曹 玲 李桉棋 李 峰 黃 波 張 毅

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心，鄭州450052)

合成免疫學(xué)①

曹 玲 李桉棋 李 峰 黃 波②張 毅

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心，鄭州450052)

合成免疫學(xué)是合成生物學(xué)和免疫學(xué)的綜合。合成免疫學(xué)是一門新興的科學(xué)領(lǐng)域，它是免疫學(xué)和合成生物學(xué)的交叉學(xué)科，目的是利用生物技術(shù)手段來合理調(diào)節(jié)及控制免疫反應(yīng)從而使患者獲益(圖1)。 在出現(xiàn)免疫系統(tǒng)紊亂時(shí)需要校正免疫反應(yīng)，例如，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中應(yīng)用免疫細(xì)胞來抑制促炎介質(zhì)。同時(shí)也可以利用免疫細(xì)胞來治療疾病，例如，利用免疫細(xì)胞的細(xì)胞毒作用來清除腫瘤。干擾免疫系統(tǒng)可以通過使用重組細(xì)胞因子或重新編程免疫細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)，重組細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子或治療性抗體已經(jīng)應(yīng)用于患者，但更多的基于合成免疫學(xué)原理的治療藥物和治療手段尚處于臨床前測(cè)試或臨床研究階段。在分子水平上，研究人員通過改造和修飾抗體衍生物和抗體模擬物等新的治療藥物以提高其治療的安全性和有效性。在細(xì)胞水平上，人們則通過工程化免疫細(xì)胞改變其效應(yīng)目標(biāo)、從而提高免疫細(xì)胞的功能。合成免疫學(xué)一種可以合理設(shè)計(jì)并構(gòu)建復(fù)雜免疫反應(yīng)功能的合成系統(tǒng)，可以最大限度的實(shí)現(xiàn)調(diào)控免疫反應(yīng)的目的，它主要通過人工合成的成分來控制免疫反應(yīng)，如納米材料、免疫佐劑和疫苗等。這些技術(shù)目前仍處于探索階段，為化學(xué)家、生物學(xué)家和臨床醫(yī)生帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

在本綜述中，我們討論了免疫系統(tǒng)調(diào)控的方法和途徑以及帶來的挑戰(zhàn)，并且展望了未來的治療策略。我們認(rèn)為，合成免疫學(xué)的應(yīng)用必將成為一種越來越強(qiáng)大的治療途徑。

1 免疫系統(tǒng)的分子工程化

多種治療性分子可以用來干擾免疫系統(tǒng)，在這篇綜述中，我們僅討論基于人源成分的工程化分子，例如治療性抗體、嵌合蛋白、抗體衍生物和抗體類似物。第一代內(nèi)源工程化分子包括重組人細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。

1.1 治療性抗體 20世紀(jì)中期，研究人員開始利用治療性抗體治療人類疾病。20世紀(jì)70年代，Milstein 和Kohler報(bào)道了第一個(gè)工程化的單克隆抗體，莫羅單抗CD3(OKT3)，它通過干擾T細(xì)胞的激活應(yīng)用于移植排斥，在1986年被美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市。目前，約30種治療性抗體已被批準(zhǔn)，并且超過300種化合物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)[1]。這些治療性抗體可在體外合成(人抗體)，或者通過小鼠產(chǎn)生，然后被工程化以生產(chǎn)更多的模擬人源分子(嵌合和人源化抗體)。

圖1 合成免疫學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Diagram of synthetic immunologyNote: Chemistry,biology and clinical disciplines were combined together,various treatment approaches such as synthetic molecules,cells or other products were applied to promote the development of synthetic immunology

抗體的主要優(yōu)點(diǎn)是其突出的親和力和特異性以及較長(zhǎng)的血漿半衰期(表1)。此外，抗體與配體結(jié)合時(shí)可以通過多種機(jī)制起作用，第一，抗體的結(jié)合可以中和配體的功能。第二，抗體可以被改造從而向靶向位置遞送有毒物質(zhì)。第三，抗體可介導(dǎo)ADCC效應(yīng)(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)。第四，抗體與細(xì)胞的結(jié)合可介導(dǎo)CDC效應(yīng)(補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性)，通過補(bǔ)體因子誘導(dǎo)凋亡。

然而，使用治療性抗體也有局限性。因其體積較大和空間構(gòu)象的限制，治療性抗體不能穿過細(xì)胞膜，只能與細(xì)胞外的分子相互作用，而且組織滲透性較低。相對(duì)較高的價(jià)格也是限制治療性抗體廣泛應(yīng)用的原因。

下面我們將討論幾種干擾人類免疫系統(tǒng)的抗體，包括針對(duì)免疫細(xì)胞上促炎性分子或表面受體的抗體以及可以介導(dǎo)免疫細(xì)胞效應(yīng)功能的抗體。

1.1.1 單克隆抗體 單克隆抗體從非人類物種制備，并且不需人源化便可以直接使用。例如，OKT3是一種針對(duì)CD3的單克隆抗體，已經(jīng)被用于阻斷器官移植后T細(xì)胞的活化。新一代單克隆抗體已實(shí)現(xiàn)可以雙重特異性地與目標(biāo)相互作用，例如，卡妥索單抗是三功能性抗體，可以雙特異性地靶向過度表達(dá)在多種實(shí)體癌的上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)的兩個(gè)跨膜糖蛋白，同時(shí)可以結(jié)合T細(xì)胞特異性表面蛋白CD3，因而卡妥索單抗可借助其Fc區(qū)吸引免疫細(xì)胞，同時(shí)可以通過抗CD3抗體招募T細(xì)胞和ADCC[2]。這種由小鼠IgG2a，大鼠IgG2b雜交產(chǎn)生的抗體在2009年被批準(zhǔn)用于EpCAM陽性腫瘤惡性腹水的治療。

治療性抗體的安全性不僅僅是免疫原性的問題；非人源抗體成分形成的人抗藥物抗體帶來的風(fēng)險(xiǎn)尤其值得重視。研究發(fā)現(xiàn)，在卡妥索單抗藥代動(dòng)力學(xué)第Ⅱ階段研究中，接受治療的所有患者體內(nèi)都可以檢測(cè)到抗藥物抗體[3]。

1.1.2 嵌合單克隆抗體 嵌合單克隆抗體，是由小鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)結(jié)合，形成含有約75%人源序列的蛋白[4]。與非人源的單克隆抗體相比，使用人源的恒定區(qū)序列作為鉸鏈區(qū)能夠減少人體抗藥抗體的形成。

幾種治療性抗體(Ximab)已成功進(jìn)入臨床應(yīng)用。靶向抗腫瘤壞死因子(TNF)的嵌合單克隆抗體英利昔單抗(Infliximab)用于治療幾種嚴(yán)重型的自身免疫性疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸疾病。 利妥昔單抗(Rituximab)，抗CD20嵌合人鼠單抗，不僅用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤，而且還可用于治療常規(guī)療法治療失敗的自身免疫疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)相關(guān)小血管炎。機(jī)制是抗體結(jié)合CD20陽性B細(xì)胞，引起ADCC，CDC，進(jìn)而激活CD20導(dǎo)致B細(xì)胞凋亡耗盡[5]。巴利昔單抗(Basiliximab)，一種針對(duì)T細(xì)胞表面白細(xì)胞介素2受體α鏈的抗體，通過阻斷T細(xì)胞活化從而防止器官移植的排斥反應(yīng)。

1.1.3 人源化單克隆抗體 一種新的治療性抗體，由鼠源的抗原結(jié)合序列(又稱為互補(bǔ)決定區(qū))與人類抗體鉸鏈區(qū)連接構(gòu)成。非人源的序列減少到抗體序列的5%，進(jìn)一步降低了免疫原性[4]。其中，阿侖單抗(Alemtuzumab)可以結(jié)合淋巴細(xì)胞表面CD52分子，通過ADCC作用清除這些細(xì)胞。另一種人源化單克隆抗體，那他珠單抗(Natalizumab)，可以結(jié)合整合素α4(α4 integrin)，從而阻斷淋巴細(xì)胞的遷移，用于多發(fā)性硬化和克羅恩病的治療[6]。盡管這種抗體的免疫原性已經(jīng)明顯降低，但可以激活一些高致敏反應(yīng)[7]，有證據(jù)表明那他珠單抗會(huì)增加感染的風(fēng)險(xiǎn)，治療過程中并發(fā)進(jìn)展性多病灶性腦白質(zhì)病。具體說來，因?yàn)槊庖呒?xì)胞遷移受限，在中樞神經(jīng)的免疫監(jiān)視系統(tǒng)減少，從而使病毒變得活躍。

表1 基于合成免疫學(xué)的治療手段

Tab.1 Therapies based on synthetic immunology

方法疾病種類優(yōu)勢(shì)劣勢(shì)重組蛋白免疫缺陷、自身免疫疾病經(jīng)濟(jì)、安全、低免疫原性、良好的組織滲透性體內(nèi)半衰期短合成蛋白自身免疫疾病高親和性和特異性有產(chǎn)生免疫原性的危險(xiǎn)，體內(nèi)半衰期短，價(jià)格高人源性抗體自身免疫疾病高親和性和特異性、ADCC、CDC、攜帶毒性產(chǎn)物價(jià)格高，組織滲透性低雙特異性單克隆抗體腫瘤免疫治療高親和性和特異性、雙特異性、ADCC、CDC、攜帶毒性產(chǎn)物有產(chǎn)生免疫原性的危險(xiǎn)，體內(nèi)半衰期短，價(jià)格高抗體衍生物腫瘤免疫治療高親和性和特異性、良好組織滲透性、比抗體便宜體內(nèi)半衰期短抗體模擬物自身免疫疾病經(jīng)濟(jì)、高親和性和特異性體內(nèi)半衰期短同源造血干細(xì)胞基因治療免疫缺陷治療疾病有惡變的危險(xiǎn)過繼性免疫治療腫瘤免疫治療效能好、持久性治療價(jià)格高、腫瘤微環(huán)境的免疫抑制性導(dǎo)致的低效率

1.1.4 人單克隆抗體 近年來研究比較多的人單克隆抗體全部為人源序列，是由表達(dá)人源免疫球蛋白或雜交瘤的噬菌體、轉(zhuǎn)基因小鼠制備而成[8]。例如來自噬菌體并靶向腫瘤壞死因子(TNF)的阿達(dá)木單抗，以及FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于黑色素瘤的Ipilimumab 和Nivolumab兩種人單克隆抗體。

免疫治療最大的挑戰(zhàn)是要克服腫瘤部位的免疫抑制微環(huán)境。Ipilimumab 和Nivolumab兩種抗體通過激活T細(xì)胞來對(duì)抗惡性腫瘤，在 免疫治療領(lǐng)域取得了重大突破。當(dāng)CTLA-4與抗原提呈細(xì)胞表面的B7結(jié)合時(shí)會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞無能，而Ipilimumab通過與T細(xì)胞表面共刺激分子CTLA-4結(jié)合而阻斷兩者的結(jié)合，從而影響了CTLA-4的抑制作用(圖2)。用Ipilimumab治療惡性黑色素瘤可以延緩腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)病人平均生存期9到12個(gè)月[9]。Nivolumab 是一種人源IgG4 抗體，通過靶向T細(xì)胞表面程序性死亡分子-1(PD-1)促進(jìn)T細(xì)胞的激活(圖2)，從而延長(zhǎng)惡性黑色素瘤病人的生存期[10,11]。 研究發(fā)現(xiàn)，PD-1單抗免疫治療通過修復(fù)T細(xì)胞免疫反應(yīng)而達(dá)到清除腫瘤的目的[12]。兩種T細(xì)胞調(diào)節(jié)劑Ipilimumab 和Nivolumab在臨床上的聯(lián)合應(yīng)用可快速清除惡性黑色素瘤病人的腫瘤，并延長(zhǎng)他們的生存期，并且副作用未增加，仍在可耐受的范圍[13]。Nivolumab是第一個(gè)靶向PD-1的單克隆抗體且對(duì)無法手術(shù)或者轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)、轉(zhuǎn)移性腎癌都有良好的臨床療效[10,14]。Nivolumab的臨床實(shí)驗(yàn)顯示，在黑色素瘤入組患者中可達(dá)到30% 到40%的持續(xù)客觀反應(yīng)率(Objective response rates，ORR)(NCT00730639,NCT01721772,NCT01844505)[15,16]。

另一種PD-1通路上的單克隆抗體 anti-PD-L1 BMS-936559 (MDX-1105)已經(jīng)在臨床一期試驗(yàn)中顯示出良好的療效(NCT00729664) (圖2)[17]。有文獻(xiàn)報(bào)道，anti-CTLA4與anti-PD-1相比，臨床療效較差[18]，原因可能在于anti-CTLA4誘導(dǎo)的是T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的非特異性識(shí)別[19-24]。因此，臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)該優(yōu)先考慮使用靶向PD-1的單克隆抗體[25]。

臨床中常使用促炎性細(xì)胞因子來增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。多種細(xì)胞因子已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療惡性腫瘤。由于這些細(xì)胞因子是全身用藥，并且這些細(xì)胞因子代謝比較慢，所以經(jīng)常導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，可將細(xì)胞因子融合到靶向腫瘤的抗體中，在提高癌癥免疫療法療效的同時(shí)也可以降低不良反應(yīng)發(fā)生率[26]。一些融合了Fc結(jié)構(gòu)域或抗體不同區(qū)域的細(xì)胞因子，已經(jīng)進(jìn)入腫瘤免疫治療的Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)[27]。

正在臨床研究測(cè)試的治療性單克隆抗體逐年在增加，許多公司正在生產(chǎn)靶向促炎性細(xì)胞因子或免疫細(xì)胞表面受體的單克隆抗體來治療自身免疫性疾病。但這些抗體靶向的細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞是機(jī)體對(duì)病原體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)所必需的，在使用這些抗體時(shí)雖然能夠治療自身免疫病，卻抑制了機(jī)體對(duì)病原體的免疫應(yīng)答，因此容易合并感染[28]?？傊?，單克隆抗體有著出色的特異性和親和性，但與傳統(tǒng)免疫制劑相比不良反應(yīng)并沒有減少。

1.2 嵌合蛋白 調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的主要機(jī)制是結(jié)合或者中和促炎細(xì)胞因子，因此我們可以使用治療性抗體，也可以設(shè)計(jì)出能夠結(jié)合炎性細(xì)胞因子的嵌合蛋白質(zhì) 。當(dāng)工程化的嵌合蛋白與靶向的細(xì)胞因子結(jié)合后，因嵌合蛋白中主要為免疫球蛋白(圖3A)或白蛋白發(fā)揮作用，因此具有較高的親和性和特異性。

例如，為了阻斷炎癥因子TNF的作用，研究者將TNF受體2(TNFR2)與人源IgG1的Fc區(qū)相連設(shè)計(jì)出了嵌合蛋白依那西普(Etanercept)，目前已被廣泛應(yīng)用于臨床治療自身免疫性疾病(圖3B)。

圖2 用于免疫檢查點(diǎn)阻斷的單克隆抗體Fig.2 Human monoclonal antibodies for immuno-check-point blockade

1.3 抗體衍生物 抗體衍生物是一種新的抗體樣分子，從免疫球蛋白的可變區(qū)分離得到的抗體衍生物，具有生產(chǎn)成本低、組織穿透性強(qiáng)、免疫原性較低[29]、血清半衰期較短等優(yōu)點(diǎn)，目前已在免疫紊亂疾病及惡性腫瘤中開展臨床試驗(yàn)?？贵w衍生物通過接頭序列可以連接多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，因此可以包含幾個(gè)獨(dú)立的抗原結(jié)合位點(diǎn)，在體內(nèi)可結(jié)合多個(gè)化合物，目前多用于招募毒性免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織并靠近靶細(xì)胞。

1.3.1 雙特異性T細(xì)胞結(jié)合(BiTE)抗體 BiTE抗體是一種由可變結(jié)構(gòu)域的重鏈和輕鏈組成的單鏈多肽，重鏈和輕鏈通過柔性接頭序列連接[30](圖4A)，可以將抗CD3可變結(jié)構(gòu)域連接到任何靶點(diǎn)的可變區(qū)。因此，BiTE 抗體可以招募細(xì)胞毒性T細(xì)胞直接攻擊目標(biāo)靶點(diǎn)。

1.3.2 雙親和力重定向(DART)技術(shù) 像BiTE一樣，DART抗體可以結(jié)合兩個(gè)目標(biāo)。然而，DARTs與BiTE在結(jié)構(gòu)上不同：DARTs包含兩個(gè)多肽鏈，重鏈針對(duì)一個(gè)目標(biāo)，輕鏈針對(duì)另一個(gè)目標(biāo)，重鏈和輕鏈通過鏈間二硫橋相連(VLa-VHb或VLb-VHa)(圖4B)[31]。

圖3 嵌合蛋白Fig.3 Chimeric proteinsNote: A,bispecific IgG1;B,Synthetic protein etanercept is chimeric molecules linking IgG1 to target TNF-binding protein TNFR2.

圖4 抗體衍生物 Fig.4 Antibody derivatives

1.3.3 四價(jià)串聯(lián)抗體(TandAbs) TandAbs包括兩個(gè)二聚化的多肽鏈和四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(圖4C)，分子量為110 kD(VLa-VHb-連接體 -VLb-VHa)[31]。

1.3.4 納米抗體 納米抗體是從由重鏈組成的單域抗體，這些分子包括抗體重鏈(VHH)可變域(圖4D)，分子量?jī)H為12～15 kD。多種人源化和序列優(yōu)化的納米抗體已進(jìn)入臨床藥物研究階段。目前已有3個(gè)納米抗體正在自身免疫性疾病的治療中進(jìn)行功能評(píng)估[32]，有報(bào)道指出，2%接受納米抗體治療的受試者出現(xiàn)了抗藥物抗體，但是這些抗體并沒有影響療效。

目前已經(jīng)出現(xiàn)納米抗體工程結(jié)合促炎細(xì)胞因子的研究，例如 Ozoralizumab，它是一種雙特異性抗體衍生物，由3個(gè) VHH組成，有兩個(gè)TNF的結(jié)合位點(diǎn)。此納米抗體在RA的治療中進(jìn)行臨床試驗(yàn)[33]。有效性和安全性試驗(yàn)將進(jìn)一步證實(shí)納米抗體是否優(yōu)于治療性單克隆抗體。

多特異性抗體和抗體衍生物使得效應(yīng)細(xì)胞向靶細(xì)胞的遷移不依賴于ADCC效應(yīng)，這將為更多的干擾免疫反應(yīng)的方法提供研究基礎(chǔ)。主要的問題還是在于找到合適的腫瘤抗原作為有效的治療靶點(diǎn)。

1.4 抗體模擬物 抗體模擬物是包含了抗原結(jié)合位點(diǎn)的合成蛋白，這些分子包含的單個(gè)多肽序列來源于現(xiàn)有的人源支架蛋白?？贵w模擬物也是高效的蛋白質(zhì)，分子量低但可提供高特異性。在過去的20年已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約50個(gè)不同的蛋白支架[31]，其中一些已經(jīng)用于過敏性疾病和自身免疫性疾病的臨床前和臨床研究。

1.4.1 設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPins) 3～5個(gè)完整設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)支架決定了DARPins的結(jié)合特異性，這些中央基序側(cè)翼的N、C端帽基序遮擋了疏水區(qū)域，從而增加了DARPins的溶解度(圖5A)。 DARPins 缺乏T 細(xì)胞表位， 因此其免疫原性較低，并且在臨床試驗(yàn)中已觀察到這種現(xiàn)象。

圖5 抗體模擬物Fig.5 Antibody mimeics

1.4.2 親和多聚體(Avimers) Avimer的結(jié)構(gòu)是基于所謂的A區(qū)，A區(qū)主要存在于各種細(xì)胞表面受體的胞外部分，它以低親和力與同一靶點(diǎn)的不同表位相結(jié)合(圖5B)。A結(jié)構(gòu)域的親和力可以通過單一域多聚化而增加，這是由遺傳的低聚化來實(shí)現(xiàn)的。事實(shí)上，組合A結(jié)構(gòu)域已由外顯子洗牌產(chǎn)生[34]。目前研究最多的Avimer，稱為AMG220，是一個(gè)12 kD的腳手架蛋白，其中包含低密度脂蛋白受體的三個(gè)A域，可以高親和力結(jié)合IL-6，這個(gè)Avimer正在克羅恩病中進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)[35]。

2 免疫細(xì)胞的工程化

除了合成蛋白調(diào)控免疫系統(tǒng)之外，大量研究關(guān)注于利用基因工程手段體外改造免疫細(xì)胞。因此在本部分中我們將討論免疫細(xì)胞工程化及其臨床應(yīng)用。合成免疫學(xué)也包括調(diào)節(jié)其他細(xì)胞和機(jī)體來干擾人體免疫系統(tǒng)，如間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)治療、工程化細(xì)菌用于腸道慢性炎癥、白介素-2(IL-2)、HIV融合抑制肽等[36-39]。

免疫細(xì)胞工程化目前已經(jīng)應(yīng)用于在原發(fā)免疫缺陷患者中對(duì)功能缺陷的免疫細(xì)胞進(jìn)行體外重組，在獲得性免疫缺陷患者中通過造血干細(xì)胞(HSC)基因治療來抑制HIV感染，或者利用免疫細(xì)胞的特性通過過繼性免疫治療來對(duì)抗腫瘤。工程化自體免疫細(xì)胞療效持久，可以達(dá)到治愈疾病的目的。

2.1 細(xì)胞表面工程化——在細(xì)胞膜上添加成分 現(xiàn)今有多種改造策略將某些分子或化合物負(fù)載至免疫細(xì)胞表面可以調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞的功能。自分泌因子可以用脂質(zhì)納米顆粒包裝，通過共價(jià)鍵連接到細(xì)胞表面，從而實(shí)現(xiàn)低濃度介質(zhì)持續(xù)刺激細(xì)胞的目的。細(xì)胞表面工程改造還包括通過細(xì)胞因子介導(dǎo)體內(nèi)T細(xì)胞的大量擴(kuò)增，從而增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷作用[40]。

2.2 自體HSC基因治療——治療免疫缺陷 在自體HSC基因治療中，對(duì)基因缺陷的細(xì)胞群通過基因添加、修改、敲除等來恢復(fù)這些基因的表達(dá)，從而緩解患者的臨床癥狀，使病情不再進(jìn)展，甚至可能達(dá)到治愈。當(dāng)前，免疫缺陷的主要治療方法是通過負(fù)載野生型基因序列的載體，以及通過基因修正或者基因敲除來治療HIV感染患者。

2.2.1 基因添加 在3種HSCs治療的方法中，目前臨床試驗(yàn)及臨床前應(yīng)用最多的是基因添加，第一個(gè)成功的案例發(fā)生在2000年，一個(gè)患有X染色體遺傳的嚴(yán)重免疫缺陷的兒童患者通過自體骨髓移植恢復(fù)了免疫系統(tǒng)的功能，移植的骨髓細(xì)胞中帶有小鼠白血病載體負(fù)載的野生型IL-2Rα受體[41]。

2.2.2 基因修正 由于基因修正能在不影響表達(dá)調(diào)控的前提下改變基因，所以近來受到了極大的關(guān)注。利用這種方法，可以使用鋅指結(jié)構(gòu)核酸酶，歸巢內(nèi)切酶，轉(zhuǎn)錄激活因子來糾正基因突變或制造新的突變基因。由于采用了不同的修復(fù)手段，結(jié)果可能造成基因的破壞，重構(gòu)或剪切。

例如，在CCR5中引入突變，使得T細(xì)胞能抵抗HIV的感染[42]。將人類HSCs通過鋅指結(jié)構(gòu)核酸酶技術(shù)設(shè)計(jì)突變轉(zhuǎn)入到CCR5，將這些細(xì)胞移植到免疫功能不全的小鼠后，接種HIV病毒后，病毒滴度明顯低于未突變小鼠[43]。HIV感染者使用自體轉(zhuǎn)導(dǎo)的鋅指結(jié)構(gòu)核酸酶CD4+T細(xì)胞的初步研究剛剛完成，研究顯示這種方法是安全的[44]。

2.2.3 基因敲除 沉默單基因及復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)的技術(shù)逐漸應(yīng)用于基因治療。主要手段是利用發(fā)卡RNA(shRNAs)來沉默目的基因。目前，沉默CCR5的免疫細(xì)胞正在艾滋病患者中進(jìn)行臨床試驗(yàn)[45]。其策略是利用自體轉(zhuǎn)導(dǎo)帶有編碼CCR5-shRNA慢病毒載體的CD4+T細(xì)胞和CD34+造血干細(xì)胞，同時(shí)聯(lián)合HIV抑制劑來治療HIV患者。Ⅰ期臨床試驗(yàn)的評(píng)估目標(biāo)首先是安全性和可行性，然后是CD4+T細(xì)胞劑量以及病毒載量。

2.3 過繼免疫治療 現(xiàn)有的過繼性免疫治療主要用于腫瘤細(xì)胞的清除，具體來說，從患者體內(nèi)分離出免疫細(xì)胞，在體外進(jìn)行擴(kuò)增和基因修飾使得它們重定位自己的效應(yīng)功能，隨后回輸至患者(圖6)，基因工程化的效應(yīng)細(xì)胞將識(shí)別它們的新靶點(diǎn)并沉默或者殺死腫瘤。

盡管過去的10年已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中應(yīng)用了不同的治療策略，但工程化免疫細(xì)胞過繼性免疫治療到目前為止僅顯示了溫和的效應(yīng)。CAR(嵌合抗原受體)修飾T細(xì)胞在白血病和淋巴瘤中顯示了鼓舞人心的療效，但在靶向?qū)嶓w瘤時(shí)仍有局限性。主要問題是要克服實(shí)體瘤腫瘤部位的免疫抑制微環(huán)境，同時(shí)要實(shí)現(xiàn)回輸至宿主體內(nèi)后有足夠的持久性[46]。目前臨床試驗(yàn)中應(yīng)用的CAR只有單克隆特異性，已有研究發(fā)現(xiàn)由于發(fā)生了抗原逃逸而導(dǎo)致CAR-T無法發(fā)揮長(zhǎng)期的抗腫瘤效應(yīng)[47]。此外，這種技術(shù)成本比較高，而且有可能發(fā)生致命的不良反應(yīng)[48,49]。

圖6 基因工程化T細(xì)胞的制備及回輸流程Fig.6 Preparation and infusion process of gene-modified T cells

與單克隆抗體免疫制劑相比，過繼性免疫治療的主要優(yōu)點(diǎn)是利用了免疫細(xì)胞自身的抗腫瘤免疫效應(yīng)，單次回輸后即可主動(dòng)遷移至腫瘤部位，發(fā)生抗原特異性擴(kuò)增后在一定時(shí)間內(nèi)可以持續(xù)存在。

2.3.1 工程化T細(xì)胞 研究人員可以使用多種技術(shù)對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，使其表達(dá)高親和力TCRs(T細(xì)胞受體)，從而獲得對(duì)靶抗原的特異性。研究人員最常使用逆轉(zhuǎn)錄病毒來介導(dǎo)T細(xì)胞的基因修飾，轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和mRNA電轉(zhuǎn)染技術(shù)同樣可以成功將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)至T細(xì)胞。現(xiàn)有臨床試驗(yàn)使用的TCRs主要有以下幾個(gè)來源：一是從對(duì)過繼細(xì)胞治療有反應(yīng)的患者中分離得到編碼TCR的DNA序列，這種技術(shù)可以從腫瘤微環(huán)境中分離出自體T細(xì)胞，然后在體外進(jìn)行擴(kuò)增，得到的TCR序列隨后被克隆進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并轉(zhuǎn)染至HLA匹配患者的T細(xì)胞上。第二，TCR的遺傳信息可以從人源化小鼠中(表達(dá)MHCⅠ/Ⅱ分子并可以識(shí)別腫瘤抗原)分離得到。表達(dá)小鼠TCRs的人源工程化T細(xì)胞已被成功用于靶向腫瘤抗原CEA和PMEL蛋白。第三，利用測(cè)序技術(shù)鑒定出腫瘤特異性突變，然后體外合成這些突變基因或者肽并表達(dá)于患者自體抗原提呈細(xì)胞(APC)，然后將自體T細(xì)胞或者健康供者來源的T細(xì)胞與這些表達(dá)了患者自身腫瘤突變的APC共培養(yǎng)，將獲得能夠識(shí)別患者自身所有突變的TCR-T細(xì)胞[50，51]。第四，設(shè)計(jì)并構(gòu)建CAR的結(jié)構(gòu)并通過病毒載體或其他方法轉(zhuǎn)染至患者來源的T細(xì)胞中。這種情況下，抗體的單鏈可變區(qū)(scFv)被嵌合至TCR的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，下游串聯(lián)了可以激活T細(xì)胞的共刺激分子。因此，CARs可以識(shí)別靶細(xì)胞表面非MHC限制性抗原，而TCRs主要識(shí)別被APC(抗原提呈細(xì)胞)處理后以肽的形式與MHC分子形成復(fù)合物的胞內(nèi)抗原。

靶向CD19陽性白血病和淋巴瘤的CAR-T細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中已經(jīng)取得了良好的療效，首批4例患者的病情得到了完全緩解[52,53]，但是在另外一例使用同樣CAR-T細(xì)胞治療的患者中出現(xiàn)了CD19陰性白血病的復(fù)發(fā)[54]近兩年來，CAR-T細(xì)胞免疫治療在B細(xì)胞惡性腫瘤中取得了很好的療效。Maude等[55]報(bào)道了30例急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者入組靶向CD19的CAR-T細(xì)胞(CTL019)治療的臨床試驗(yàn)結(jié)果，完全緩解率達(dá)到了90%，最長(zhǎng)生存時(shí)間超過了2年，而且入組患者均為多次復(fù)發(fā)或者對(duì)兩個(gè)或更多再次誘導(dǎo)方案無效者，其中60%患者為自體干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)，這樣的療效無疑非常振奮人心。Porter等[56]報(bào)道了14例復(fù)發(fā)或難治慢性淋巴細(xì)胞白血病患者CAR-T治療的效果，雖然總的緩解率僅為56%，但觀察到了長(zhǎng)達(dá)53個(gè)月的無病生存期，這樣顯著的療效用傳統(tǒng)療法基本是不可能實(shí)現(xiàn)的。TCR-T細(xì)胞免疫治療也在臨床試驗(yàn)中顯示了可觀的療效，Rapoport等[57]報(bào)道的NY-ESO-1特異性TCR-T細(xì)胞在治療20例多發(fā)性骨髓瘤患者時(shí)，臨床有效率高達(dá)80%(16/20)，完全緩解率(CR)也達(dá)到了70%(14/20)，而且中位無疾病進(jìn)展生存期(PFS)長(zhǎng)達(dá)19.1個(gè)月。

盡管如此，Zhang等[58,59]對(duì)近年來CAR-T細(xì)胞免疫治療在B細(xì)胞惡性腫瘤中的臨床試驗(yàn)進(jìn)行Meta分析后發(fā)現(xiàn)，CAR-T細(xì)胞免疫治療可將ALL患者總的緩解率提高至90%，而在CLL(慢性淋巴細(xì)胞白血病)中僅提高至42%，并指出ALL患者效果優(yōu)于CLL可能源于CLL患者的體內(nèi)免疫抑制更強(qiáng)，因此有必要聯(lián)合其他治療以提高CAR-T的療效。

近年來研究人員開發(fā)出多種方法與CAR聯(lián)合，來增加CAR-T免疫治療的療效和安全性。有研究發(fā)現(xiàn)，PD-1阻斷聯(lián)合CAR-T治療可以明顯延長(zhǎng)CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤中的存活時(shí)間并增強(qiáng)抑制PD-L1+腫瘤細(xì)胞的能力并在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中增加CAR-T細(xì)胞的持久性從而提高CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)[60]，或者采用基因工程手段將PD-1構(gòu)建進(jìn)CAR-T細(xì)胞中從而增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞在腫瘤部位的浸潤(rùn)[61]。一種提高CAR-T細(xì)胞特異性的方法是設(shè)計(jì)出僅能靶向和殺傷表達(dá)兩種抗原靶細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)的CAR，這種新型的CAR不會(huì)識(shí)別表達(dá)一種或者不表達(dá)抗原的細(xì)胞(例如正常組織細(xì)胞)，因此提高了特異性和治療的安全性[62]。此外，還出現(xiàn)了將抗體scFv區(qū)與免疫抑制受體CTLA-4或PD-1嵌合的抑制性CARs[63]。研究人員還利用基因工程使T細(xì)胞異位表達(dá)T細(xì)胞刺激因子IL-12，IL-12/CAR的組成性內(nèi)源分泌在沒有化療預(yù)處理的情況下即可引起表達(dá)靶向抗原的腫瘤細(xì)胞的凋亡，并且可以抵抗Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制[64]。最近發(fā)表在Science上的一篇報(bào)道更是提出了通過一個(gè)小分子開關(guān)來控制CAR-T功能的新方法[65]。這些新的合成免疫學(xué)的產(chǎn)物在優(yōu)化T細(xì)胞功能及減少不良反應(yīng)方面有重要的意義。

2.3.2 應(yīng)用經(jīng)過工程改造的NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)根除腫瘤 自體或異體NK 細(xì)胞已廣泛用于多種惡性腫瘤治療的臨床試驗(yàn)中[66]。NK 細(xì)胞最早在血液中發(fā)現(xiàn)，回輸NK細(xì)胞的免疫療法在惡性血液系統(tǒng)腫瘤中已經(jīng)獲得了成功[67]。首先，NK 細(xì)胞被分離出來(主要來自外周血單核細(xì)胞)，然后，在體外用細(xì)胞因子刺激并擴(kuò)增至治療劑量后回輸至患者體內(nèi)。盡管臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明自體NK細(xì)胞移植是安全的，但是臨床效率卻差強(qiáng)人意[66]。相反，異體NK細(xì)胞在腫瘤治療中相對(duì)比較成功，包括轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤、腎癌、霍奇金淋巴瘤和急性髓系白血病[68]。

基因工程改造的NK細(xì)胞和NK細(xì)胞系的抗腫瘤效果已在臨床前研究中被廣泛證實(shí)，多項(xiàng)研究表明，聯(lián)合細(xì)胞因子 (IL-2、IL-15、SCF)基因修飾NK細(xì)胞和用CAR (CD19、CD20、ErbB2、CD33、CEA、GD2)來定向NK靶細(xì)胞的新技術(shù)能夠提高NK細(xì)胞的殺傷功能、增強(qiáng)NK細(xì)胞的擴(kuò)增能力、生存能力及其靶向特異性，從而增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)[66]。這些新技術(shù)在臨床試驗(yàn)中能否成功有待更多臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。

3 未來治療策略

基于合成免疫學(xué)的理念，近年來出現(xiàn)并上市了多種新的分子水平上的多特異性抗體、抗體衍生物和抗體模擬物，而且可以通過重新編程免疫效應(yīng)細(xì)胞來改變效應(yīng)細(xì)胞的功能。目前，過繼免疫療法主要應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域，目的是通過基因工程手段增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤能力?，F(xiàn)有免疫治療存在的主要問題就是免疫應(yīng)答的特異性較低從而有可能導(dǎo)致脫靶效應(yīng)，例如，靶向CD19/CD20來殺傷白血病細(xì)胞在清除腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)大幅度的抑制正常B細(xì)胞功能從而干擾人體正常免疫系統(tǒng)。在不久的將來，研究者必定會(huì)更多關(guān)注于蛋白復(fù)合體如何與特異性更強(qiáng)的細(xì)胞亞群聯(lián)合應(yīng)用，以及如何通過CAR技術(shù)來整合多重特異性。在未來，工程化分子和工程化細(xì)胞在腫瘤相關(guān)領(lǐng)域?qū)㈤_展更大規(guī)模的研究，在其他領(lǐng)域也必將有越來越廣泛的應(yīng)用。

致謝：衷心感謝中國工程院楊勝利院士在本文書寫過程中給予的指導(dǎo)和幫助。

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[收稿2016-06-07]

(編輯 許四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.028

①本文受國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目( 81171986，81271815，81502689)、河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(省部共建項(xiàng)目2015010004)、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“重大慢性非傳染疾病防治研究”重點(diǎn)專項(xiàng)(2016TFC1303500)和河南省重大專項(xiàng)(22130001)。

曹 玲(1985年-)，女，在讀博士，主要從事惡性腫瘤的免疫治療研究，E-mail：caoling@gs.zzu.edu.cn。

及指導(dǎo)教師：黃 波(1969年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤免疫、腫瘤生物學(xué)、腫瘤代謝等方面的研究，E-mail: tjhuangbo@hotmail.com。 張 毅(1964年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用相關(guān)研究，E-mail: yizhang@zzu.edu.cn。

R392-33

A

1000-484X(2017)02-0288-09

②中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)暨分子生物醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100005。