曹麗亞+陳大歡+郭榮艷

摘要：研究了多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病菌（Alternaria kikuchiana）的抑制作用，并對其應(yīng)用效果進(jìn)行了評價。結(jié)果表明，多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病菌的體外抑制率為53.2%，其粗提蛋白嚴(yán)重破壞了梨黑斑病菌的菌絲和孢子，顯著抑制了梨采后黑斑病的發(fā)生，呈現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：梨；黑斑??；多黏類芽孢桿菌；生物防治

中圖分類號： TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0107-03

梨黑斑病是一種由鏈格孢菌（Alternaria kikuchiana）引起的世界性氣傳真菌病害，主要侵染葉片，造成大量落葉，也危害果實(shí)和新梢，嚴(yán)重危害果品的生產(chǎn)和儲存。我國是梨種植和出口大國，梨產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的2/3，出口量約占世界總出口量的1/6，梨的出口是增加國民生產(chǎn)總值、農(nóng)民收入的重要途徑。然而，病原微生物的侵染造成梨采后腐爛損失嚴(yán)重[1]。其中，黑斑病是梨采后的重要病害之一，嚴(yán)重時可使梨采后損失達(dá)50%以上，在我國和韓國都曾嚴(yán)重暴發(fā)[2]。近年，法國也發(fā)現(xiàn)有梨黑斑病的發(fā)生與危害[3]。目前，農(nóng)業(yè)上主要使用化學(xué)殺菌劑來控制病害發(fā)生。然而，大量使用化學(xué)農(nóng)藥引起的病菌抗藥性、食品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)、環(huán)境污染等問題日益嚴(yán)重。因此，尋求高效、安全的生物殺菌制劑成為防治農(nóng)作物、果蔬等病害的主要出路之一，也是近年來研究的熱點(diǎn)[4-8]。

多黏類芽孢桿菌對植物具有非致病性，且細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，對人畜無害，在產(chǎn)品開發(fā)中活菌數(shù)量高、性能穩(wěn)定，是一種理想的生防菌。多黏類芽孢桿菌HT16 是筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離并保存的1株能有效抑制真菌病害的菌株。前期試驗(yàn)表明，該菌及發(fā)酵液對多種植物病原菌具有廣譜的抑制作用，其抗菌物質(zhì)為耐熱、耐酸堿、耐紫外線的蛋白質(zhì)[9]。本研究評價了多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病菌的抑制活性及對梨采后黑斑病的控制效果，并探討其抑菌機(jī)理，為進(jìn)一步深入研究其生防效果和開發(fā)微生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試?yán)鏋楹颖笔≮w縣白梨（水晶梨）。供試生防菌株多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa） HT16由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，梨黑斑病病原菌由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。

儀器設(shè)備包括BM-103CE光學(xué)顯微鏡，上海比目儀器有限公司；YT-CJ-1N 超凈工作臺，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SYQ-DSX-280B 不銹鋼手提式，山東新華醫(yī)療器械廠；TCL-15B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；pH211 酸度計(jì)，壓力蒸汽滅菌鍋等。

1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基[10]：馬鈴薯30%，（NH4）2SO4 0.4%，蔗糖 1.5%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，黃豆餅粉0.1%，pH值6.5。PDA培養(yǎng)基：葡萄糖2%、馬鈴薯20%、瓊脂2%、1 000 mL 蒸餾水，pH值6.5。PDB培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)基）：葡萄糖2%、馬鈴薯20%、1 000 mL 蒸餾水，pH值6.5。

1.3 多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病病原菌的抑制活性

1.3.1 菌體抑制活性的測定 采用對峙法測定HT16對梨黑斑病病原菌的抑制活性。將梨黑斑病病原菌接種于PDA平板上，置于25 ℃條件下培養(yǎng)7 d。在平板培養(yǎng)物上用打孔器取直徑6 mm的菌塊，接種在另一PDA平板中央，將HT16菌株均勻接種于距平板邊緣20 mm處的4個點(diǎn)上，28 ℃培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測量病原菌直徑，以不接種HT16的PDA平板作對照，參照文獻(xiàn)[10]計(jì)算抑菌率，抑菌率= （對照病菌直徑-處理病菌直徑-6 mm）/對照病原菌直徑×100%。每個處理作3個重復(fù)，該試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 不同處理液抑菌活性的測定

1.3.2.1 HT16發(fā)酵液的制備 將24 h 種齡的HT16 種子培養(yǎng)液以體積分?jǐn)?shù)為10% 的接種量轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30 ℃培養(yǎng)箱中，186 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h，備用。

1.3.2.2 HT16菌懸液的制備 將培養(yǎng)24 h的HT16種子培養(yǎng)液，以8 000 r/min離心10 min，棄上清，菌體沉淀以無菌水清洗2次，離心，最終以無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌體濃度 1億CFU/mL 左右，備用。

1.3.2.3 蛋白粗提液的制備 將上述HT16發(fā)酵液以 8 000 r/min 離心10 min，取上清，用6 mol/L HCl 調(diào)pH值至2.5，并用80%硫酸銨沉淀，4 ℃靜置過夜；然后在4 ℃條件下，10 000 r/min離心15 min，棄上清液；沉淀用1/20發(fā)酵液體積的磷酸鹽緩沖液（pH值7.2）溶解，裝入透析袋，透析過夜；用固體聚乙二醇2000進(jìn)行濃縮，濃縮至原體積的1/5，作為HT16發(fā)酵液的粗提蛋白，備用。

1.3.2.4 不同處理液抑菌活性的測定 將100 μL梨黑斑病病原菌的孢子懸液（孢子濃度約10萬個/mL）均勻涂布于 20 mL PDA培養(yǎng)基上，晾干后，放入牛津杯，分別加入上述不同處理液，28 ℃培養(yǎng)2 d，觀察測量抑菌圈大小。

1.4 多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病發(fā)病率的抑制

選取個體均勻、表面無明顯損傷且未發(fā)病的梨果實(shí)，以2%次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒，并以水清洗，晾干備用。

在梨果實(shí)的腰部兩側(cè)進(jìn)行無菌刺傷接種，傷口大小約為3 mm（直徑）×3 mm（深）。向傷口中注入100 μL上述不同處理液，以無菌水作為對照。晾干后再向同一個傷口上接種50 μL梨黑斑病病原菌的孢子懸液（孢子濃度約為10萬個/mL），室溫下晾干后，將果實(shí)放入有隔層的紙箱內(nèi)，并在紙箱外套上塑料袋使其保持相對濕度（90±5）%，置于28 ℃下貯藏。每隔24 h觀察1次，記錄病斑直徑并計(jì)算發(fā)病率。

發(fā)病率=發(fā)病果個數(shù)/調(diào)查個數(shù)×100%。

1.5 多黏類芽孢桿菌HT16的抑菌機(jī)理

1.5.1 HT16對梨黑斑病病原菌孢子萌發(fā)的影響 將2 mL梨黑斑病病原菌的孢子懸液（孢子濃度約為10萬個/mL）加入到滅菌的2 mL PDB培養(yǎng)基中，同時接種500 μL上述蛋白粗提液，以不加蛋白粗提液的作為對照，28 ℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)14 h，在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況。

孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子個數(shù)/觀察孢子個數(shù)×100%。

1.5.2 HT16對梨黑斑病病原菌菌絲生長的影響 將 500 μL 梨黑斑病病原菌的孢子懸液（孢子濃度10萬個/mL左右）加入到滅菌的50 mLPDB培養(yǎng)基中，于28 ℃下 150 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，加入500 μL蛋白粗提液，繼續(xù)培養(yǎng)8 h，在掃描電鏡下比較菌絲的生長情況[11]。以不加蛋白粗提液的作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病病原菌的抑制效果

由圖1可以看出，多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病病原菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制效果，其抑制率為53.2%。多黏類芽孢桿菌HT16的不同處理液對梨黑斑病病原菌的生長也表現(xiàn)出不同的抑制作用（圖2）。其中，HT16粗提蛋白的抑菌效果最顯著，抑菌圈直徑達(dá)到17.6 mm。HT16菌懸液和發(fā)酵液對梨黑斑病病原菌的抑菌圈直徑分別為10.4、14.7 mm。

2.2 多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病發(fā)病率的影響

對健康的梨果實(shí)進(jìn)行刺傷，接種不同的處理液后，接種黑斑病病原菌，再進(jìn)行貯藏，結(jié)果如圖3、圖4所示。由圖3可以看出，多黏類芽孢桿菌HT16的發(fā)酵液、菌懸液、蛋白粗提液對梨黑斑病病原菌均有不同程度的抑制效果，處理組的梨黑斑病發(fā)病率明顯低于對照。在保存的第2天，對照和菌懸液組的梨發(fā)病率達(dá)到100%，發(fā)酵液處理組的梨發(fā)病率為 83.3%，而蛋白粗提液處理的梨果實(shí)未發(fā)病。保存到第12天，對照的梨黑斑病病斑直徑達(dá)到 39.61 mm，而發(fā)酵液組、菌懸液組、蛋白粗提液組的梨黑斑病病斑直徑分別為36.53、35.17、0 mm。由此可以看出，粗提蛋白抑菌效果最好，無發(fā)病狀況。菌懸液處理后的傷口梨黑斑生長旺盛，發(fā)酵液處理組雖有傷口腐爛但無梨黑斑菌絲出現(xiàn)?？梢?，發(fā)酵液比菌懸液處理組更能抑制梨黑斑病菌的生長，這與體外抑菌結(jié)果一致。

2.3 多黏類芽孢桿菌HT16的抑菌機(jī)理

2.3.1 對孢子萌發(fā)的影響 多黏類芽孢桿菌HT16蛋白粗提液對梨黑斑菌病原菌孢子萌發(fā)的影響如圖4所示。由圖4-A中可以看出，梨黑斑的對照組孢子已經(jīng)萌發(fā)，經(jīng)測定其萌發(fā)率為96.67%，并生長出菌絲，而圖4-B 中的孢子未萌發(fā)并且有消融現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.3.2 對菌絲生長的影響 在掃描電鏡下觀察了HT16處理梨黑斑菌絲生長的形態(tài)，結(jié)果如圖5所示。圖5-B-1、圖5-B-2為粗提蛋白處理后菌絲狀況。由此可以看出，蛋白粗提液處理的梨黑斑菌絲扭曲并且萎縮，菌絲外表皮有脫落現(xiàn)象，菌絲變成畸形狀態(tài)，且有斷裂現(xiàn)象。而正常的菌絲光滑、均勻（圖5-A-1、圖5-A-2）。

3 結(jié)論與討論

對峙法和牛津杯法的結(jié)果均顯示，多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病菌鏈格孢菌有顯著的抑制作用。HT16菌懸液、發(fā)酵液和粗提蛋白對梨采后黑斑病均表現(xiàn)出一定的抑制效果。其中，粗提蛋白的效果最顯著。掃描電鏡和電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，粗提蛋白處理過的病原菌孢子基本不萌發(fā)，并有消融現(xiàn)象，且菌絲扭曲、萎縮，菌絲外表皮出現(xiàn)脫落和斷裂。這些結(jié)果顯示了多黏類芽孢桿菌HT16作為生防細(xì)菌的可行性。

HT16菌株發(fā)酵過程中產(chǎn)生的粗提蛋白對梨采后黑斑病的防治效果非常顯著， 抑菌機(jī)制試驗(yàn)也證實(shí)了粗提蛋白對梨黑斑及其孢子和菌絲的抑制作用。近年來，利用微生物自身的拮抗、競爭作用及其產(chǎn)生的抗菌蛋白防治果蔬采前和采后病原真菌的報(bào)道很多。其中，枯草芽孢桿菌H110的粗提蛋白對梨采后因青霉菌和黑斑病菌引起的腐敗表現(xiàn)出很好的抑制效果[10]。周防震將番茄表面分離到的酵母菌L-1-6和 H-2 用于控制番茄的腐敗，菌懸液處理后的番茄腐爛率、失水率和總損耗均顯著降低，對采后番茄的根霉病及早疫病病害的控制也起到了顯著效果[12]。Wichitea等報(bào)道，分離自土壤中的枯草芽孢桿菌對柑橘類水果由青霉引起的病害抑制效果顯著[13]。Arun等發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母和假絲酵母對炭疽病菌有防治作用，能顯著降低辣椒炭疽及其他病害的發(fā)病率[14]。細(xì)菌 P-FS08 所產(chǎn)生的拮抗蛋白對果蔬和糧食作物致病真菌也表現(xiàn)出廣譜的抑菌作用，可使病原菌菌絲斷裂、原生質(zhì)體濃縮[15]。但對于多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑的防治未見報(bào)道。

為使菌株真正在生產(chǎn)中應(yīng)用，達(dá)到有效防治果蔬采前和采后病害的目的，在后續(xù)研究中還將對該菌株及其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)進(jìn)行安全性評價，同時聯(lián)合農(nóng)業(yè)相關(guān)企業(yè)嘗試開發(fā)該微生物制劑，探討該菌株與其他物質(zhì)如殼聚糖、水楊酸等[16-17]的聯(lián)合使用效果和使用方式，并進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)，以期為生物農(nóng)藥的研發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)際參考，為果蔬病害的生物防治及食品安全提供保障。

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