華智銳+李小玲

摘要：以商麥1619為材料，在PEG6000模擬干旱條件下，研究不同濃度（0、1、0.1、0.01、0.001 mg/L）油菜素內酯（BR）對小麥幼苗抗旱性的誘導效應。通過測定小麥幼苗抗旱性相關生理指標，比較分析油菜素內酯對小麥幼苗干旱脅迫的緩解效應。結果表明，在干旱條件下，經BR處理的小麥幼苗超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性均提高，丙二醛（MDA）含量降低，相對含水量提高，從而提高了小麥幼苗的抗旱性。其中，0.1 mg/L BR對提高小麥幼苗的抗旱性作用效果最佳。

關鍵詞：油菜素內酯；小麥；幼苗；抗旱性

中圖分類號： S512.101 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0062-04

油菜素內酯（brassinolide，簡稱BR）又稱蕓薹素內酯或蕓苔素，它是一種甾類化合物，廣泛存在于植物界，對植物生長發(fā)育有多方面的調節(jié)作用[1-2]。油菜素內酯是一種新型的、生理活性強、無毒的植物激素，作用機理類似于生長素，由于其生理活性大大超過了現(xiàn)有的5種激素，已被國際上譽為第六大激素，對植物生長發(fā)育有著多方面的重要影響，其主要的生理效應是促進細胞生長和分裂，促進植物光合作用，提高植物的抗逆性，具體表現(xiàn)為提高植物的抗旱[3-9]、抗鹽[10]、抗氧化[11-12]能力，在自然條件不利時更是突出，又稱逆境條件的緩和劑[1-2]。BR可以增強玉米[3-4]等作物的抗旱性，從而提高產量和品質，還可以提高羊草、沙棘、花椰菜[5-7]等抗旱性，提高苗木[8-9]的抗旱性。

商洛市位于陜西省秦嶺南麓東段，地勢復雜，自然災害頻發(fā)，耕地肥力水平低，糧食產量一直沒有大的突破。尤其是小麥品種“多、亂、雜”現(xiàn)象嚴重，缺乏抗病蟲、抗倒伏、抗旱耐寒、高產穩(wěn)產的優(yōu)質品種，“干旱、嚴寒、病蟲”一直都是商洛小麥的幾大脅迫因子。其中，干旱是小麥生產的主要問題。選育出抗旱、高產、穩(wěn)產的小麥新品種是提高旱地小麥產量、促進小麥大規(guī)模持續(xù)穩(wěn)定增產、保障國家糧食安全的有效途徑之一。目前干旱地區(qū)小麥生產推廣的主要品種，雖然有較強的適應性，但小麥抗旱性較差，而且加工品質很難滿足人們生活的需要[13]。

商麥1619是在商麥5226基礎上選育的高產小麥新品種，通過10多年系統(tǒng)選育而成，是針對商洛旱地小麥育種現(xiàn)狀，根據(jù)抗旱、優(yōu)質、高產、綜合農業(yè)性狀優(yōu)良的育種要求而育成的適宜旱塬、旱坪地種植的優(yōu)質高產小麥新品種[14]。

本試驗以商麥1619為材料，在20%聚乙二醇（PEG）[15-16]模擬干旱條件下，研究外源油菜素內酯對小麥幼苗抗旱性的誘導效應。通過測定小麥幼苗抗旱性相關生理指標，比較分析油菜素內酯對小麥幼苗干旱脅迫的緩解效應，為油菜素內酯在農作物抗旱應用上提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試驗的小麥品種為商洛學院培育的優(yōu)質小麥新品種商麥1619。選取飽滿、均勻一致的小麥種子，用75%乙醇消毒10 min，再用蒸餾水沖洗干凈，室溫浸泡6 h。一批種于18個培養(yǎng)皿內，每皿30粒，試驗共設2個對照[分別是CK1（蒸餾水對照）、CK2（20% PEG對照）]和4個處理（T1，20% PEG+BR 0.001 mg/L；T2，20% PEG+BR 0.01mg/L；T3，20% PEG+BR 0.1mg/L；T4，20% PEG+BR 1 mg/L），每個處理3次重復，測定小麥種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢；另一批種于25個培養(yǎng)皿內，每皿30粒，待長到2葉1心時，用20% PEG6000模擬干旱處理小麥幼苗，培養(yǎng)2～3 d后，以不噴施BR為對照組（CK），其余4個處理分別噴施1、0.1、0.01、0.001 mg/L BR，上午、下午各1次，每個處理5次重復，分時間段（1、3、5、7、9 d）測定小麥幼苗抗旱性生理指標，選出對小麥抗旱性影響最適的BR濃度。

1.2 試驗指標測定方法

1.2.1 小麥種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢的測定 選取飽滿、均勻一致的小麥種子，用75%乙醇消毒10 min，再用蒸餾水沖洗干凈，室溫浸泡6 h。種于18個培養(yǎng)皿內，每皿30粒，試驗共設2個對照（蒸餾水、20% PEG）和4個處理（20% PEG+BR 1 mg/L，20% PEG+BR 0.1 mg/L，20% PEG+BR 0.01 mg/L，20% PEG+BR 0.001 mg/L），每個處理3次重復[17]。

測定小麥種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢：

發(fā)芽率（GR）=∑GtN×100%。

式中：Gt表示7 d內正常發(fā)芽的種子數(shù)；N表示供試種子數(shù)。

發(fā)芽勢（GP）=n4N。

式中：n4表示4 d內正常發(fā)芽的種子數(shù)；N表示供試種子數(shù)。

1.2.2 小麥幼苗相對含水量的測定 將小麥幼苗葉片剪成小塊，稱取同等質量的2份（mf），1份于150～160 ℃烘箱中烘烤0.5～1 h，然后稱此時的干質量（md），1份放入蒸餾水中浸泡 70 min，當達到恒質量時，稱此時的質量（mt）[17]。

相對含水量=（鮮質量mf-干質量md）/（飽和鮮質量mt-干質量md）×100%。

1.2.3 小麥幼苗丙二醛（MDA）含量的測定 稱取小麥幼苗葉片0.3 g，放入冰浴的研缽中，加入少量石英砂和2 mL 0.05 mol/L 磷酸緩沖液（pH值7.8），研磨成勻漿。將勻漿移到試管中，再用2～3 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH值78），沖洗研缽2次，合并提取液。然后在提取液中加入 5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，搖勻。將試管放入到沸水浴中煮沸10 min（當試管內溶液中出現(xiàn)小氣泡開始計時），到時間后，迅速將試管取出放入到冷水浴中。直到試管內溶液冷卻后，取3 000 g溶液離心15 min，取上清液并測量其體積。用0.5%硫代巴比妥酸作為空白測532、600、450 nm處的吸光度[18]。

按下式計算MDA含量：

MDA含量（μmol/g，F(xiàn)W）=[6.542×（D532 nm-D600 nm）-0599×D450 nm]×Vt/Vs×mf。

式中：Vt為提取液的總體積，mL；Vs為測定時用提取液的體積，mL；mf為樣品鮮質量，g。

1.2.4 小麥幼苗超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定 （1）酶液的提取。取待測小麥幼苗葉片0.5 g放入冰浴的研缽中，加 2 mL 預冷的提取介質（pH值7.8的0.05 mol/L磷酸緩沖液內含1%聚乙烯吡咯烷酮），冰浴情況下研磨成勻漿，加入提取介質沖洗研缽，并使終體積定容至10 mL，在4 ℃下 10 500 r/min 離心20 min，上清液為SOD粗提液。

（2）顯色反應。選取透明度好，質地一致的試管4支，2支為測定管，2支為對照管，按照表1所示加入試劑。混勻后，給其中1支對照管罩上比試管稍長一些的雙側黑色硬紙?zhí)渍诠?，與其他各管同時放在光照培養(yǎng)箱內反應10～20 min（各個管照光情況一致，反應溫度控制在25～35 ℃之間，根據(jù)酶活性適當調整酶的濃度和反應時間）。

（3）SOD活性的測定與計算。待反應結束后，用黑布罩住試管，終止反應。以遮光的對照管作為空白，分別在 560 nm 處測定各試管的吸光度[19]。

按下式計算SOD活性：

SOD活性（U/g，F(xiàn)W）=（Do-Ds）·VT/（0.5D0·mf·V1）。

式中：D0為照光對照管的吸光度；Ds為測定管的吸光度；VT為樣品液總體積，mL；V1為測定時樣品液用量，mL；mf為樣品鮮質量，g。

1.2.5 小麥幼苗過氧化氫酶（CAT）活性的測定 （1）酶提取液。稱取小麥幼苗葉片1 g置于預冷的研缽中，加適量 0.05 mol/L 磷酸緩沖液（pH值=7.0）及少量石英砂，在冰浴上研磨成勻漿，轉移至10 mL量瓶中，用磷酸緩沖液沖洗研缽2次（每次2 mL），合并沖洗液移至容量瓶中，定容至10 mL，搖勻。量取提取液5 mL于離心管中，在4 ℃、15 000 r/min下離心15 min，倒出上清液即為酶粗提液，4 ℃下保存。

（2）測定方法。選取10 mL具塞試管，加入2 mL酶提取液置于沸水浴中加熱煮死酶，冷卻備用；另選取10 mL試管4支，3支為測定管（3個重復），1支為對照管。按表2加入試劑。

將以上4支試管于25 ℃水浴鍋中預熱3 min后，再逐管加入0.2 mL 200 mmol/L H2O2溶液，每加1管迅速倒入石英比色皿中。然后在紫外分光度計上測定D240 nm（蒸餾水調零），每隔30 s讀數(shù)1次，共測3 min，記錄數(shù)據(jù)[19]。

（3）結果計算。以1 min內D240 nm減少0.1（3支測定管的平均值）的酶量為1個酶活性單位（U）。先求出3支試管各自 1 min 內D240 nm減少值，公式如下：

CAT活性[U/（g·min），F(xiàn)W]=ΔD240 nm×Vt/0.1×Vs×t×mf。

式中：ΔD240 nm=DS0-（DS1+DS2+DS3）/3，Ds0為加入煮死酶液對照管吸光度；Ds1、Ds2、Ds3為樣品測定管吸光度；Vt為粗酶提取液總體積；Vs為測定時取粗酶液體積，mL；mf為樣品鮮質量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有處理每次測定重復3次，數(shù)據(jù)為3次測定值的平均值，用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理下小麥種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢的測定

如圖1所示，CK2，小麥種子的GR、GP都低于CK1，說明干旱脅迫對小麥種子的萌發(fā)有強烈的抑制作用。BR濃度為0.1 mg/L時GR、GP達到最大，GP達到11.7%，GR相對于CK2提高了70百分點。BR濃度為0.001、0.01、1 mg/L 時，GR相對于CK2分別提高1.7、4.5、3.3百分點，GP分別為67%、9.5%、8.3%。由此可見，隨BR濃度的升高，GR和GP都呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，但仍高于CK2。說明施加BR，可以提高小麥種子的抗旱性，利于種子萌發(fā)。

2.2 不同濃度BR對小麥幼苗相對含水量的影響

由圖2可知，經不同濃度BR處理的小麥幼苗相對含水量較對照組均有明顯的提高。隨著干旱脅迫時間的延長，同一濃度BR對小麥幼苗相對含水量的影響也在不斷變化，整體表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢。7 d后達到最低水平，就試驗組而言，0.001 mg/L BR作用效果最弱，但仍高于對照組，提高了10.9百分點，0.1 mg/L BR效果最好，提高了17.8百分點，說明BR可保持植物體內水分，抗旱性強。

2.3 不同濃度BR對小麥幼苗丙二醛含量的影響

由圖3可知，對照組在干旱脅迫下，MDA含量一直呈緩慢上升趨勢，而經BR處理過的試驗組小麥幼苗MDA含量在同一時間均低于對照組，說明BR可緩解膜脂過氧化的過程，降低丙二醛的含量。不同濃度BR對小麥幼苗MDA的影響程度是不同的，就同一天來說，隨著BR濃度的增大，MDA含量呈先下降后上升的趨勢，其中0.1 mg/L BR效果最為明顯，在9 d后時相對于對照組降低的比例最大，降低了53.3%。

2.4 不同濃度BR對小麥幼苗SOD和CAT活性的影響

由圖4、圖5可知，SOD和CAT活性變化趨勢相似，經不同濃度BR處理的試驗組小麥幼苗超氧化物歧化酶（SOD）活性和過氧化氫酶（CAT）活性均高于對照組，呈緩慢上升趨勢，說明BR具有提高小麥幼苗SOD、CAT活性的作用。就同一天來說，隨著BR濃度的增大，SOD、CAT含量呈先上升后下降的趨勢，其中0.1 mg/L BR效果最為明顯，在9 d后相對于對照組上升的比例最大，SOD提高了127.06%，CAT提高了99.54%，而在1 d后相對于對照組上升的比例最小，SOD提高了28.18%，CAT提高了31.85%；施加BR對小麥幼苗SOD、CAT活性的影響又是不同的，隨著干旱脅迫時間的延長，0.1 mg/L BR對小麥幼苗的影響明顯，SOD活性在9 d后上升的比例比1 d后上升的比例提高了98.88百分點，CAT活性在9 d后上升的比例比1 d后上升的比例提高了67.74百分點，說明干旱脅迫下，BR對小麥幼苗SOD的緩解作用比CAT高。

3 結論與討論

油菜素內酯是20世紀末被發(fā)現(xiàn)的一種新型植物激素，其作用不同于以往的五大類激素。大量研究表明，科學使用油菜素內酯能有效改善高溫、重金屬、干旱、低氧等不良環(huán)境下植物的抗氧化性能，減少其膜脂過氧化程度，從而促進植物的光合作用及干物質積累，減輕逆境傷害[1-2]。

發(fā)芽率（GR）反映了種子發(fā)芽的量，發(fā)芽勢（GP）則反映了種子發(fā)芽的快慢和整齊度。干旱脅迫下，小麥種子的發(fā)芽率與發(fā)芽勢明顯下降，說明干旱脅迫對小麥種子的萌發(fā)有強烈的抑制作用。當施加不同濃度BR后，處理組相對于干旱脅迫下小麥種子的發(fā)芽率與發(fā)芽勢都有明顯的提高。

植物體內含水量直接影響植物的新陳代謝。干旱條件下，植物細胞原生質膜喪失選擇透性，會引起植物細胞代謝紊亂，經不同濃度BR處理的小麥幼苗相對含水量都有所提高。隨著干旱脅迫時間的延長，同一濃度BR對小麥幼苗相對含水量的影響是不同的，呈先下降后上升的趨勢。7 d后達到最低水平，就試驗組而言，0.001 mg/L BR作用效果最弱，但仍高于對照組，提高15.2%；0.1 mg/L BR效果最好，提高了19.8%，說明BR可保持植物體內水分，抗旱性作用強。

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化最重要的產物之一，可通過測定MDA的含量了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程序以及植物的抗逆性。干旱脅迫下MDA含量可以說明植物生物膜受傷害的程度以及植物抗旱性的能力。干旱脅迫下，MDA含量一直呈緩慢上升趨勢，而經BR處理過的小麥幼苗MDA含量在同一時間均低于對照組，說明BR可緩解膜脂過氧化程度，降低丙二醛的含量，就同一天來說，隨著BR濃度的增大，MDA含量呈先下降后上升的趨勢，其中 0.1 mg/L BR效果最為明顯，在9 d后時相對于對照組降低的比例最大，降低了53.3%。

超氧化物歧化酶是生物體內重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內，它與植物的衰老和抗逆性密切相關，是植物體內重要的保護酶之一。SOD是機體內天然存在的超氧自由基清除因子，可以與超氧物陰離子自由基（ O-2· ）發(fā)生歧化反應，生成O2和H2O2，生成的H2O2可被過氧化氫酶（CAT）分解為O2和H2O，以避免H2O2積累對細胞的氧化破壞作用。因此，SOD、CAT活性的測定在植物衰老和抗逆性研究中有著重要的意義。干旱脅迫下，BR對小麥幼苗SOD和CAT活性緩解趨勢相似，經不同濃度BR處理的小麥幼苗，其超氧化物歧化酶（SOD）活性和過氧化氫酶（CAT）活性均高于對照組，呈緩慢上升趨勢，說明BR具有提高小麥幼苗SOD、CAT活性的作用。其中0.1 mg/L BR效果最為明顯，在第9 d時相對于對照組上升的比例最大，SOD提高了12706%，CAT提高了99.54%；施加BR對小麥幼苗SOD、CAT活性的影響又是不同的，隨著脅迫時間的延長，0.1 mg/L BR對小麥幼苗的影響明顯，SOD活性在9 d后上升的幅度比1 d后上升的幅度提高了98.88百分點，CAT在9 d后上升的幅度比第1 d上升的幅度提高了67.74百分點，同時說明干旱脅迫下，BR對小麥幼苗SOD活性的緩解作用比CAT活性高。

周天等研究結果表明，經油菜素內酯處理的玉米幼苗相對含水量提高，從而提高了幼苗的抗旱性[3]。而在用油菜素內酯處理的幾個濃度中，0.1 mg/L油菜素內酯對提高玉米的抗旱性效果最好。韓德復等結果表明，經BR處理的羊草葉片相對含水量提高，從而提高了羊草的抗旱性。其中，0.1 mg/L BR對提高羊草的抗旱性效果最好[5]。李凱榮等研究發(fā)現(xiàn)，天然油菜素內酯處理增加了葉片含水量，降低了丙二醛含量，增強了超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性[9]，表明天然油菜素內酯處理提高了側柏苗木的抗旱性。本研究以油菜素內酯作為外源物質，干旱脅迫下，用不同濃度的BR處理小麥幼苗，結果表明，相對含水量提高，丙二醛（MAD）含量下降，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性提高，從而增強了小麥幼苗的抗旱能力。其中，0.1 mg/L BR對提高小麥幼苗的抗旱性作用效果最好，該結果與前人的相關研究結論[3，5，9]相一致。但商麥1619小麥抗旱性的研究，仍然需要后續(xù)更多指標測定和大田抗旱性穩(wěn)定性狀表現(xiàn)的進一步驗證和探討。

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