趙士萍嚴(yán)淑紅蔣琦暉常肖肖王 炳方洛云蔣林樹?熊本海

（1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，北京 100193）

茶皂素對(duì)奶牛瘤胃原蟲區(qū)系的影響

趙士萍1嚴(yán)淑紅1蔣琦暉1常肖肖1王 炳1方洛云1蔣林樹1?熊本海2?

（1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，北京 100193）

本研究旨在研究茶皂素對(duì)奶牛瘤胃原蟲區(qū)系的影響。選取12頭健康荷斯坦奶牛［體重（550±30）kg，產(chǎn)奶量35 kg/（頭·d），胎次2～4］，隨機(jī)分為4組，每組3頭，均飼喂基礎(chǔ)飼糧，分別于晨飼前灌服0（對(duì)照）、20、30、40 g/（頭·d）的茶皂素。試驗(yàn)期49 d，其中預(yù)試期14 d，正試期35 d，正試期內(nèi)每7 d于晨飼前1 h用口腔采樣器采集瘤胃液。采用聚丙烯酰氨凝膠電泳（DGGE）結(jié)合18S rDNA序列分析技術(shù)研究瘤胃原蟲區(qū)系的變化。結(jié)果表明：1）添加茶皂素可以選擇性地抑制瘤胃中原蟲的生長(zhǎng)。2）與對(duì)照組相比，30、40 g/（頭·d）茶皂素組的豐富度指數(shù)和香農(nóng)多樣性指數(shù)都顯著降低（P＜0.05），優(yōu)勢(shì)度指數(shù)顯著增加（P＜0.05），但是均一性指數(shù)無顯著變化（P＞0.05）；茶皂素顯著減少了瘤胃中前庭亞綱內(nèi)毛目的原蟲數(shù)量。綜上所述，飼糧中添加30、40 g/（頭·d）茶皂素均可抑制奶牛瘤胃原蟲的生長(zhǎng)，并且降低瘤胃原蟲的多樣性。

奶牛；原蟲區(qū)系；茶皂素

反芻動(dòng)物瘤胃中含有大量的原蟲，原蟲在反芻動(dòng)物的發(fā)酵過程中具有重要的作用。原蟲通過將淀粉與可溶性糖同化，以聚糊精的形式儲(chǔ)存起來，從而降低瘤胃中纖維素的含量，達(dá)到穩(wěn)定pH的作用［1］。同時(shí)原蟲還能抑制氫氣和氨態(tài)氮的產(chǎn)生。因此，選擇科學(xué)、有效的飼料添加劑改變瘤胃原蟲區(qū)系進(jìn)而調(diào)控瘤胃發(fā)酵是提高奶牛飼料轉(zhuǎn)化率，改善乳品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)。

茶皂素，又稱茶皂苷，是一種從茶樹種子（茶籽、茶葉籽）中提取的五環(huán)三萜類糖甙化合物，由7種配基、4種糖體和2種有機(jī)羧酸組成［1］。茶皂素既是天然的表面活性劑，也是天然的反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑，有研究表明，茶皂素可以改善反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能［2］。 王洪榮等［3］研究報(bào)道，在山羊飼糧中添加茶皂素和絲蘭皂苷混合物可降低瘤胃液原蟲數(shù)量、pH及乙酸/丙酸。Zhou［4］研究表明，反芻動(dòng)物飼糧中添加茶皂素，對(duì)瘤胃中總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）產(chǎn)量沒有顯著變化，但是可顯著降低甲烷產(chǎn)量。來海良等［5］研究報(bào)道，在奶牛飼糧中添加茶皂素可降低原蟲的存活率。Hu等［6］通過體外試驗(yàn)表明，在30 mL發(fā)酵液中添加8 mg茶皂素，瘤胃中原蟲數(shù)量減少了79%。嚴(yán)淑紅等［7］發(fā)現(xiàn)添加20、30、40 g/（頭·d）茶皂素組與對(duì)照組相比均顯著降低了瘤胃中原蟲數(shù)量，并且隨著茶皂素添加水平的增加，瘤胃中原蟲數(shù)量呈線性和二次降低。目前對(duì)茶皂素抑制原蟲增殖的報(bào)道較多［8-9］，但是對(duì)其所抑制原蟲的種類報(bào)道較少，本文將通過聚丙烯酰氨凝膠電泳（DGGE）技術(shù)結(jié)合18S rDNA序列分析研究茶皂素對(duì)奶牛瘤胃原蟲區(qū)系的影響，揭示茶皂素在瘤胃發(fā)酵中作用機(jī)制，為茶皂素在奶牛養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

茶皂素購自浙江東方茶葉有限公司常山分公司，主要活性成分為五環(huán)三萜皂甙，其皂甙含量為60.2%，其他成分含量如下：粗蛋白質(zhì)5.5%，粗纖維26.2%，水分4.1%、粗灰分4.0%，pH為5.0～6.5。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與管理

本研究于2014年8月至2014年9月在北京三元綠荷奶牛養(yǎng)殖中心南口二分場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)選取12頭健康荷斯坦奶牛［體重（550±30）kg，產(chǎn)奶量35 kg/（頭·d），胎次2～4］，按產(chǎn)奶量、胎次、泌乳期等相近原則隨機(jī)分為4組，每組3頭。試驗(yàn)期間，基礎(chǔ)飼糧參考牛場(chǎng)的全混合日糧（TMR）飼喂方案，日飼喂和擠奶各 3次（07：30、14：30、21：30），自由運(yùn)動(dòng)和飲水?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平表見表1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

各組均飼喂基礎(chǔ)飼糧。由于茶皂素適口性差，試驗(yàn)牛不能固定采食，因此選擇每天晨飼前口腔灌服茶皂素。預(yù)先將20、30、40 g茶皂素分別溶于200 mL水中。各組分別于晨飼前通過口腔灌服0（對(duì)照）、20、30、40 g/（頭·d）茶皂素。整個(gè)試驗(yàn)期共49 d，其中預(yù)試期14 d，正試期35 d，每天記錄產(chǎn)奶量，正試期內(nèi)每7 d采集奶樣并于晨飼前1 h采集瘤胃液。

1.4 樣品采集和測(cè)定

1.4.1 乳樣采集和測(cè)定

正試期內(nèi)每7 d采集奶樣，按4∶3∶3將早、中、晚采集的乳樣混勻，送至北京三元奶牛中心，采用LACTOSCAN型全自動(dòng)超聲波乳成分分析儀測(cè)定乳成分。

1.4.2 瘤胃液的采集

正試期內(nèi)每7 d晨飼前1 h用口腔采樣器采集瘤胃液，過4層紗布過濾后將瘤胃液存入液氮中用于瘤胃發(fā)酵指標(biāo)及瘤胃原蟲區(qū)系的測(cè)定。

1.4.3 瘤胃微生物總DNA的提取

采用珠磨-十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取瘤胃微生物總DNA［9］，取1.5 mL瘤胃液1 000×g離心棄上清液，加入800 μL CTAB和滅菌鋯珠（0.3 g 0.1 mm和0.1 g 0.5 mm）后置于珠磨儀上破碎2 min，70℃水浴20 min后13 000×g離心10 min，取500 μL上清液與500 μL飽和酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）混合后 13 000×g離心10 min，取300 μL上清液與280 μL異丙醇混勻后室溫靜置5 min沉淀DNA，離心后用TE緩沖液溶解DNA，用微量紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定提取的總DNA濃度和純度，-20℃保存。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet（DM basis） %

1.4.4 瘤胃原蟲PCR

以瘤胃微生物總DNA為模板，利用一對(duì)原蟲通用引物GC-1617R（帶GC夾子）和1320F擴(kuò)增原蟲。引物GC-1617R序列為：5＇-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCCCCGCCCGGG GCCAATTGCAAAGATCTATCC-3＇（灰底標(biāo)注為GC夾子）和引物1320F序列為：5＇-GGTGGTGCATGGCCG-3＇［10］。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括25 μL Premix TaqTM（Ex TaqTMVersion 2.0），GC-1617R、1320F各1 μL，模板 DNA 1 μL，滅菌雙蒸水 22 μL。PCR程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性 30 s，62℃退火30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸5 min［11］。用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR產(chǎn)物。

1.4.5 瘤胃原蟲的DGGE

對(duì)瘤胃原蟲 PCR產(chǎn)物進(jìn)行 DGGE分析。DGGE使用8%的丙烯酰胺凝膠，變性梯度（甲酰胺和尿素）為30%～50%；電泳條件為80 V 15 h。電泳結(jié)束后，進(jìn)行GelGreen染色，用凝膠成像儀觀察并拍照。

1.4.6 DNA回收及克隆測(cè)序

從DGGE圖譜中選擇特異條帶切膠后采用煮沸法回收 DNA［12］。利用不帶 GC夾子的引物1617R和 1320F進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA試劑盒純化后，插入PMD-18T載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌（E.coli）JM109。挑取陽性克隆經(jīng)生工生物工程（北京）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所得結(jié)果與GenBank中KGHL、KI和RDP數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行比對(duì)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用Quantity One軟件分析DGGE圖譜，采用非加權(quán)算術(shù)平均法（unweighted pair group method with averaging alogorithm，UPGMA）進(jìn)行聚類分析。多樣性指數(shù)計(jì)算公式如下：

式中：H為香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）；ni為條帶i的峰密度值，n為泳道中所有條帶的峰密度值之和；R為豐富度指數(shù)（richness index）；S為總條帶數(shù)；E為均一性指數(shù)（evenness index）；C為優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（dominance index）。

使用MEGE 5.10軟件制作序列系統(tǒng)發(fā)育樹，用Excel軟件整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用SPSS 17.0軟件的one-way ANOVE程序進(jìn)行單因素方差分析，使用Duncan氏法進(jìn)行平均值的多重比較，P＜0.05為差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 茶皂素對(duì)奶牛產(chǎn)奶量和乳成分的影響

由表2可見，20、30 g/（頭·d）茶皂素組與對(duì)照組相比，產(chǎn)奶量和乳脂校正乳產(chǎn)量均沒有顯著差異（P＞0.05）；40 g/（頭·d）茶皂素組與對(duì)照組相比，顯著降低了產(chǎn)奶量和乳脂校正乳產(chǎn)量（P＜0.05）；隨著茶皂素添加水平的增加，產(chǎn)奶量和乳脂校正乳產(chǎn)量呈二次變化，即呈先增加后減少的趨勢(shì)，其中30 g/（頭·d）茶皂素組與對(duì)照組相比，產(chǎn)奶量和乳脂校正乳產(chǎn)量分別提高了4.47%和9.63%。20、30、40 g/（頭·d）茶皂素組與對(duì)照組相比，乳蛋白率、乳脂率、乳尿素氮含量和乳體細(xì)胞數(shù)均沒有顯著變化（P＞0.05）；隨著茶皂素添加水平的增加乳脂率呈線性增加（P＝0.041）、乳體細(xì)胞數(shù)呈線性降低（P＝0.045）；與對(duì)照組相比，20、30、40 g/（頭·d）茶皂素組的乳脂率分別升高了2.69%、9.43%、12.46%，乳尿素氮含量分別降低了10.65%、5.35%、2.41%，30 g/（頭·d）茶皂素組的 乳 體 細(xì) 胞 數(shù) 降 低 了 7.99%；20、30、40 g/（頭·d）茶皂素組與對(duì)照組相比乳糖率均顯著降低（P＞0.05），且隨著添加水平的增加，降低程度加大。

2.2 茶皂素對(duì)奶牛瘤胃原蟲區(qū)系的影響

2.2.1 瘤胃原蟲18S rDNA擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物電泳圖譜

奶牛瘤胃原蟲18S rDNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后所得的電泳圖譜如圖1所示。由圖可見，擴(kuò)增條帶唯一，大小在290 bp左右，與引物設(shè)計(jì)片段大小一致。

表2 茶皂素對(duì)奶牛產(chǎn)奶量和乳成分的影響Table 2 Effects of tea saponin on milk yield and milk composition of dairy cows

圖1 瘤胃原蟲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis figure of PCR amplification products of rumen protozoa

2.2.2 瘤胃原蟲DGGE圖譜

奶牛瘤胃原蟲區(qū)系18S rDNA的DGGE圖譜如圖2所示。由圖可見，20、30、40 g/（頭·d）茶皂素組的條帶數(shù)均少于對(duì)照組。在DGGE圖譜上從上至下將優(yōu)勢(shì)條帶編號(hào)（1～11），部分優(yōu)勢(shì)條帶在20、30、40 g/（頭·d）茶皂素組豐度減弱或者消失。從瘤胃原蟲DGGE圖譜中顯示原有部分優(yōu)勢(shì)條帶變?nèi)趸蛳Вf明添加茶皂素可以選擇性地抑制瘤胃中原蟲的生長(zhǎng)。

2.2.3 對(duì)奶牛瘤胃原蟲多樣性指數(shù)的影響

根據(jù)瘤胃原蟲DGGE圖譜分析所得的結(jié)果進(jìn)一步分析香農(nóng)多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)、均一性指數(shù)、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)，結(jié)果如表3所示。由表可見，30、40 g/（頭·d）茶皂素組的豐富度指數(shù)和香農(nóng)多樣性指數(shù)都顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；20 g/（頭·d）茶皂素組的豐富度指數(shù)和香農(nóng)多樣性指數(shù)都低于對(duì)照組，但未達(dá)到顯著差異（P＞0.05）；隨著茶皂素添加水平的增加，香農(nóng)指數(shù)（P＝0.003）和豐富度指數(shù)（P＝0.012）均呈線性降低，豐富度指數(shù)同時(shí)呈二次降低（P＝0.016）；30、40 g/（頭·d）茶皂素組的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），20 g/（頭·d）茶皂素組的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)低于對(duì)照組，但未達(dá)到顯著差異（P＞0.05）；隨著茶皂素添加水平的增加，優(yōu)勢(shì)度指數(shù)呈線性增加（P＝0.042）；20、30、40 g/（頭·d）茶皂素組的均一性指數(shù)與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 瘤胃原蟲DGGE圖譜Fig.2 DGGE electrophoresis figure of rumen protozoa

表3 茶皂素對(duì)奶牛瘤胃原蟲多樣性指數(shù)的影響Table 3 Effects of tea saponin on rumen protozoa diversity indexes of dairy cows

2.2.4 瘤胃原蟲相似性指數(shù)

奶牛瘤胃原蟲DGGE圖譜的相似性指數(shù)如圖3所示。由圖可見，不同添加水平茶皂素組的瘤胃原蟲區(qū)系的相似性指數(shù)在0.28～0.89，個(gè)體間差異相對(duì)較大。

2.2.5 瘤胃原蟲DNA序列比較及進(jìn)化樹分析

從奶牛瘤胃原蟲DGGE電泳中割膠回收的1～11號(hào)條帶經(jīng)連接、克隆和測(cè)序后，所獲得18S rDNA序列進(jìn)行Blast比對(duì)所得結(jié)果如表4所示。由表可見，經(jīng)測(cè)序后所得的序列提交GenBank收錄，所得登錄號(hào)為 KU355836～KU355846。使用MEGA 5.10軟件將已知原蟲序列和克隆的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖4所示。由序列比對(duì)結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可以看出，飼糧中添加茶皂素主要影響前庭亞綱內(nèi)毛目的原蟲。

3 討 論

嚴(yán)淑紅等［7］研究表明，添加不同水平的茶皂素顯著降低了瘤胃液pH、氨態(tài)氮的濃度，但均未超過正常范圍值，且顯著提高了微生物蛋白、丙酸和丁酸濃度，但對(duì) T VFA和乙酸濃度的影響不顯著。

圖3 瘤胃原蟲區(qū)系相似性指數(shù)Fig.3 Similarity index of rumen protozoa flora

表4 茶皂素對(duì)瘤胃原蟲DGGE差異條帶序列比對(duì)結(jié)果Table 4 Effcets of tea saponin on rumen protozoa DGGE differential band sequence alignment results

本研究運(yùn)用DGGE技術(shù)結(jié)合18S rDNA序列分析技術(shù)研究添加茶皂素后奶牛瘤胃原蟲的多樣性和組成結(jié)構(gòu)的變化。運(yùn)用DGGE結(jié)合18S rDNA序列分析技術(shù)主要是因?yàn)镈GGE存在一定的局限性，但是如果能夠與基因克隆、序列分析等方法有效結(jié)合則可以獲取更完整的信息。有研究表明，添加茶皂素能夠降低瘤胃內(nèi)原蟲的數(shù)量［13-15］。本研究結(jié)果表明，添加茶皂素可以選擇性地抑制瘤胃中部分原蟲的生長(zhǎng)，由序列對(duì)比可知，茶皂素主要影響的是前庭亞綱內(nèi)毛目原蟲，可能因?yàn)镈GGE只能檢測(cè)優(yōu)勢(shì)原蟲，所以有很多原蟲都沒有在圖譜中表示出來。進(jìn)一步分析奶牛瘤胃原蟲多樣性指數(shù)，發(fā)現(xiàn)茶皂素對(duì)其影響顯著，說明茶皂素不僅對(duì)瘤胃原蟲數(shù)量有影響，而且也影響原蟲區(qū)系的多樣性，這可能是因?yàn)椴柙硭赜绊懥肆鑫讣?xì)菌的多樣性，而細(xì)菌和原蟲又存在互作作用［16］，最終影響了瘤胃原蟲的多樣性。Wallace等［14］研究表明，茶皂素可以通過與瘤胃原蟲表面的膽固醇復(fù)合，來殺死瘤胃原蟲，所以可能是因?yàn)榱鑫冈x表面膽固醇的組成成分不一樣，導(dǎo)致茶皂素只能與部分原蟲結(jié)合，最終改變了瘤胃原蟲的多樣性。該結(jié)果與很多學(xué)者的研究結(jié)果相似，如陳旭偉［17］研究表明，體外瘤胃發(fā)酵中添加不同水平的茶皂素能夠抑制瘤胃原蟲的生長(zhǎng)，并且原蟲的種屬比例也發(fā)生相應(yīng)變化，其中雙毛蟲的比例上升而內(nèi)毛蟲的比例下降，添加0.6%的茶皂素與對(duì)照組相比差異極顯著；與周奕毅［18］的研究結(jié)果也相似。

圖4 瘤胃原蟲區(qū)系相似性指數(shù)Fig.4 Similarity index of rumen protozoa flora

4 結(jié) 論

飼糧中添加30、40 g/（頭·d）茶皂素均可抑制奶牛瘤胃原蟲的生長(zhǎng)，并且降低瘤胃原蟲的多樣性。

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Effects of Tea Saponin on Rumen Protozoa Flora of Dairy Cows

ZHAO Shiping1YAN Shuhong1JIANG Qihui1CHANG Xiaoxiao1WANG Bing FANG Luoyun1JIANG Linshu1?XIONG Benhai2?
（1.Key Laboratory for Dairy Cow Nutrition of Beijing，College of Animal Science and Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing102206，China；2.Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，China）

The objective of this study was to research the effects of tea saponin on rumen protozoa flora of dairy cows.Twelve healthy Holstein dairy cows［body weight was（550±30） kg； milk yield was 35 kg/（head·d）；2 to 4 parities］were randomly allocated to one of four groups with 3 cows per group.Tea saponin［0（control），20，30 and 40 g/（head·d）］was perfused to cows before morning feeding.The experiment lasted for 49 d with 14 d of adaptation period and 35 d of formal test period.Rumen fluid was collected by mouth sampler at 1 h before morning feeding every 7 d during formal test period.Denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）combined with 18S rDNA sequence analysis technique was used for rumen protozoa flora analysis.The results showed as follows：1）tea saponin could selectively inhibit protozoa growth.2）Compared with control group，richness index and Shannon index in 30 and 40 g/（head·d）tea saponin groups were significantly reduced（P＜0.05），and dominance index was significantly increased（P＜0.05），but evenness index was not significantly different among groups（P＞0.05）；tea saponin could significantly reduce rumen Vestibuliferia Entodiniomorphida protozoa number.In conclusion，dietary supplementation of 30 and 40 g/（head·d）tea saponin can inhibit protozoa growth in rumen of dairy cows，and reduce the diversity of rumen protozoa.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2017，29（2）：620-627］

dairy cow；protozoa flora；tea saponin

S816.7；S823

A

1006-267X（2017）02-0620-08

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.02.031

（責(zé)任編輯 王智航）

2016-08-01

“十二五”國家科技支撐項(xiàng)目（25012BAD14B09）；“十三五”國家重大科技專項(xiàng)（2016YFDO70020，2016YFDO700205）；北京市農(nóng)業(yè)局北京市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系奶牛創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)

趙士萍（1990—），女，云南騰沖人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉雌c動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。E-mail：1243830639＠qq.com

?通信作者：蔣林樹，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：kjxnb＠vip.sina.com；熊本海，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：xiongbenhai＠caas.cn

?Corresponding authors：JIANG Linshu，professor，E-mail：kjxnb＠vip.sina.com；XIONG Benhai，professor，E-mail：xiongbenhai＠caas.cn