗死模型。實驗組于建模成功后 24 h在嚴(yán)格無菌操作下進(jìn)行 BMSCs移植，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，應(yīng)用微量注射器將總體積1 mL的單細(xì)胞懸液(內(nèi)含3×106個BMSCs)經(jīng)大鼠尾靜脈注入體內(nèi)。對照組同法注入1 mL PBS。動物蘇醒后送回籠內(nèi)正常飼養(yǎng)。

1．4 神經(jīng)功能評分 2組大鼠移植前及移植后1 d、3 d、7 d利用改良的神經(jīng)嚴(yán)重程度記分(mNSS)評分法[3]進(jìn)行神經(jīng)功能評分，每次評分隨機(jī)抽取6只大鼠，評分越高，神經(jīng)功能損失越嚴(yán)重。

1．5 TTC染色 各組大鼠于移植后3 d、7 d，麻醉后取腦，置于-20 ℃冰箱15 min取出，做連續(xù)冠狀切片，每片厚2 mm，給予TTC染色[4]。

1．6 HE染色 各組大鼠于移植后3 d、7 d，麻醉后灌注取腦，置于4%多聚甲醛固定，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)冠狀切片。HE染色、拍照、觀察。

1．7 VEGF免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片，脫蠟、脫水，用3% H2O2溶液滅活內(nèi)源性酶，熱抗原修復(fù)，滴加兔血清封閉液，滴加VEGF一抗(1∶100)4 ℃過夜，滴加生物素化兔二抗IgG，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，結(jié)果判定。

2 結(jié)果

2．1 MCAO大鼠腦梗死形態(tài)學(xué)觀察及神經(jīng)功能評分

2．1．1 大鼠腦梗死形態(tài)學(xué)觀察：SD大鼠經(jīng)過大腦中動脈結(jié)扎(MCAO)后運(yùn)動功能缺損如圖1A所示。同時，MCAO腦組織切片經(jīng)過TTC染色，形態(tài)學(xué)觀察如圖1B所示，切片中紅色區(qū)域代表正常腦組織，白色區(qū)域代表梗死區(qū)域。

圖1 MCAO大鼠腦梗死形態(tài)學(xué)觀察 A：SD大鼠經(jīng)大腦中動脈結(jié)扎后運(yùn)動功能缺損 B：制備成功的MCAO大鼠腦組織切片行TTC染色，切片中正常區(qū)域染為紅色，缺血梗死區(qū)域染為白色

2．1．2 大鼠神經(jīng)功能評分結(jié)果：所有大鼠都于模型制備前以及梗死后1 d，給藥后3 d、7 d分別給予mNSS 評分，結(jié)果顯示給藥后3 d、7 d BMSCs組神經(jīng)功能評分較梗死對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 BMSCs組和梗死對照組各時間段mNSS評分

2．2 HE染色結(jié)果 大鼠腦切片行HE染色顯示，梗死灶大部分位于大腦皮質(zhì)和基底節(jié)。BMSCs組與梗死對照組梗死區(qū)可見較多神經(jīng)細(xì)胞的缺失，同時伴格子細(xì)胞及中性白細(xì)胞。見圖3。

圖3 A：梗死對照組 B：BMSCs組HE染色，×200

2．3 VEGF表達(dá) 梗死對照組及BMSCs組缺血區(qū)可見陽性標(biāo)記細(xì)胞(如箭頭所示)，其中梗死對照組陽性細(xì)胞明顯少于BMSCs組。見圖4。BMSCs組在梗死3 d、7 d時的VEGF表達(dá)明顯多于梗死對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖4 BMSCs治療組MCAO大鼠VEGF的表達(dá)明顯較梗死對照組增加 A：梗死對照組 B：BMSCs組VEGF免疫組織化學(xué)染色，×400

圖5 BMSCs組VEGF表達(dá)較梗死對照組明顯增加

3 討論

腦梗死后局部腦動脈閉塞，腦組織灌流量降低，局部腦缺血、缺氧，腦組織功能的興奮性降低，腦代謝率的下降，大腦皮質(zhì)和皮質(zhì)下神經(jīng)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損。因此，改善腦代謝、增加腦血流量是治療腦梗死后神經(jīng)損傷的重要方法。研究已證實，及時恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)，可減少腦細(xì)胞的損傷。同時實驗室的研究結(jié)果提示，BMSCs移植對腦缺血動物模型具有明顯的治療效果。BMSCs移植能明顯促進(jìn)缺血區(qū)新生血管生成，減少梗死面積，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，其主要是通過分泌多種營養(yǎng)因子，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成、血管形成等多種機(jī)制實現(xiàn)。同時，BMSC還能增強(qiáng)殘留腦組織特別是缺血區(qū)周圍的腦組織的功能和可塑性[5]。研究表明，提高腦組織的可塑性可促進(jìn)卒中后神經(jīng)功能的恢復(fù)[6]。血管發(fā)生的增多，可提高缺血半暗帶區(qū)血液供應(yīng)，從而挽救梗死周圍區(qū)頻死的神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。Zhang等[7-8]研究也顯示，血管密度高的卒中患者比血管密度低的患者功能恢復(fù)快，同時存活時間也較長。新形成的血管可以提高缺血周圍腦組織的血流灌注，改善微循環(huán)，從而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。而VEGF具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)血管形成的特性[9]。在缺血缺氧狀態(tài)下，VEGF 的表達(dá)可明顯增加[10]。而VEGF可能是通過激活細(xì)胞上的磷脂酶C短暫地誘導(dǎo)Ca2+離子釋放，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖進(jìn)而促進(jìn)新血管的形成[11-12]。因此，BMSCs可增加VEGF的表達(dá)，促進(jìn)新生血管的形成，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，為腦梗死的治療和恢復(fù)提供可能。

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(收稿2016-08-21)

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