林 彬 馮德廣

(河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003)

Galectin-8蛋白對組織工程心臟瓣膜種子細(xì)胞的增殖、黏附功能的影響

林 彬 馮德廣

(河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003)

目的 體外研究Galectin-8在不同濃度或狀態(tài)下對組織工程心臟瓣膜種子細(xì)胞增殖及黏附的影響。方法 以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來的內(nèi)皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞，離體狀態(tài)下常規(guī)培養(yǎng)。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法測定不同濃度下Galectin-8作用12、24、48 h后對細(xì)胞增殖的影響；將細(xì)胞分為重組質(zhì)粒pGFP-Galectin-8轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒pGFP轉(zhuǎn)染組、陰性對照組及蛋白預(yù)鋪組，分別鋪于96孔板中，觀察相同時(shí)間段的細(xì)胞黏附數(shù)量。結(jié)果 Galectin-8 10、20、40 μg/ml劑量組的細(xì)胞增殖數(shù)目均顯著高于空白對照組，其中20 μg/ml組表現(xiàn)尤為顯著(P<0.05)；pGFP-Galectin-8轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率與空質(zhì)粒pGFP轉(zhuǎn)染組無顯著差異(P>0.05)，且Galectin-8的表達(dá)量顯著高于空質(zhì)粒pGFP轉(zhuǎn)染組和陰性對照組(P<0.05)；細(xì)胞種植到培養(yǎng)板上1、2、4 h后，蛋白預(yù)鋪組相同時(shí)間的細(xì)胞黏附數(shù)量顯著高于其他各組(P<0.05)，pGFP-Galectin-8轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞黏附數(shù)量顯著小于其他各組(P<0.05)，空質(zhì)粒pGFP轉(zhuǎn)染組和陰性對照組的細(xì)胞黏附數(shù)量無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論 Galectin-8對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，且在細(xì)胞種植前預(yù)鋪蛋白固定后能夠顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，而胞內(nèi)Galectin-8過表達(dá)則抑制細(xì)胞黏附。

Galectin-8；組織工程心臟瓣膜；種子細(xì)胞；增殖；黏附

組織工程心臟瓣膜是一種理想的人造心臟瓣膜，在治療心臟瓣膜性疾病過程中能夠克服機(jī)械瓣膜和生物瓣膜的缺點(diǎn)，有望實(shí)現(xiàn)抗凝、耐受且對生長發(fā)育無副作用〔1〕。組織工程心臟瓣膜的研究重點(diǎn)分為種子細(xì)胞、支架材料及瓣膜構(gòu)建三個(gè)方面，目前有關(guān)種子細(xì)胞和支架材料的研究已比較成熟，而關(guān)于瓣膜構(gòu)建仍處于摸索階段，尤其是如何將種子細(xì)胞最大效率地種植在支架上，提高其增殖速度和黏附性成為目前該項(xiàng)目的研究關(guān)鍵〔2〕。Galectin-8蛋白屬于β-半乳糖凝集素家族，是一種分泌蛋白，主要通過與整合素結(jié)合，活化相關(guān)細(xì)胞通路，調(diào)控細(xì)胞黏連，在細(xì)胞黏附中發(fā)揮重要作用，但研究表明Galectin-8蛋白在細(xì)胞黏附中具有雙重作用〔3，4〕。本研究通過不同濃度不同處理方式研究Galectin-8蛋白對種子細(xì)胞增殖及黏附的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)資料及主要試劑 種子細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化并凍存；Galectin-8蛋白購自sino生物科技公司；pGFP-Galectin-8表達(dá)質(zhì)粒由上海生工生物有限公司構(gòu)建。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)和胰蛋白酶購自Sigma公司，Dulbecco極限必需培養(yǎng)基達(dá)爾伯克漢良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)及胎牛血清均購自GIBCO公司，Lipofectamine?2000購自Invitrogen公司，兔抗人Galectin-8一抗及羊抗兔二抗均購自Abcam公司。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng) 凍存的血管內(nèi)細(xì)胞作為組織工程心臟瓣膜種子細(xì)胞，37℃水浴中快速融化，加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋，1 000 r/min，離心5 min，吸棄培養(yǎng)基，再用3 ml新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并吸入培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 內(nèi)皮細(xì)胞傳至3～4代后，待細(xì)胞生長至瓶底的90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化處理，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)細(xì)胞量至5×104/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組6個(gè)復(fù)孔，每孔200 μl，置于CO2培養(yǎng)中培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基更換為含不同濃度Galectin-8(5、10、20、40 μg/ml)的細(xì)胞培養(yǎng)液，以不含蛋白的培養(yǎng)基作為空白對照，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于培養(yǎng)12、24、48 h后測定細(xì)胞量，每孔加10 μl MTT(5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，于酶標(biāo)儀下測定OD490 nm的吸光值。

1.4 黏附實(shí)驗(yàn)

1.4.1 將細(xì)胞進(jìn)行分組處理 ①將重組質(zhì)粒pGFP-Galectin-8按照Lipofectamine?2000操作說明轉(zhuǎn)染至提前鋪于6孔板的細(xì)胞中，細(xì)胞初密度為1.5×105/孔，并于轉(zhuǎn)染后24 h在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，收集細(xì)胞，提取蛋白，Western印跡法檢測蛋白表達(dá)水平，使用Image J進(jìn)行條帶分析。②將不含Galectin-8基因的空質(zhì)粒載體pGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞，操作方法同上。③細(xì)胞不做任何處理，在相同時(shí)間收集細(xì)胞，作為陰性對照。④在細(xì)胞鋪板前，將增殖實(shí)驗(yàn)中濃度最佳的Galectin-8蛋白預(yù)鋪至96孔板中為蛋白預(yù)鋪組，并于4℃風(fēng)干16 h，磷酸緩沖液(PBS)沖洗。

1.4.2 黏附性測定 將處理或轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按照5×104/孔的細(xì)胞密度鋪于96孔板中，培養(yǎng)基不含血清，每組重復(fù)3次，放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)1、2、4 h后分別取出培養(yǎng)板吸棄培養(yǎng)液，加100 μl甲醇，固定15 min，蒸餾水沖洗后晾干，采用100 μl吉姆薩進(jìn)行15 min染色，并在室溫風(fēng)干，于顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔取3個(gè)不同的視野進(jìn)行計(jì)數(shù)最終取平均值作為黏附細(xì)胞數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Galectin-8對細(xì)胞增殖的影響 當(dāng)Galectin-8處理細(xì)胞12 h時(shí)，各組細(xì)胞量無顯著差異，作用24 h后，Galectin-8處理組的細(xì)胞數(shù)量高于對照組，其中Galectin-8 10、20、40 μg/ml濃度的細(xì)胞量與空白對照組差異顯著(P<0.05)，作用時(shí)間延長至48 h，細(xì)胞密度較24 h均有上升，其中Galectin-8 20 μg/ml組的細(xì)胞密度顯著大于其他各組(P<0.05)。見表1。

2.2 各組內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況 轉(zhuǎn)染后24 h pGFP-Galectin-8轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率為57.03%，空質(zhì)粒pGFP轉(zhuǎn)染組56.50%，兩組無顯著差異，陰性對照組未做任何處理，在同樣曝光強(qiáng)度和曝光時(shí)間下，無熒光出現(xiàn)。見圖1。

2.3 各組內(nèi)皮細(xì)胞中Galectin-8蛋白表達(dá)情況 pGFP-Galectin-8轉(zhuǎn)染組Galectin-8的表達(dá)(1.15±0.02)顯著高于空質(zhì)粒pGFP組(0.08±0.01)和陰性對照組(0.03±0.01)(P<0.05)。見圖2。

表1 Galectin-8對細(xì)胞增殖的影響

與空白對照組比較:1)P<0.05；與其他各組比較：2)P<0.05

圖1 各組轉(zhuǎn)染效率比較(×200)

1.pGFP-Galectin-8轉(zhuǎn)染組；2.空質(zhì)粒pGFP轉(zhuǎn)染組；3.陰性對照組圖2 Galectin-8蛋白表達(dá)情況

2.4 Galectin-8對細(xì)胞黏附的影響 蛋白預(yù)鋪組細(xì)胞黏附個(gè)數(shù)最多，在不同時(shí)間段均顯著高于其他各組(P<0.05)，且隨著時(shí)間的增長不斷增多，pGFP-Galectin-8轉(zhuǎn)染組細(xì)胞黏附數(shù)目最少，顯著低于其他3組，陰性對照組與空質(zhì)粒pGFP轉(zhuǎn)染組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。

表2 Galectin-8對細(xì)胞黏附的影響，個(gè),n=9)

與pGFP-Galectin-8轉(zhuǎn)染組比較：1)P<0.05；與空質(zhì)粒pGFP轉(zhuǎn)染組比較：2)P<0.05；與陰性對照組比較：3)P<0.05

3 討 論

心臟瓣膜病、先天性心臟病嚴(yán)重危害人類健康，其治療是心外科領(lǐng)域的重點(diǎn)、難點(diǎn)。組織工程心臟瓣膜由于其優(yōu)良的血流動(dòng)力學(xué)性能，不需抗凝，不僅應(yīng)用于主動(dòng)脈瓣和肺動(dòng)脈瓣的置換，同時(shí)還是復(fù)雜先天性心臟病糾治中帶瓣管道良好的替代材料。獲得種子細(xì)胞是組織工程的前提基礎(chǔ)，目前篩選得到符合條件的種子細(xì)胞主要包括間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及干細(xì)胞等，但血管內(nèi)皮細(xì)胞主要來源于用動(dòng)脈或靜脈，在取材時(shí)具有一定創(chuàng)傷性，間質(zhì)細(xì)胞主要為肌纖維細(xì)胞，其功能與正常瓣膜細(xì)胞具有一定差距〔5，6〕。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞，獲取方便，體外培養(yǎng)、純化、擴(kuò)增的技術(shù)也較為成熟，能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，已成為制備種子細(xì)胞的理想材料〔7〕。

在瓣膜構(gòu)建過程中種子細(xì)胞與支架材料相互作用是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，如何促進(jìn)種子細(xì)胞在支架材料上的增殖、黏附及延長其在瓣膜表面的壽命成為目前研究的關(guān)鍵〔8〕。Galectin-8屬于凝集素亞家族，包含兩個(gè)碳水化合物識別區(qū)，主要分為原始型、串聯(lián)重復(fù)型和嵌合體型三種類型。研究表明，Galectin-8可以促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖，低劑量的Galectin-8可以促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用〔9〕。另有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Galectin-8濃度過高時(shí)會引起胞內(nèi)鈣離子和磷酯酰絲氨酸增多，刺激caspase-3的表達(dá)促進(jìn)上皮細(xì)胞凋亡〔10〕。本研究在探討Galectin-8對細(xì)胞增殖影響時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)其在一定濃度范圍內(nèi)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長，當(dāng)過高時(shí)反而導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量下降，與上述觀點(diǎn)一致。種子細(xì)胞與支架材料之間的黏附主要是細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附，即在黏附因子介導(dǎo)下細(xì)胞表面受體與胞外配體結(jié)合，再與基質(zhì)相互作用引起細(xì)胞與基質(zhì)的黏附〔11〕。黏附因子主要包括整合素家族、鈣黏素、免疫球蛋白超家族、選擇素家族及透明質(zhì)酸黏素五類。整合素是一種跨膜蛋白，在與配體結(jié)合活化后，可以通過α-肌動(dòng)蛋白、裸蛋白及黏著斑蛋白等與細(xì)胞骨架連接，形成配體-整合素-細(xì)胞骨架系統(tǒng)，促進(jìn)細(xì)胞黏附〔12〕。據(jù)報(bào)道，Galectin-8蛋白作為細(xì)胞內(nèi)的活化因子，能夠增加整合素與配體的結(jié)合，活化細(xì)胞內(nèi)的信號通路，進(jìn)而促進(jìn)黏著斑激酶FAK磷酸化，小GTP酶的激活及結(jié)合蛋白的恢復(fù)等，最終增強(qiáng)細(xì)胞與基質(zhì)蛋白的黏附〔13〕。但Galectin-8蛋白對整合素的調(diào)控具有雙重作用，Troncoso等〔14〕研究顯示當(dāng)Galectin-8蛋白過量分泌時(shí)，導(dǎo)致其與細(xì)胞表面的整合素大量結(jié)合，負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的黏附。熊輝強(qiáng)等〔15〕研究表明Galectin-8在組織分化差惡性程度高的喉鱗狀上皮細(xì)胞癌中高表達(dá)，參與癌細(xì)胞的黏附侵襲。本研究表明過量的Galectin-8能夠占據(jù)細(xì)胞表面的整合素結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而降低細(xì)胞黏附活性，而將Galectin-8預(yù)先包被在載體上，再種植細(xì)胞時(shí)能夠顯著增加細(xì)胞的黏附活性。

綜上，Galectin-8蛋白在一定濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染Galectin-8表達(dá)質(zhì)粒時(shí)會導(dǎo)致溶解性蛋白過量進(jìn)而抑制細(xì)胞與基質(zhì)的黏附，而將Galectin-8蛋白在種植細(xì)胞前預(yù)鋪于載體上能促進(jìn)細(xì)胞黏附。

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〔2015-03-19修回〕

(編輯 苑云杰)

林 彬(1982-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事心臟基礎(chǔ)及臨床研究。

R654.2

A

1005-9202(2017)03-0573-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.021