劉 佳 李肖楠 孫思銘 王越暉

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院老年病科，長春130041)

·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

硫酸鋅對血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激保護(hù)作用的研究①

劉 佳 李肖楠 孫思銘②王越暉

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院老年病科，長春130041)

目的：研究硫酸鋅對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。方法：用過氧化氫(H2O2)建立血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型， 觀察正常對照組、H2O2組、硫酸鋅組及硫酸鋅治療組各組細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)。采用硝酸還原酶法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中一氧化氮(NO)，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定培養(yǎng)液中內(nèi)皮素(ET)含量，用蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blot)檢測細(xì)胞的血紅素加氧酶(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)水平，用末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測HUVEC的凋亡情況。結(jié)果：硫酸鋅能顯著提高H2O2誘導(dǎo)的HUVEC培養(yǎng)液中的NO含量，降低ET含量，提高細(xì)胞HO-1、SOD和CAT水平，減少H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)量。結(jié)論：硫酸鋅具有較強(qiáng)對抗內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的能力，并具有一定預(yù)防作用，硫酸鋅有望成為提高HUVECs抗氧化損傷能力的有效藥物。

氧化應(yīng)激；硫酸鋅；過氧化氫；內(nèi)皮細(xì)胞

血管內(nèi)皮細(xì)胞的改變與諸多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，許多疾病早期即存在血管內(nèi)皮功能的失調(diào)，而內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是糖尿病血管并發(fā)癥的始動因素和中心環(huán)節(jié)[1]。氧化應(yīng)激是糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙的重要原因之一[2]，氧化應(yīng)激早在糖耐量異常時就已經(jīng)出現(xiàn)，隨著糖代謝異常的加重，氧化應(yīng)激損傷也與之成正比，從而引起微血管和大血管病變，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病發(fā)病率和死亡率的顯著增加[3]。因此，尋找合適的抗氧化應(yīng)激保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物，對預(yù)防和治療糖尿病心血管并發(fā)癥有著重要意義。

鋅(Zn)作為人體必需的微量元素之一，有許多生物功能。Zn參與胰島素的合成、分泌，調(diào)節(jié)胰島素的生物活性和抗原性，因此，Zn與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展及并發(fā)癥的發(fā)生都密切相關(guān)[4]。Zn亦可作為多種酶和蛋白質(zhì)的輔助因子參與抗氧化作用[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，老年2型糖尿病患者血清離子紊亂，其中鋅離子、鎂離子在糖尿病組患者血清中明顯下降，氧化損傷明顯增加，內(nèi)皮功能顯著受損。目前的研究結(jié)果提示我們，給糖尿病患者尤其是老年糖尿病患者補(bǔ)充Zn可能緩解糖尿病及其相關(guān)的血管并發(fā)癥[6]。因此，本文研究目的在于探討鋅是否具有抵抗氧化應(yīng)激發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮的作用，為防治糖尿病心血管并發(fā)癥提供研究基礎(chǔ)。本研究用H2O2誘導(dǎo)的HUVEC建立氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞模型，觀察和評價(jià)了硫酸鋅對內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的預(yù)防和治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVEC是購自Biosun公司，牛血清(FBS)及Trypsin-EDTA(1×)(濃度0.25%)均購自Gibco公司，倒置顯微鏡(CKX)為日本Olympus，NO及ET檢測試劑盒均購自凱基公司，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自公司YEASEN，HO-1、SOD和CAT抗體購自Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞傳代3～6代至穩(wěn)態(tài)后，將細(xì)胞3×105ml-1濃度均勻鋪于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，分為4組：①正常對照組：不加H2O2處理；②硫酸鋅組：加硫酸鋅組(終濃度為50 μmol/L)；③H2O2造模組：加H2O2處理(終濃度為250 μmol/L)；④硫酸鋅治療組：加H2O2和硫酸鋅(H2O2終濃度為250 μmol/L+硫酸鋅終濃度為50 μmol/L) ；每次檢測每組設(shè)6個復(fù)孔，置于37℃，5%CO2飽和度恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 NO含量的測定 將細(xì)胞按照上述分組方法進(jìn)行培養(yǎng)，分別收集細(xì)胞上清液，采用NO檢測試劑盒(KGT00725-KGT00750)，應(yīng)用硝酸還原酶法，依照試劑盒中描述的實(shí)驗(yàn)方法和步驟，檢測HUVCE上清液中NO濃度。

1.2.3 ET含量的測定 將細(xì)胞按照上述分組方法進(jìn)行培養(yǎng)，分別收集細(xì)胞上清液，應(yīng)用ELISA法，按照ET檢測試劑盒中描述的實(shí)驗(yàn)方法和步驟，檢測HUVEC上清液中ET濃度。

1.2.4 細(xì)胞凋亡情況的測定 接種于6孔板中的細(xì)胞按上述分組方法進(jìn)行培養(yǎng)，將已爬好細(xì)胞的爬片用500 μl PBS浸洗1次，時間1 min ；加入4% 的多聚甲醛固定爬片15 min ，用0.5% Triton X-100(PBS配置) 200 μl室溫通透20 min。清洗爬片后，加入100 μl DNA酶Ⅰ室溫孵5 min，并用去離子水洗3～4次，按照TUNEL試劑盒說明書描述進(jìn)行細(xì)胞染色，在熒光顯微鏡下分析樣本，在651 nm下檢測Alexa Fluor 647紅色熒光來檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.5 免疫蛋白電泳 胰酶消化分組培養(yǎng)的細(xì)胞，用PBS沖洗2次，收細(xì)胞懸液于1.5 ml EP管中，加入4℃ 預(yù)冷蛋白裂解液7.6 ml ，冰上裂解30 min ；4℃ 離心，13 200 r/min，15 min ；收取細(xì)胞裂解液。將玻璃板洗干凈，固定于電泳槽上，經(jīng)過加樣、電泳后，將蛋白質(zhì)從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持體，用5%脫脂奶粉 (TBST配制)，封閉。平放于搖床平臺上，室溫溫育1～2 h后取出膜在TBST中洗滌1次；將膜放入可加熱封接的塑料袋中，分別加入SOD、CAT、HO-1(工作濃度1∶100)一抗，4℃過夜。取出膜在TBST中洗滌每次10 min，共3次；將膜放入可加熱封接的塑料袋中，根據(jù)說明書加入適當(dāng)濃度的二抗，室溫溫育2 h。ECL發(fā)光檢測，在暗室用X線片曝光，顯影、定影后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 硫酸鋅對不同分組的內(nèi)皮細(xì)胞NO含量的影響 分別對正常對照組(HUVEC)，H2O2造模組(HUVEC+ H2O2),硫酸鋅組(HUVEC+ZnSO4)及硫酸鋅治療組(HUVEC+ H2O2/ZnSO4)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中的NO含量進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在H2O2造模組，NO含量顯著降低，ET含量明顯升高，與正常對照組、硫酸鋅組及硫酸鋅治療組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 硫酸鋅對不同分組的內(nèi)皮細(xì)胞NO表達(dá)的影響Fig.1 Effects of Zinc sulfate on NO expression in different HUVECs groupsNote: *.vs HUVEC,P<0.01; #.vs HUVEC+ZnSO4,P<0.01;△.vs HUVEC+H2O2/ZnSO4,P<0.01，n=6.

圖3 硫酸鋅對不同分組的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of Zinc sulfate on apoptosis in different HUVECs groups

圖4 硫酸鋅對不同分組的內(nèi)皮細(xì)胞SOD、CAT及HO-1蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Zinc sulfate on SOD,CAT,HO-1 protein expression of different HUVECs groupsNote: H2O2 vs control,*.P<0.01;H2O2 vs ZnSO4,#.P<0.05;H2O2 vs H2O2/ZnSO4,△.P<0.05.

圖2 硫酸鋅對不同分組的內(nèi)皮細(xì)胞ET表達(dá)的影響Fig.2 Effects of Zinc sulfate on ET expression in different HUVECs groupsNote: vs HUVEC,*.P<0.01;vs HUVEC+ZnSO4,#.P<0.01;vs HUVEC+H2O2/ZnSO4,△.P<0.01，n=6.

2.2 硫酸鋅對不同分組的內(nèi)皮細(xì)胞ET含量的影響 分別對正常對照組(HUVEC)，H2O2造模組(HUVEC+ H2O2)、硫酸鋅組(HUVEC+ZnSO4)及硫酸鋅治療組(HUVEC+ H2O2/ZnSO4)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中的ET含量進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在H2O2造模組， ET含量明顯升高，與正常對照組、硫酸鋅預(yù)防組及硫酸鋅治療組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

2.3 TUNEL試劑盒檢測內(nèi)皮細(xì)胞凋亡變化 在熒光顯微鏡下分析樣本，在651 nm下檢測Alexa Fluor 647紅色熒光，只在凋亡的細(xì)胞核中才有Alexa Fluor 647-12-dUTP摻入而定位的紅色熒光，TUNEL染色結(jié)果顯示加入H2O2孵育24 h的細(xì)胞組中大量細(xì)胞破碎、皺縮，同時加入硫酸鋅和H2O2細(xì)胞組被染成紅色的細(xì)胞較H2O2組減少，只加入硫酸鋅的細(xì)胞組中極個別的細(xì)胞被染成紅色，發(fā)生凋亡(見圖3)。

2.4 硫酸鋅對細(xì)胞內(nèi)HO-1、SOD和CAT表達(dá)情況的影響 免疫蛋白電泳結(jié)果顯示：加入H2O2處理的細(xì)胞組與正常對照組相比，SOD、CAT、HO-1蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.01)；與加入H2O2同時用硫酸鋅處理的細(xì)胞較H2O2處理組細(xì)胞在SOD、CAT、HO-1表達(dá)有明顯提高，二者之間差異顯著(P<0.05)，見圖4。

3 討論

內(nèi)皮功能障礙不僅是動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的早期關(guān)鍵因素[7]，也是糖尿病血管并發(fā)癥的始動因素和中心環(huán)節(jié)[1]，因此對抗內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞損傷，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是防治糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的有效治療手段。

鋅是人體非常重要的微量元素，攝入量雖少，但與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展及并發(fā)癥的發(fā)生都密切相關(guān)[4]。研究表明，鋅離子具有抗氧化、抗凋亡及維持膜穩(wěn)定性的作用，通過維持血管內(nèi)皮的完整性來保護(hù)血管內(nèi)皮對抗氧化應(yīng)激[8，9]。鋅在胰島β細(xì)胞中參與了胰島素的生成、儲存和分泌[4]。研究發(fā)現(xiàn)老年糖尿病患者補(bǔ)充Zn可能緩解糖尿病及其相關(guān)的血管并發(fā)癥[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)主要通過H2O2建立氧化應(yīng)激細(xì)胞損傷模型模擬糖尿病狀態(tài)下對血管內(nèi)皮的氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而研究硫酸鋅對血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用。

NO是血管內(nèi)皮釋放的最重要的血管舒張因子之一，對于維持內(nèi)皮細(xì)胞的完整性和平衡性非常重要[10]。ET是廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中調(diào)節(jié)心血管功能的重要因子，ET-1水平則反映了內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度，對維持血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)也發(fā)揮重要作用[11]。

當(dāng)血管內(nèi)皮的穩(wěn)態(tài)被破壞后，血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的多種活性因子，如NO、ET等，改變血管的緊張度和血液中白細(xì)胞、血小板及內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，導(dǎo)致血管舒縮功能障礙和啟動內(nèi)皮炎癥網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，進(jìn)而引發(fā)心血管疾病，因此，內(nèi)皮功能障礙已成為心血管疾病的一個重要靶點(diǎn)[10,11]。高糖條件下血管活性因子含量的失衡可致血管內(nèi)皮損傷，進(jìn)而促進(jìn)糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生[12]。

本研究對內(nèi)皮細(xì)胞上清液中NO、ET含量測定，發(fā)現(xiàn)上清液中NO含量降低、ET含量增加，NO水平降低將導(dǎo)致血管收縮，ET導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。而硫酸鋅可以提高內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO水平，減少ET的分泌，說明硫酸鋅可以顯著對抗H2O2產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

氧化應(yīng)激主要來源于抗氧化組織破壞增加及自由基生成增多，打破機(jī)體的氧化與抗氧化平衡，機(jī)體便會產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷[3]。SOD、CAT、HO-1是細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑，本研究發(fā)現(xiàn)，與H2O2組細(xì)胞相比，加入硫酸鋅的細(xì)胞SOD、CAT、HO-1表達(dá)明顯增加，結(jié)果表明硫酸鋅可以清除細(xì)胞內(nèi)自由基，上調(diào)氧化防御系統(tǒng)活性，對抗氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用 。

高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與脂肪酸代謝的變化、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡蛋白酶-3的激活及胰島素激活蛋白激酶能力的下降有關(guān)[13]。我們研究發(fā)現(xiàn)，H2O2組細(xì)胞較正常對照組細(xì)胞凋亡率顯著增加，加入硫酸鋅后，細(xì)胞凋亡率顯著降低，說明細(xì)胞模型系統(tǒng)中增加鋅離子濃度能顯著對抗氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率。

綜上所述，本文通過H2O2建立對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，模擬糖尿病患者體內(nèi)高糖對血管內(nèi)皮的損傷，研究硫酸鋅對血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷條件下的治療及預(yù)防作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫酸鋅能顯著對抗細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，促進(jìn)損傷細(xì)胞內(nèi)NO分泌，抑制ET分泌，維持血管收縮和舒張的平衡，提高各種抗氧化劑如SOD、CAT、HO-1在體內(nèi)的活性，進(jìn)而上調(diào)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的活性，清除過多自由基，降低細(xì)胞凋亡率，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。我們的研究證實(shí)了鋅對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。研究結(jié)果提示我們，補(bǔ)鋅可能會改善糖尿病患者氧化應(yīng)激狀態(tài)，通過補(bǔ)鋅的輔助治療可能在一定程度上減緩糖尿病及糖尿病并發(fā)癥進(jìn)展，為糖尿病患者的治療和預(yù)后帶來了新的前景。

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[收稿2016-12-13 修回2017-01-03]

(編輯 倪 鵬)

Effects of Zinc sulfate on preventing vascular endothelial cells from oxidative stress

LIUJia,LIXiao-Nan,SUNSi-Ming,WANGYue-Hui.

DepartmentofGeriatrics,theFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China

Objective:To investigate the effects of Zinc sulfate on preventing human umbilical veins endothelial cells (HUVECs) from oxidative stress.Methods: Hydrogen peroxide was used to stimulate HUVECs to build the oxidative stress model in vitro.HUVECs were divided into normal group,H2O2group,Zinc sulfate group and Zinc sulfate treated group.Method of nitrate reductase was used to detect the content of nitric oxide(NO) and ELISA was used to detect the content of endothelin(ET) in supernatant in different groups.The level of HO-1，SOD and CAT of HUVECs were measured by Western blot.Apoptosis of HUVECs was examined by TUNEL as well.Results: Zinc sulfate could enhance the content of NO and decrease the content of ET in the supernatant,which induced by hydrogen peroxide on HUVECs.Zinc sulfate could also increase the level of HO-1，SOD and CAT obviously and decrease the apoptosis cells significantly induced by H2O2.Conclusion: Zinc sulfate play an important role in resisting oxidative stress in HUVECs,and maybe prevent HUVECs from oxidative stress damage.Zinc sulfate is expected to be an effective medicine on improving endothelial cells anti-oxidative ability.

Oxidative stress；Zinc sulfate；Hydrogen peroxide；Endothelial cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.002

①本文受國家自然基金項(xiàng)目(81671378,81470061)和吉林省科技廳中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才及團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(20140519012JH)資助。

劉 佳(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事糖尿病內(nèi)皮功能方面研究，E-mail:412132123@qq.com。

及指導(dǎo)教師：王越暉(1970年-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病心血管并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制與防治方面的研究，E-mail: yuehuiwang300@hotmail.com。

R453.9

A

1000-484X(2017)02-0170-04

②吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春130118。