代海艷+江翱+李偉

摘要：醛酮還原酶（aldo-keto reductase，AKR）是機(jī)體依賴NAD（P）H的一類重要的氧化還原酶，在細(xì)胞有毒羰基化合物代謝中具有重要作用。迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)魚類醛酮還原酶基因及其功能的報(bào)道。為了解魚類醛酮還原酶在細(xì)胞抗有毒羰基化合物脅迫過(guò)程中的作用，筆者比較了含重組黃鱔AKR基因的陽(yáng)性菌株和不含該重組基因的陰性對(duì)照在丙酮醛及2，3-丁二酮2種羰基化合物處理后的存活率。結(jié)果表明，隨著毒性物質(zhì)處理時(shí)間的延長(zhǎng)和處理濃度的升高，陽(yáng)性菌株和對(duì)照菌株存活率均呈逐漸下降趨勢(shì)；陽(yáng)性菌株的存活率始終極顯著高于對(duì)照菌株（P<0.01）。結(jié)果提示，黃鱔的醛酮還原酶具有一定的羰基解毒作用。該研究為進(jìn)一步深入了解魚類AKR基因的功能提供了基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞：黃鱔；醛酮還原酶；羰基脅迫；存活率；解毒作用

中圖分類號(hào)：S941.91 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0150-03

醛酮還原酶（aldo-keto reductase，AKRs）超家族是一類廣泛存在依賴于NAD（P）H的氧化還原酶[1]。生物體內(nèi)氧化應(yīng)激[2]、致癌化合物降解[3]、糖尿病并發(fā)癥及腫瘤發(fā)生[4]等過(guò)程都有AKRs的參與。細(xì)胞內(nèi)存在低濃度的羰基化合物如不能被及時(shí)降解，就會(huì)通過(guò)羰基化修飾使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子發(fā)生構(gòu)象變化和功能喪失，并最終導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，引起癌變或壞死，這就是所謂的“羰基脅迫”[5]。醛酮還原酶可以將對(duì)細(xì)胞毒害較強(qiáng)的羰基化合物還原成相應(yīng)的對(duì)細(xì)胞毒害作用較小或無(wú)毒性的醇類物質(zhì)，承擔(dān)機(jī)體防護(hù)酶的作用[6]。研究表明，大腸桿菌[7]及藍(lán)藻[8]的AKR基因產(chǎn)物可有效降解丙酮醛、甘油醛等羰基化合物對(duì)細(xì)胞的毒害作用。植物的AKRs分子參與植物各種各樣的逆境脅迫反應(yīng)，是植物防御系統(tǒng)中不可或缺的部分[9]。人類的AKR1B10基因轉(zhuǎn)化到293T細(xì)胞中后，可有效降低不飽和羰基對(duì)細(xì)胞的毒害作用[10]。老鼠的AKR7A1基因在中國(guó)倉(cāng)鼠V79-4細(xì)胞中的表達(dá)也可提高細(xì)胞對(duì)丙烯醛和HNE的抵抗力[11]。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，生理狀態(tài)下的醛酮還原酶對(duì)細(xì)胞毒性羰基物質(zhì)具有解毒功能。

盡管有關(guān)于高等脊椎動(dòng)物、細(xì)菌和植物的醛酮還原酶分子的研究眾多，但人們對(duì)于魚類的醛酮還原酶基因及其功能卻知之甚少。苯并芘（BaP）處理羅非魚可顯著提高其肝組織醛酮還原酶AKR1A1基因的大量表達(dá)，該研究結(jié)果提示羅非魚的AKR1A1分子可能在BaP解毒過(guò)程中具有重要的作用[12]。在前期的研究中，筆者所在實(shí)驗(yàn)室克隆了黃鱔肝臟醛酮還原酶基因并構(gòu)建了其原核表達(dá)載體。為進(jìn)一步分析黃鱔醛酮還原酶在細(xì)胞抗羰基脅迫中的作用，筆者對(duì)比了含有重組黃鱔醛酮還原酶基因和不含該基因的大腸桿菌在受到丙酮醛和2，3-丁二酮等有毒羰基化合物脅迫后的存活率，分析了羰基化合物處理時(shí)間和濃度差異對(duì)細(xì)胞毒性的影響。這為深入了解魚類的醛酮還原酶的羰基解毒作用和功能提供了重要參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株和試劑

含pET-28a-EakR1重組質(zhì)粒的BL21（DE3）菌株和含pET-28a空白質(zhì)粒的BL21（DE3）菌株，由長(zhǎng)江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所保存；丙酮醛和2，3丁二酮，購(gòu)買于Aladdin公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 菌株活化及誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)

將重組陽(yáng)性菌株和對(duì)照菌在含50 μg/mL Kan的LB平板上劃線，在37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取于單克隆LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、250 r/min恒溫?fù)u床上培養(yǎng)4 h后，加入終濃度為 0.1 mmol/L 的IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h，取適量菌液用12%的 SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.3 羰基化合物濃度大小對(duì)大腸桿菌存活率的影響

挑取陽(yáng)性重組菌單克隆于6 mL含50 μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)3 h后，加入終濃度為 0.5 mmol/L 的IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)1 h。將誘導(dǎo)培養(yǎng)液分裝至6只EP管中，然后在EP管中加入丙酮醛（或2，3-丁二酮），使其終濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L，進(jìn)一步在37 ℃靜置1 h。離心收集菌體，滅菌水洗滌3次后用1 mL新鮮液體LB重懸。取10 μL菌液進(jìn)行101、102、103、104、105、106…倍梯度稀釋。取稀釋后的系列菌液50 μL涂布在含Kana的LB平板上后于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)12 h。選擇菌落數(shù)在100～500的平板，用Shineso公司的平板菌落計(jì)數(shù)儀進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，根據(jù)相應(yīng)稀釋倍數(shù)推算稀釋前的總菌落個(gè)數(shù)。計(jì)算出不同濃度丙酮醛（或2，3-丁二酮）處理后大腸桿菌的存活率（SC）。對(duì)照菌同樣處理，重復(fù)3次。

SC=各濃度丙酮醛（2，3-丁二酮）處理后的總菌落個(gè)數(shù)不添加丙酮醛（2，3-丁二酮）處理的總菌落個(gè)數(shù)×100%。

1.4 羰基化合物處理時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)大腸桿菌存活率的影響

按照“1.3”節(jié)進(jìn)行重組菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)后的菌液中加入終濃度為2 mmol/L的丙酮醛（或2，3-丁二酮），分別在37 ℃靜置培養(yǎng)0、10、20、30、40、50、60 min。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出菌液0.1 mL，離心收集菌體并進(jìn)行梯度稀釋。稀釋后的菌液取50 μL涂布在含Kana的LB平板上后于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)12 h。選擇菌落數(shù)在100～500的平板，用Shineso公司的平板菌落計(jì)數(shù)儀進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，根據(jù)相應(yīng)稀釋倍數(shù)推算稀釋前的總菌落個(gè)數(shù)。計(jì)算出丙酮醛（或2，3-丁二酮）處理不同時(shí)間大腸桿菌的存活率（ST）。對(duì)照菌同樣處理，重復(fù)3次。

ST=丙酮醛（2，3-丁二酮）處理不同時(shí)間后的總菌落個(gè)數(shù)不添加丙酮醛（2，3-丁二酮）處理的總菌落個(gè)數(shù)×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件中的單因素方差分析（A-NOVA）進(jìn)行，存活率結(jié)果用 x±s表示，并進(jìn)行Duncans多重比較檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)為差異顯著，當(dāng)P<0.01時(shí)差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

由圖1可知，相對(duì)于陽(yáng)性重組質(zhì)粒，空白質(zhì)粒菌株在用IPTG誘導(dǎo)前后均沒(méi)有表達(dá)外源蛋白；而含有EakR1的重組菌株用IPTG誘導(dǎo)后與未誘導(dǎo)相比明顯表達(dá)了EakR1。EakR1分子量大約為37 ku，與醛酮還原酶理論分子量大小相符。這說(shuō)明黃鱔AKR基因可以實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌BL21（DE3）中的融合表達(dá)。

2.3 羰基化合物濃度大小對(duì)大腸桿菌存活率的影響結(jié)果

由圖2可知，丙酮醛的處理對(duì)大腸桿菌細(xì)胞有著極強(qiáng)的毒害作用；隨著丙酮醛濃度升高，2組大腸桿菌的存活率都極顯著下降。當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中丙酮醛濃度達(dá)到2.5 mmol/L時(shí)，陰性對(duì)照菌株的存活率極低（10-3%～10-4%），而陽(yáng)性重組菌株的存活率（約1%）與陰性對(duì)照相比有極顯著提高，約為陰性對(duì)照菌株存活率1 000～10 000倍。

由圖3可知，2，3-丁二酮處理對(duì)大腸桿菌細(xì)胞也有較強(qiáng)毒害作用，但效果比丙酮醛低得多。隨著2， 3-丁二酮濃度升高，2組大腸桿菌菌株存活率也出現(xiàn)明顯降低。當(dāng)培養(yǎng)基

中2，3-丁二酮的濃度達(dá)到2.5 mmol/L時(shí)，陰性對(duì)照菌株的存活率只有約5%，而陽(yáng)性重組菌株存活率達(dá)到44%，約為空質(zhì)粒對(duì)照菌株存活率的9倍。

2.5 羰基化合物處理時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)大腸桿菌存活率的影響結(jié)果

由圖4可知，當(dāng)與2 mmol/L丙酮醛共同培養(yǎng)時(shí)，隨著時(shí)間延伸，陽(yáng)性重組菌及對(duì)照菌株的存活率都呈逐漸下降的趨勢(shì)；且丙酮醛對(duì)陰性對(duì)照菌株的毒害作用要明顯高于陽(yáng)性重組菌株。當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，陰性對(duì)照菌株的存活率約為10-3%，而重組菌株的存活率約為1.4%，約為對(duì)照菌株的 1 400 倍。

相似地，如圖5可知，2，3-丁二酮對(duì)細(xì)胞的毒害作用要低于丙酮醛，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，2組菌株的存活率也呈下降趨勢(shì)；當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，陰性對(duì)照菌株的存活率約為6.8%，而陽(yáng)性重組菌株的存活率約為55.8%，約為對(duì)照菌株的8倍。

3 討論

醛酮還原酶在自然界分布廣泛且結(jié)構(gòu)相對(duì)保守；具有多樣化的功能，可能參與了細(xì)胞內(nèi)各種各樣羰基化合物的代謝作用[1]。作為羥化類固醇脫氫酶（HSD），它們參與了高等哺乳動(dòng)物的類固醇代謝平衡調(diào)節(jié)和致病過(guò)程[13]；作為醛糖還原酶，它們與多種慢性疾病或并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]；作為酮還原酶或醛還原酶，它們是機(jī)體細(xì)胞外源性或內(nèi)源性毒性物質(zhì)代謝的重要分子[15]。盡管不同來(lái)源的醛酮還原酶具有相類似的（α/β）8桶裝二級(jí)結(jié)構(gòu)和催化四分體氨基酸，它們?cè)诘孜镒R(shí)別和催化機(jī)理上還是存在非常大的差異[16]。作為醛酮還原酶超級(jí)家族中一個(gè)新的成員，黃鱔醛酮還原酶的功能有待深入研究。

甘油醛是細(xì)胞甘油代謝途徑產(chǎn)生的對(duì)細(xì)胞有高毒性的化合物，它可修飾或改變細(xì)胞內(nèi)大分子化合物的構(gòu)象及功能[17]?，F(xiàn)有研究表明，大多數(shù)細(xì)胞的甘油醛解毒作用是通過(guò)Ⅰ型和Ⅱ型乙二醛酶的轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)的[18]；越來(lái)越多的試驗(yàn)也證實(shí)醛酮還原酶可將甘油醛轉(zhuǎn)化為低毒的丙酮醇以實(shí)現(xiàn)解毒作用，是細(xì)胞抗羰基脅迫的重要分子。細(xì)菌的醛酮還原酶分子在體內(nèi)對(duì)甘油醛具有明顯的降解作用[19-20]，低等的藍(lán)藻也對(duì)醛酮還原酶降解丙酮醛有較強(qiáng)的依賴作用[8]。

筆者研究表明，丙酮醛和2，3-丁二酮等羰基化合物對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)均具有較強(qiáng)的毒害作用；且丙酮醛的毒害作用遠(yuǎn)大于2，3-丁二酮，其對(duì)大腸桿菌致死率約為2，3-丁二酮的6 000倍。重組黃鱔EakR1的菌株能夠顯著提高細(xì)菌抵抗羰基化合物毒害作用的能力。其中，在丙酮醛脅迫試驗(yàn)中能夠?qū)⒋竽c桿菌的存活率提高1 000～10 000倍；在2，3-丁二酮脅迫試驗(yàn)中能夠?qū)⒋竽c桿菌的存活率提高約9倍。表明，黃鱔EakR1基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物能夠有效降解丙酮醛和2，3-丁二酮等有毒羰基化合物，起到保護(hù)酶的作用。當(dāng)然，目前對(duì)于醛酮還原酶在黃鱔羰基化合物脅迫和其他生理過(guò)程中的具體作用和機(jī)制尚不可知，需要進(jìn)一步深入研究。該試驗(yàn)結(jié)果為人們深入了解魚類醛酮還原酶的功能并應(yīng)用于魚類養(yǎng)殖實(shí)踐提供了基礎(chǔ)資料。

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