王婧

摘要：采用RT-PCR方法從微山紅蓮花苞中克隆獲得1個與花發(fā)育相關的MADS-box基因，命名為NeMADS1。該基因全長729 bp，包含1個720 bp的開放閱讀框，編碼239個氨基酸，具有典型的MADS結構域和K結構域。序列比對和系統(tǒng)進化分析結果表明，NeMADS1與E類家族AGL9/SEP-like3基因親緣關系較近。RT-PCR分析結果表明，NeMADS1基因在花瓣、雄蕊和心皮中表達。

關鍵詞：荷花；花發(fā)育；MADS-box；基因表達；RT-PCR

中圖分類號： S682.320.1；Q785 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0039-04

花發(fā)育的分子機理一直是植物分子生物學研究的熱點，MADS-box基因家族作為轉錄因子，在花發(fā)育過程中起重要作用。MADS-box基因不僅參與花發(fā)育的調控，還在開花時間的控制、決定分生組織的分化[1]、促進根的形成[2]，以及種子和果實發(fā)育[3-4]等方面都起著重要的作用。

前人在對雙子葉模式植物遺傳突變體的研究中，提出了花器官發(fā)育ABCDE模型[5-10]。典型雙子葉植物的花大多具有由外到內4輪結構：萼片、花瓣、雄蕊和心皮。模型認為控制花器官發(fā)育的基因按功能可以分成5類（A～E類功能基因），這些基因單獨或共同作用控制各輪花器官的發(fā)育[9]。隨著對擬南芥、矮牽牛、金魚草等模式植物的研究，已經克隆到很多MADS-box基因，僅擬南芥中就有100多種MADS-box基因[11]。

SEP（SEPALLATA）基因屬于MADS-box E類基因[9]，是花器官發(fā)育所必需的。擬南芥中有4個SEP基因：SEP1、SEP2、SEP3、SEP4（又稱AGL2、AGL4、AGL9、AGL3）[12-15]，SEP1、SEP2、SEP4基因在擬南芥花發(fā)育的早期花分生組織中起始表達；而SEP3主要在內3輪花器官原基中表達。隨著花原基的進一步發(fā)育，SEP1和SEP2在4輪花器官中均有表達[14]，而SEP3僅在花瓣、雄蕊和雌蕊中表達[8]，SEP4主要在萼片中表達[16]。目前為止，研究人員已從桃[17]、蘋果[18]、草莓[19]、春蘭[20]、文心蘭[21]等多種植物中分離克隆了SEP-like同源基因，并且對其表達模型及功能開展了相關研究。

荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.），別稱蓮花，是中國十大傳統(tǒng)名花之一，具有很高的觀賞價值。目前，有關荷花花器官發(fā)育MADS-box基因的研究報道較少，更未見AGL9/SEP-like基因的研究報道。本研究以微山紅蓮的花苞為試驗材料，采用RT-PCR技術克隆獲得1個荷花花器官發(fā)育 MADS-box家族E類相關基因NeMADS1的全長序列，并分析其表達模式，為蓮科植物進化研究提供依據，同時為研究植物花發(fā)育模式以及荷花花器官發(fā)育的分子機理奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料

以吉林省經濟管理干部學院基地的微山紅蓮為試驗材料，于2015年8月取雌蕊分化后期花苞進行基因克隆。取盛花期花朵的萼片、花瓣、雄蕊、心皮進行RT-PCR表達分析。所有材料采集后均立即用液氮處理，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及cDNA合成

以雌蕊分化后期花苞為材料，采用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB法）提取其總RNA，用反轉錄試劑盒（SuperScriptTM Ⅲ Reverse Transcriptase， Invitrogen）合成cDNA，按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 基因克隆與序列分析

查找NCBI中EST序列信息及相關資料設計引物擴增基因全長，引物序列NeS1-F：5′-CTGAAATGGGGAGAGGTAGGGT-3′、NeS1-R：5′-CTGATCATGCCAGCCACCCAGGC-3′，以荷花花苞的cDNA為模板進行基因全長PCR擴增。反應體系為25 μL，反應程序為94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目的片段，連接到pMD-19T（TAKARA）載體上，轉化DH5α菌株，進行克隆、測序。引物合成和測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司進行。

采用DNAMAN軟件進行序列拼接和分析，獲得的序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）網站上進行Blast比對，用MEGA 5.0和ClustalX軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.4 RT-PCR表達分析

提取盛花期花萼、花瓣、雄蕊和心皮的總RNA并反轉錄成cDNA，進行RT-PCR表達分析。設計引物NeS1-F2：5′-AACAGGGCATTGAAACGG-3′，NeS1-R2：5′-AGCCACCCAGGCATATAAC-3′，定量PCR采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ kit（TAKARA）。反應體系為：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（2×）mix，0.8 μL forward primer，0.8 μL reverse primer，2 μL cDNA，0.4 μL Rox Reference Dye or Dye（50×），6.0 μL H2O。反應條件為：95 ℃ 5 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以Actin為內參（Actin-F：5′-TGCCTATGTGGCTCTTGACTAT-3′，Actin-R：5′-GATGGCTGGAATAGAACCTCA-3′）在Roche Lignt Cycler 2.0熒光定量PCR儀上反應，3次重復，采用2-ΔΔCT法進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 基因克隆與序列分析

以雌蕊分化后期的花苞總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板進行PCR擴增，分離出長度為729 bp的片段，NCBI上進行Blast比對分析，結果表明該片段與多種植物的MADS-box基因有較高同源性，證明該片段為所需目的片段。通過DNAMAN軟件的序列拼接和分析，獲得基因全長為720 bp，編碼239個氨基酸（圖1），命名為NeMADS1。

蛋白結構域分析結果表明，該蛋白是植物特有的MIKC型MADS-box基因，包含典型的MADS盒（實線部分）和K盒（雙線部分）。Blast同源序列分析該基因與其他植物AGL9/SEP-like3基因具有較高的同源性。

2.2 NeMADS1氨基酸同源性比較

利用NCBI的BlastX工具將NeMADS1基因核酸序列翻譯成氨基酸序列并進行同源性比對，結果表明：NeMADS1與ABCDE模型中的E類蛋白有較高的同源性，其中與EpSEP3、PaAGL9、EcAGL9和PtSEP3的同源性分別是87%、84%、84%、83%。對NeMADS1基因氨基酸序列的多序列比對結果表明：SEP-like基因編碼氨基酸序列含有高度保守的5′端MADS結構域和半保守的K結構域，在差別較大3′端C-末端中發(fā)現了SEP-like蛋白特有的SEPⅠ和SEPⅡ基序結構域（圖2）。

2.3 系統(tǒng)進化樹分析

系統(tǒng)進化關系分析結果表明，NeMADS1編碼蛋白與 ABCDE 模型中的AGL9/SEP-like3（E類）基因編碼蛋白同源性較高，與領春木（Euptelea pleiosperma）的EpSEP3關系最近，說明NeMADS1應屬于E類MADS-box基因（圖3）。

A類和E類基因在進化上屬于AP1/AGL9組，該組有3個進化系：AGL9（SEP）、AP1和介于二者之間的AGL6進化系[21-22]。為了確定NeMADS1的歸類及進化關系，選取 AP1/AGL9 組MADS-box基因的氨基酸序列進行聚類分析。結果顯示，AP1/AGL9組氨基酸序列明顯分為3類：SEP、AP1和AGL6，其中AGL6與SEP分枝為姊妹關系，所有AGL9、SEP3聚在一起，然后又與SEP1/2/4聚在了一個大枝上（圖3）。

2.4 RT-PCR表達分析

RT-PCR分析結果表明，NeMADS1基因在花瓣、雄蕊和心皮中表達量較高，尤其在花瓣中表達量最高，在花萼中表達量最低。NeMADS1基因的表達模式與擬南芥SEP3基因在各組織的表達模式一致，進一步說明NeMADS1屬于E類基因（圖4）。

3 討論與結論

本試驗采用RT-PCR技術克隆了與花發(fā)育相關的NeMADS1基因。同源性分析結果表明，NeMADS1基因與其他植物的AGL9/SEP-like3基因具有較高的同源性，其蛋白質包含MADS區(qū)、K區(qū)、I區(qū)和C-末端等4個區(qū)域，屬于植物典型的MIKC類MADS-box基因。MADS-box蛋白的C-末端被認為與轉錄激活、高階蛋白質復合體的形成、DNA特異性識別、亞細胞定位等有關[23]。SEP亞家族大部分成員的C端具有2個短的、相對保守的基序（SEPⅠ和SEPⅡ基序）[15]。NeMADS1基因具有保守的SEPⅠ和SEPⅡ基序，是典型的SEP-like基因。

通過對SEP-like基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現SEP亞家族發(fā)生過多次基因重復事件，其中在被子植物起源之前發(fā)生了1次基因重復事件，產生了SEP3進化系和SEP1/2/4進化系[15]。本研究對NeMADS1基因系統(tǒng)進化樹分析表明，所有的AGL9/SEP-like3聚在了一起，其中與領春木、昆欄樹（Trochodendron aralioides）的關系較近， 而三者均屬于基部雙子葉植物，這個結果與APGⅢ分類系統(tǒng)一致，說明AGL9/SEP-like3基因在進化上相對保守，同時也為蓮科在系統(tǒng)進化中所屬的位置提供了證據。

荷花SEP-like基因NeMADS1在花瓣、雄蕊和心皮中表達，這與擬南芥SEP3基因、加州罌粟（Eschscholzia californica）EScaAGL9基因在表達模式上一致[15]，而與草原龍膽（Eustoma grandiflorum）EgSEP3-1基因的表達模式有所差異[24]。SEP作為花器官同源異型基因ABCD的共因子（co-factor）在各輪花器官決定中發(fā)揮作用[8]。事實上，各進化系的表達模式是存在差異的[25]，雖然E類基因的表達模式在被子植物不同的物種中有差異，但該基因對所有花器官的發(fā)育都是必需的，其功能是保守的。

本試驗中分離出1個MADS-box基因家族E類基因，并對其功能進行了初步分析，有關其時空表達模式和深入功能分析工作也正在進行中，以期為闡明荷花花器官發(fā)育的分子調控機理奠定基礎。

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