易銘，梁嘉俊，史建，李洪建，程積民，焦鋒*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.彬縣西坡鄉(xiāng)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，陜西 彬縣 713500)

采用EF-1α序列分析法對(duì)苜蓿根腐病病原菌
——銳頂鐮刀菌的鑒定

易銘1，梁嘉俊1，史建2，李洪建1，程積民1，焦鋒1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.彬縣西坡鄉(xiāng)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，陜西 彬縣 713500)

苜蓿根腐病對(duì)苜蓿生長(zhǎng)和產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響，為了解引起根腐病病原真菌的種類(lèi)，本文對(duì)從陜西省定邊縣牧草草場(chǎng)紫花苜蓿根部分離得到的根腐病病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、EF-1α序列分析鑒定及接種試驗(yàn)。結(jié)果表明：通過(guò)對(duì)病原菌在PDA培養(yǎng)基中的分離、純化得到的單菌落形態(tài)學(xué)觀察及顯微鏡下菌絲、孢子的觀察，該病原菌屬于引起苜蓿根腐病的鐮刀菌屬(Fusarium)；用CTAB法提取病原菌基因組DNA，并對(duì)EF-1α序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、回收純化、克隆測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析與Genbank已知近緣種屬親緣關(guān)系，結(jié)果顯示與銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)親緣關(guān)系最近，可信度達(dá)99%；最后通過(guò)根部接種試驗(yàn)，接種苜蓿根部發(fā)病癥狀與田間根腐病發(fā)病癥狀一致，鑒定結(jié)果顯示本試驗(yàn)研究的引起紫花苜蓿根腐病的病原菌為鐮刀菌屬銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)。

紫花苜蓿；根腐??；EF-1α；銳頂鐮刀菌

紫花苜蓿(Medicagosativa)屬薔薇目，豆科，苜蓿屬草本植物，是世界上栽培最早、種植面積最廣的豆科牧草。紫花苜蓿不僅能夠改良土壤結(jié)構(gòu)，且蛋白含量高、氨基酸組成比例合理、維生素含量豐富，有"牧草之王"的美稱(chēng)[1]。紫花苜蓿種植面積大，產(chǎn)量高，經(jīng)濟(jì)效益顯著，是我國(guó)重要的牧草資源，而苜蓿病害是制約苜蓿生產(chǎn)和影響苜蓿產(chǎn)品質(zhì)量的最主要因素。導(dǎo)致病害的病原微生物包括真菌、細(xì)菌、病毒、線(xiàn)蟲(chóng)等，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年由牧草病蟲(chóng)害造成的牧草生產(chǎn)損失達(dá)35%以上[2]。苜蓿病害使苜蓿營(yíng)養(yǎng)成分下降，進(jìn)而降低了飼用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著我國(guó)苜蓿生產(chǎn)的快速發(fā)展，種植面積的擴(kuò)大和集約化程度的不斷提高，苜蓿病害所造成的損失也愈發(fā)嚴(yán)重。一些原來(lái)不重要的病害、危害不大的病害，可能會(huì)成為爆發(fā)性的、廣泛流行的病害。因此，苜蓿病害研究工作對(duì)提高苜蓿產(chǎn)量及產(chǎn)品質(zhì)量有著重要的作用。

苜蓿根腐病是世界性病害，普遍發(fā)生在各苜蓿種植地區(qū)。因苜蓿利用年限較長(zhǎng)，苜蓿根腐病已成為苜蓿產(chǎn)量下降和植株衰敗的一個(gè)極其重要的原因[3]。苜蓿根腐病多由鐮刀菌侵染導(dǎo)致，該病對(duì)苜蓿生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期均可造成嚴(yán)重危害，導(dǎo)致根中柱腐爛，根莖和根中部變空，分支減少，側(cè)根大量腐爛死亡，固氮能力降低，苜蓿壽命和利用年限縮短[4]，王雪薇等[5]的研究表明根腐病是限制新疆苜蓿生產(chǎn)的主要因素，死亡率可達(dá)60.08%～70.45%；孟嫣等[6]報(bào)道甘肅定西地區(qū)苜蓿發(fā)病植株比健康植株發(fā)芽延遲20 d左右，且分蘗數(shù)明顯減少，植株稀疏，生長(zhǎng)緩慢；陳雅君等[7]對(duì)黑龍江各地區(qū)紫花苜蓿根腐病的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，根腐病在各地區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重地區(qū)發(fā)病率高達(dá)92%。苜蓿鐮刀菌根腐病主要病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporium)、腐皮鐮刀菌(F.solani)、燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)等。

真菌的分類(lèi)與鑒定在過(guò)去一般采用形態(tài)學(xué)的方法，即根據(jù)真菌的形態(tài)、生長(zhǎng)特點(diǎn)、孢子結(jié)構(gòu)等特征來(lái)加以區(qū)分。但是真菌種類(lèi)眾多，往往不同種屬的真菌表現(xiàn)出相似的特征，僅依靠形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定準(zhǔn)確性比較低，同時(shí)也難以在種的層次上判斷真菌的分類(lèi)。而準(zhǔn)確的診斷是制定經(jīng)濟(jì)有效的防治病害的基礎(chǔ)，因此能夠準(zhǔn)確鑒定真菌病原菌的種類(lèi)是十分必要的。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的植物病理學(xué)研究者用分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于苜蓿病害的分子鑒定中。相比傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，分子技術(shù)手段更能夠反映出不同種病原真菌的本質(zhì)區(qū)別，能夠客觀、準(zhǔn)確而又快速地鑒定植物病原菌。通過(guò)將得到的病原菌信息在生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，研究人員能夠更好地研究真菌的表型、遺傳、地域分布之間的關(guān)系。目前常用于真菌分類(lèi)鑒定的DNA片段主要有5.8S rDNA基因，18S rDNA基因，28S rDNA基因，ITS(intra transcription spacer)序列，IGS(intragenic spacer)序列，線(xiàn)粒體細(xì)胞色素b(mitochondrial cytochrome b)基因，翻譯延伸因子(translationelongation factor,TEF)基因等[8]。其中EF-1α序列常用來(lái)鑒定鐮刀菌屬真菌[9]，且EF-1α在物種鑒定方面有高分辨能力，較以往的ITS序列有較多的種間變異，適于作為系統(tǒng)進(jìn)化研究的遺傳標(biāo)記[10]。

本試驗(yàn)將田間發(fā)病苜蓿根部病原菌分離純化培養(yǎng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)和序列分析法對(duì)其進(jìn)行鑒定。由于利用ITS序列分析法未能對(duì)此病原菌進(jìn)行種級(jí)分類(lèi)，采用EF-1α序列分析法進(jìn)行鑒定，并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，同時(shí)對(duì)比其與ITS序列進(jìn)化樹(shù)的不同，進(jìn)而鑒定病原菌的種屬關(guān)系。本試驗(yàn)是國(guó)內(nèi)首次利用EF-1α序列分析法對(duì)苜蓿根腐病病原菌進(jìn)行鑒定的報(bào)道，以期為苜蓿根腐病的診斷和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的紫花苜蓿植株及病根于2015年8月采自陜西省榆林市定邊縣牧草種植基地(N 37°42′6.45″;E 107°37′28.75″)。選取病害癥狀典型的發(fā)病植株根部進(jìn)行拍照，并用木質(zhì)標(biāo)本夾制作標(biāo)本。

1.2 病原真菌分離

根據(jù)《植病研究方法》[11]真菌的分離培養(yǎng)步驟，在無(wú)菌操作環(huán)境下，從病斑邊緣處切取3 mm×3 mm小塊病組織，先用1%次氯酸鈉溶液消毒5～7 min，再置于75%乙醇3～5 s，之后以無(wú)菌水沖洗3次，接種在PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)。采用劃線(xiàn)培養(yǎng)法對(duì)菌落進(jìn)行純化，共培養(yǎng)10個(gè)培養(yǎng)皿的單菌落作為重復(fù)對(duì)照，并用斜面PDA培養(yǎng)基保種。

1.3 病原菌形態(tài)學(xué)特征和病原物的鑒定

依據(jù)真菌學(xué)分類(lèi)的常規(guī)方法，在PDA平板培養(yǎng)基上觀察并記錄菌落形狀、色澤與生長(zhǎng)速度等特征；顯微鏡下觀測(cè)分生孢子的形態(tài)、大小、隔膜數(shù)，頂端細(xì)胞喙的有無(wú)、形態(tài)、大小。

1.4 CTAB法提取苜蓿真菌病原菌基因組DNA

參照Guo等[12]的方法，部分操作稍有改進(jìn)：在培養(yǎng)基表面刮取菌絲，取250 mg左右液氮研磨、粉碎，加入600 μL的CTAB提取液、10 μL β-巰基乙醇，65 ℃水浴30 min；4 ℃ 12000 r/min離心10 min；取上清，加入1 μL的RNA 酶，37 ℃水浴1 h；加入24 μL無(wú)水乙醇及24 μL乙酸鉀KAC(5 mol/L)，冰上放置1 h；加等體積600 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，充分混勻，4 ℃ 12000 r/min離心10 min；取上清，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，4 ℃ 12000 r/min離心10 min；取上清，加等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)再次抽提；取上清，加600 μL異丙醇，混勻后-20 ℃靜置沉淀30～60 min；4 ℃ 12000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀加入75%乙醇300 μL洗滌，7000 r/min離心5 min，重復(fù)2次；沉淀在超凈臺(tái)吹風(fēng)干燥；100 μL ddH2O溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病原菌EF-1α序列的PCR擴(kuò)增和檢測(cè)

PCR擴(kuò)增引物為：EF-1H(5′-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3′)和EF-2T(5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′)[13]。擴(kuò)增體系為20 μL，其中模板DNA 1 μL，上下引物各1 μL，ddH2O 7 μL，Taq Mix 10 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s ，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，90 V下電泳30 min，經(jīng) EB染色后在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀測(cè)照相。

1.6 PCR產(chǎn)物的克隆、測(cè)序

PCR產(chǎn)物使用TianGen試劑盒純化回收后，連接入PMD-19T載體，16 ℃水浴1 h；將10 μL連接產(chǎn)物加入到融化的感受態(tài)中，冰浴30 min，再42 ℃熱激45～90 s，立即冰浴2 min；將連接產(chǎn)物與感受態(tài)加入到500 μL預(yù)熱37 ℃的LB液體培養(yǎng)基中，搖床震蕩培養(yǎng)60 min；取70～100 μL涂布在含有Amp(50 mg/mL)、IPTG(200 mg/mL)、X-gal(200 mg/mL)的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)；藍(lán)白斑篩選后放入含Amp(50 mg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩過(guò)夜培養(yǎng)；經(jīng)菌液PCR鑒定和Tiangen kit質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA后送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行核酸BLAST比對(duì)分析，并利用Mega軟件的UPGMA法和NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析其與GenBank公布的近緣種的親緣關(guān)系，確定病原菌種類(lèi)。

1.7 病原菌根部接種試驗(yàn)

采用根部接種法。用無(wú)菌的鐵匙刮取PDA平板上的菌落到10 mL離心管中，加入5 mL無(wú)菌水，用漩渦振蕩器使懸浮液混合均勻，7000 r/min離心5 min，離心后取上清液即為孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板觀察計(jì)數(shù)孢子懸液濃度，并稀釋使?jié)舛燃s為5×105個(gè)/mL。試驗(yàn)組接種對(duì)象選用在溫室內(nèi)培養(yǎng)一月后的無(wú)病紫花苜蓿，3組重復(fù)，每組3株；接種前先用清水洗凈根部，用滅菌過(guò)的刀片對(duì)根部造成輕微割傷；采用浸根接種法，將根部浸入孢子懸浮液數(shù)分鐘，接菌后的苜蓿置于溫室內(nèi)正常管理。對(duì)照組苜蓿根部同樣造成割傷，并用清水做同樣處理。定期記錄發(fā)病情況并選取病癥典型植株拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿根腐病癥狀及病原真菌形態(tài)特征

植株感病后枝條萎蔫下垂，生長(zhǎng)緩慢，葉片變黃枯萎。根部出現(xiàn)黃褐色病斑，病斑逐漸擴(kuò)大呈黃褐色水漬狀。主根或側(cè)根表皮呈黃褐色，病部表皮腐爛，有根毛脫落。根中部變空，分枝減少，側(cè)根大量腐爛死亡。病原菌在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下，生長(zhǎng)2 d后菌落平均直徑為1.3 cm，4 d后為3.13 cm，7 d后生長(zhǎng)速度較快，近鋪滿(mǎn)全皿，并出現(xiàn)3層顏色，最外層為淺黃色，中間層為色素棗紅色，最內(nèi)層為黃色孢子團(tuán)堆，菌落平均直徑8.5 cm(圖1)。氣生菌絲繁茂，呈白色絨狀，色素棗紅色；無(wú)小型分生孢子，大型分生孢子形態(tài)較為一致，鐮刀型，彎曲，中部細(xì)胞膨大，頂孢呈長(zhǎng)錐形，多為2～5橫隔膜。根據(jù)植株發(fā)病癥狀，病原菌形態(tài)特征等，依據(jù)植物病原真菌學(xué)[14]，初步認(rèn)定病原菌屬于半知菌亞門(mén)絲孢綱瘤座孢目鐮刀菌屬(Fusarium)。

圖1 苜蓿根腐病發(fā)病癥狀及病原形態(tài)特征Fig.1 The symptoms of alfalfa Fusarium root rot and morphology of isolated pathogen A、B：發(fā)病植株癥狀；C、D：PDA培養(yǎng)基上菌落正面與背面；E：光學(xué)顯微鏡下大型分生孢子。A，B：Symptoms of Fusarium root rot；C，D：Front and back surface of the colony on PDA；E：Macroconidium under light microscopy.

2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The agarose gel electrophoresis of DNA products amplified by PCR

以CTAB法提取出的病原菌DNA為模板，用EF-1H/EF-2T作為引物做PCR擴(kuò)增，5 μL點(diǎn)樣電泳，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下拍照如圖2，條帶單一較亮，且無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶，分子量在500～750 bp之間。

藍(lán)白斑篩選后，通過(guò)菌液PCR檢測(cè)，挑選陽(yáng)性克隆的菌樣，送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖3。用Bioxm軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果堿基成分及GC含量進(jìn)行分析，得到根腐病病原菌EF-1α序列總長(zhǎng)度為674 bp，其中G+C含量為51.19%。

圖3 苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌EF-1α序列Fig.3 The EF-1α sequence of alfalfa Fusarium root rot pathogen

2.3 EF-1α序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

在本試驗(yàn)的前期研究中，使用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對(duì)此病原菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，得到長(zhǎng)度為524 bp的核苷酸序列，用NJ法構(gòu)建ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。可以看到病原菌ITS序列seq2與銳頂鐮刀菌(Fusariumacuminatum)、 燕麥鐮刀菌(Fusariumavenaceum)、三線(xiàn)鐮刀菌(Fusariumtricinctum)在一個(gè)分支，且可信度(bootstrap)

圖4 病原菌rDNA-ITS序列的NJ樹(shù)Fig.4 The NJ tree of rDNA-ITS sequence

為68%，說(shuō)明此病原菌和鐮刀菌屬銳頂鐮刀菌、燕麥鐮刀菌、三線(xiàn)鐮刀菌的真菌親緣關(guān)系比較近，但由于病原菌與鐮刀菌屬的這幾個(gè)近緣種在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上同在一個(gè)分支且無(wú)法再分，單獨(dú)根據(jù)ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)尚無(wú)法準(zhǔn)確判斷病原菌的種級(jí)分類(lèi)水平。

因此采用EF-1α序列分析法繼續(xù)進(jìn)行鑒定，將EF-1α序列測(cè)序得到的序列與GenBank中已有序列進(jìn)行核酸BLAST比對(duì)分析，得到與GenBank中已有序列同源性較高的菌種信息(表1)，參比菌種均來(lái)自于被鐮刀菌侵染的不同植株[15-18]，本試驗(yàn)病原菌序列與Fusariumacuminatum序列同源性最高，Ident值為99%。

用Mega 6.0軟件將相似序列進(jìn)行比對(duì)，采用K2模型，分別用NJ法(圖5)和UPGMA(圖6)法構(gòu)建EF-1α序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表1 Blast比對(duì)得到相似序列的菌種信息Table 1 Strains of similar sequence

圖5 病原菌EF-1α序列的NJ樹(shù)Fig.5 The NJ tree of EF-1α sequence

圖6 病原菌EF-1α序列的UPGMA樹(shù)Fig.6 The UPGMA tree of EF-1α sequence

分支上側(cè)數(shù)字為大于50%的Bootstrap檢驗(yàn)值(1000次重復(fù))，通過(guò)對(duì)NJ樹(shù)的分析結(jié)果表明：在遺傳距離為0.005，bootstrap為1000次檢驗(yàn)時(shí)，病原菌EF-1α序列與Fusariumacuminatum在同一分支，且可信度達(dá)99%，可以初步認(rèn)定本試驗(yàn)研究的苜蓿根腐病病原菌屬于Fusariumacuminatum(銳頂鐮刀菌)種；UPGMA樹(shù)的結(jié)果與NJ樹(shù)結(jié)果一致。結(jié)合兩種建樹(shù)結(jié)果可以說(shuō)明，引起本試驗(yàn)中苜蓿根腐病的病原菌為銳頂鐮刀菌。

2.4 病原菌根部接種驗(yàn)證

接種的9株健康苜蓿有5株接種一周后出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀，接種兩周后可觀察到：試驗(yàn)組苜蓿根部出現(xiàn)明顯腐爛癥狀，主根呈黃褐色，表皮腐爛，根毛脫落，發(fā)病癥狀與田間癥狀相似，而對(duì)照組則沒(méi)有發(fā)病現(xiàn)象(圖7)。將試驗(yàn)組發(fā)病苜蓿根部病原菌再分離，純化培養(yǎng)，得到與原接種所用相同病原菌，根據(jù)科赫法則，可說(shuō)明本試驗(yàn)研究的病原菌是引起紫花苜蓿根腐病的病原菌，即銳頂鐮刀菌(Fusariumacuminatum)。

圖7 孢子懸浮液浸根法接種結(jié)果Fig.7 The results of inoculated with conidial suspension by root dipping

3 結(jié)論與討論

苜蓿根部病害是由土傳真菌所致，是影響苜蓿產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已研究證實(shí)的侵入苜蓿根部的真菌中，鐮刀菌屬(Fusarium)占比重最大，是引起苜蓿根部病害的主要致病菌[19]。苜蓿根腐病是苜蓿主要的根部病害，先后報(bào)道的病原菌種類(lèi)達(dá)28種，其中鐮刀菌13種[20]。在本研究中，從陜西省定邊縣牧草種植基地采集發(fā)病苜蓿，病株生長(zhǎng)緩慢，葉片枯萎變黃，病部表皮腐爛，根毛脫落，符合苜蓿根腐病發(fā)病癥狀；將病部病原菌分離、純化培養(yǎng)，得到病原菌單菌落，菌落氣生菌絲繁茂，色素棗紅色；在光學(xué)顯微鏡下觀察，大型分生孢子形態(tài)較為一致，鐮刀型，頂孢延長(zhǎng)成錐形，2～5橫隔，大小在3.5～5.9 μm×27.4～69.8 μm之間，符合鐮刀菌的形態(tài)特征，可初步判定分離得到的病原菌屬鐮刀菌屬。

由于同屬真菌形態(tài)差異不明顯，通過(guò)形態(tài)特征觀察難以進(jìn)行種級(jí)分類(lèi)鑒定，使用分子鑒定可以快速準(zhǔn)確地鑒定植物病原菌。在目前的植物病原菌鑒定報(bào)道中，使用rDNA-ITS序列進(jìn)行分子鑒定是最為普遍的，但rDNA的ITS序列進(jìn)化快速，被認(rèn)為缺乏保守性，在真菌分類(lèi)鑒定方面使用單一基因作為分子標(biāo)記具有一定的不可靠性。在本試驗(yàn)中，使用rDNA-ITS序列分析法構(gòu)建鐮刀菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，苜蓿根腐病ITS序列與銳頂鐮刀菌(Fusariumacuminatum)、 燕麥鐮刀菌(Fusariumavenaceum)、三線(xiàn)鐮刀菌(Fusariumtricinctum)在一個(gè)分支，且可信度(bootstrap)為68%，試驗(yàn)病原菌與鐮刀菌屬的這幾個(gè)近緣種在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上同在一個(gè)分支且無(wú)法再分，因此認(rèn)為單獨(dú)的根據(jù)ITS序列尚無(wú)法準(zhǔn)確判斷本研究中病原菌的種級(jí)分類(lèi)水平，需要用其他序列再次進(jìn)行分析。

翻譯延伸因子(translationelongation factor,TEF)基因常作為分子標(biāo)記對(duì)真菌進(jìn)行鑒定分類(lèi)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。其中EF-1α序列常用來(lái)鑒定鐮刀菌屬真菌，如Zhao等[21]采用EF-1α序列進(jìn)行進(jìn)化分析對(duì)九州鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、厚垣鐮刀菌等進(jìn)行鑒定。且EF-1α在物種鑒定方面有高分辨能力，較以往的ITS序列有較多的種間變異，適于作為系統(tǒng)進(jìn)化研究的遺傳標(biāo)記。因此本試驗(yàn)采用EF-1α序列分析法對(duì)苜蓿根腐病病原菌進(jìn)行鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明病原菌EF-1α序列與Fusariumacuminatum在同一分支，且可信度達(dá)99%，可認(rèn)定本試驗(yàn)研究的苜蓿根腐病病原菌屬于Fusariumacuminatum(銳頂鐮刀菌)種。同時(shí)接種試驗(yàn)表明分離得到的病原菌是本研究中苜蓿根腐病致病病原菌，且與已報(bào)道的關(guān)于銳頂鐮刀菌致病性試驗(yàn)結(jié)果相符[22]。

綜上，通過(guò)對(duì)紫花苜蓿根腐病病原菌的形態(tài)特征觀察、EF-1α序列分子鑒定、致病性試驗(yàn)，可以表明本試驗(yàn)所研究苜蓿根腐病病原菌為銳頂鐮刀菌(Fusariumacuminatum)。對(duì)比rDNA-ITS與EF-1α序列鑒定結(jié)果的不同，可以認(rèn)為不同的序列分析法對(duì)不同菌種有著不同的適用性，這可能與不同菌種序列進(jìn)化速度不同有關(guān)。因此在對(duì)某種病原菌進(jìn)行鑒定時(shí)，有必要用不同種序列構(gòu)建發(fā)育樹(shù)，才能得到相對(duì)可靠的結(jié)論。本文是首次關(guān)于陜西省苜蓿根部病害的報(bào)道，并且通過(guò)分子序列鑒定確定了病原真菌種類(lèi)，以期為生產(chǎn)中苜蓿根腐病的診斷及進(jìn)一步的防治提供理論依據(jù)。

References：

[1] Geng H Z, Wu Y F, Cao Z Z. Chinese Alfalfa[M]. Beijing: Chinese Agriculture Press, 1995: 114-130. 耿華珠, 吳永敷, 曹致中. 中國(guó)苜蓿[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1995: 114-130.

[2] Nan Z B. Establishing sustainable management system for disease of pasture crops in China. Acta Prataculturae Sinica, 2000, 9(2): 1-9. 南志標(biāo). 建立中國(guó)的牧草病害可持續(xù)管理體系. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2000, 9(2): 1-9.

[3] Cao L X, Zhao C H, Kong Q Q,etal. Advances in Alfalfa root rot pathogen and control research. Inner Mongolia Agriculture Science and Technology, 2006, (3): 36-37. 曹麗霞, 趙存虎, 孔慶全, 等. 紫花苜蓿根腐病病原及防治研究進(jìn)展. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技, 2006, 3: 36-37.

[4] Xue F X. Grassland Protection[M]. Beijing: Chinese Agriculture Press, 2009. 薛福祥. 草地保護(hù)學(xué)——牧草病理學(xué)分冊(cè)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2009.

[5] Wang X W, Wang C L, Zhou G,etal. Investigation and analysis on Lucerne diseases from Altay newly-established areas in northern Xinjiang. Journal of Xinjiang Agriculture University, 1996, 19(3): 40-44. 王雪薇, 王純利, 周剛, 等. 新疆阿勒泰新墾區(qū)苜蓿病害調(diào)查與分析. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1996, 19(3): 40-44.

[6] Meng Y, Li M Q. Research progress on alfalfa crown and root rot pathogen and their control. Pratacultural Science, 2005, 22(5): 89-92. 孟嫣, 李敏權(quán). 苜蓿根和根莖腐爛病病原及防治研究進(jìn)展. 草業(yè)科學(xué), 2005, 22(5): 89-92.

[7] Chen Y J, Cui G W. Survey and separation of alfalfa root rot pathogen in Heilongjiang Province. Grassland of China, 2001, 23(3): 78-79. 陳雅君, 崔國(guó)文. 黑龍江省紫花苜蓿根腐病調(diào)查及病原分離. 中國(guó)草地, 2001, 23(3): 78-79.

[8] Zhang B. Identification, Classification, and Phylogenetic Relationships of Pathogenic Fungi Based on Mitochondrial Cytochrome b Gene and Translation Elongation Factor Gene Analysis[D]. Jilin: Basic Medical College of Jilin University, 2007. 張波. 線(xiàn)粒體細(xì)胞色素b和翻譯延伸因子基因分析用于病原真菌的分離、鑒定和系統(tǒng)發(fā)生[D]. 吉林: 吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 2007.

[9] Kristensen R, Gauthier G, Berdal K G. DNA microarray to detect and identify trichothecene and moniliformin-producingFusariumspecies. Journal of Applied Microbiology, 2007, 102(4): 1060-1070.

[10] Yergeau E, Filion M, Vujanovic V. A PCR-denaturing gradient gel electrophoresis approach to assessFusariumdiversity in asparagus. Journal of Microbiological Methods, 2005, 60(12): 143-154.

[11] Fang Z D. The Method on Studies of Plant Pathology[M]. Beijing: Chinese Agriculture Press, 1998: 122-125. 方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1998: 122-125.

[12] Guo L D, Hyde K D, Liew E C Y. Identification of endophytic fungi fromLivistonachinensisbased on morphology and rDNA sequences. New Phytologist, 2000, 147: 617-630.

[13] O’Donnell K, Kistler H C, Cigelnik E,etal. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1998, 95(5): 2044-2049.

[14] Zhang Z Y, Leng H Q, Zhang Z M,etal. Plant Pathogenic Mycology[M]. Chengdu: Sichuan Science and Technology Press, 1988: 384-386. 張中義, 冷懷瓊, 張志銘, 等. 植物病原真菌學(xué)[M]. 成都: 四川科學(xué)技術(shù)出版社, 1988: 384-386

[15] Mahdi Dacari, Anne Dvan Diepeningen, Assadollah Babai-Ahari,etal. Rapid identification ofFusariumgramminespecies complex using Rolling Circle Amplification(RCA). Journal of Microbiological Methods, 2012, 89(1): 63-70.

[16] O’Donnell K, Humber R A, Geiser D M,etal. Phylogenetic diversity of insecticolous fusaria inferred from multilocus DNA sequence data and their molecular identification via FUSARIUM-ID andFusariumMLST. Mylologia, 2012, 104(2): 427-445.

[17] Stenglein S A, Rodriguero M S, Chandler E,etal. Phylogenetic relationships ofFusariumpoae based on EF-1 alpha and mtSSU sequences. Fungal Biology, 2010, 114(1):96-106.

[18] Grafenhan T, Patrick S K, Roscoe M,etal. Fusarium damage in cereal grains from Western Canada. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(23):5425-5437.

[19] Guo Y X, Nan Z B, Wang C Z,etal. Progress in research on root invading fungi ofMedicagosativa. Acta Prataculturae Sinica, 2009, 18(5): 243-249. 郭玉霞, 南志標(biāo), 王成章, 等. 苜蓿根部入侵真菌研究進(jìn)展. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 18(5): 243-249.

[20] Chen Y J, Liu X M, Cui G W,etal. Research progress in root rot of alfalfa. Grassland of China, 2000, (1): 51-56. 陳雅君, 劉學(xué)敏, 崔國(guó)文, 等. 紫花苜蓿根腐病的研究進(jìn)展. 中國(guó)草地, 2000, (1): 51-56.

[21] Zhao Z H, Lu G Z, Jiang Z D,etal. Identification ofFusariumkyushuense,F.sporotrichioidesandF.chlamydosporumusing EF-1α sequence data and morphological characteristics of conidia in aerial mycelium. Mycosystema, 2011, 30(5): 713-720.

[22] Li M Q. Comparative pathogenicity of isolates ofFusariumspp and cultivars resistance in alfalfa. Grassland of China, 2003, 25(1): 39-43. 李敏權(quán). 苜蓿根和根頸腐爛病病原致病性及品種抗病性研究. 中國(guó)草地, 2003, 25(1): 39-43.

Identification ofFusaruimacuminatumisolated fromMedicagosativaroot using the EF-1α sequence analysis method

YI Ming1, LIANG Jia-Jun1, SHI Jian2, LI Hong-Jian2, CHENG Ji-Min1, JIAO Feng1*

1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthWestAgricultureandForestryUniversity,Yangling712100,China； 2.AnimalHealthInspectionofXipoCountry,Binxian713500,China

Alfalfa root rot causes serious reductions in alfalfa growth and yield. To identify the species of pathogenic fungus causing root rot disease, the root rot pathogen ofMedicagosativa(alfalfa) collected from pasture in Dingbian County, Shaanxi Province, was analyzed by morphological observations, EF-1α sequence analysis, and inoculation tests. The mycelium and spores of a single colony of the pathogen growing on culture medium were observed under a microscope. Based on its morphology, the pathogen was identified as aFusariumfungus. The genomic DNA was extracted from the pathogen using the cetyl-trimethylammonium bromide method, and the translation elongation factor gene was selected for PCR amplification, gel recycling, purification, cloning, sequencing, and phylogenetic analyses. A phylogenetic tree constructed using MEGA and sequences available in Genbank showed that the pathogen had the closest relationship withFusariumacuminatum(99%). In the root inoculation test, the disease symptoms of roots inoculated with the isolated pathogen were the same as those characteristic of root rot disease ofM.sativain the field. Together, these results verified that the pathogen causing root rot disease ofM.sativain Shaanxi Province isF.acuminatum.

Medicagosativa; root rot; EF-1α;Fusariumacuminatum

10.11686/cyxb2016100

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-09；改回日期：2016-05-11

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201303157)和國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CRAS-35)資助。

易銘(1990-)，男，黑龍江牡丹江人，在讀碩士。E-mail: yiminggodlike@163.com

*通信作者Corresponding author. E-mail: fjiao@nwsuaf.edu.cn

易銘, 梁嘉俊, 史建, 李洪建, 程積民, 焦鋒. 采用EF-1α序列分析法對(duì)苜蓿根腐病病原菌——銳頂鐮刀菌的鑒定. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(2): 61-68.

YI Ming, LIANG Jia-Jun, SHI Jian, LI Hong-Jian, CHENG Ji-Min, JIAO Feng. Identification ofFusaruimacuminatumisolated fromMedicagosativaroot using the EF-1α sequence analysis method. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(2): 61-68.