陳 亮任 傲?李 斌周傳社譚支良

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，長沙 410125；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩 850000；4.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410128）

植物乳桿菌對玉米秸稈和水稻秸稈體外發(fā)酵特性的影響

陳 亮1，2任 傲1，2?李 斌3周傳社2，4??譚支良2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，長沙 410125；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩 850000；4.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410128）

本試驗(yàn)旨在探討植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）對玉米秸稈和水稻秸稈奶牛瘤胃體外發(fā)酵特性的影響。采用單因子隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別以玉米秸稈和水稻秸稈為發(fā)酵底物，分析不同添加水平［0（對照）、0.25×107、0.50×107和0.75×107CFU/mL］植物乳桿菌對發(fā)酵底物體外發(fā)酵產(chǎn)氣量（1、2、4、6、12、24、36、48 h）、產(chǎn)氣參數(shù)、干物質(zhì)降解率（DMD）、中性洗滌纖維降解率（NDFD）、發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸（VFA）、氨態(tài)氮（NH3-N）濃度及pH的影響。結(jié)果表明：添加植物乳桿菌能顯著提高玉米秸稈發(fā)酵初期產(chǎn)氣速率和產(chǎn)氣量（1～24 h）（P＜0.05），以添加0.75×107CFU/mL效果最為理想；添加植物乳桿菌能顯著提高水稻秸稈體外發(fā)酵后期（36～48 h）產(chǎn)氣量（P＜0.05），而以添加0.25×107CFU/mL效果最為理想。隨著植物乳桿菌添加水平的增加，2種底物體外發(fā)酵液NH3-N濃度均呈現(xiàn)顯著的線性增加效應(yīng)（P＜0.05）。不同植物乳桿菌添加水平對2種底物體外發(fā)酵NDFD、DMD、發(fā)酵液VFA（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸和戊酸）濃度以及pH均無顯著影響（P＞0.05）。由試驗(yàn)結(jié)果推斷，添加植物乳桿菌能促進(jìn)玉米秸稈和水稻秸稈體外發(fā)酵及其氮代謝，同時(shí)對維持pH的穩(wěn)定平衡具有積極作用，最佳添加水平分別為0.75×107和0.25×107CFU/mL。

植物乳桿菌；體外發(fā)酵；瘤胃；奶牛；玉米秸稈；水稻秸稈

隨著人們對畜牧產(chǎn)品安全和環(huán)境保護(hù)意識(shí)的不斷加強(qiáng)，微生態(tài)制劑作為一種綠色、安全、高效的飼料添加劑倍受關(guān)注，越來越多地應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中。目前，微生態(tài)制劑研究較多的菌種大致分為乳酸菌類、真菌及酵母菌類、芽孢桿菌類、光合細(xì)菌類［1］，在反芻動(dòng)物營養(yǎng)與飼料中，應(yīng)用較廣泛的是乳酸菌、酵母菌以及芽孢桿菌［2］，而乳酸菌更多地被用于青貯飼料的發(fā)酵［3-5］。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）作為乳酸菌的一種，目前普遍應(yīng)用于對青貯飼料的發(fā)酵。Contreras-Govea等［6-7］利用植物乳桿菌對苜蓿和玉米植株進(jìn)行青貯發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能顯著促進(jìn)青貯飼料中微生物生長；利用植物乳桿菌對青貯玉米進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明，植物乳桿菌能促進(jìn)發(fā)酵的進(jìn)行和青貯玉米飼料的有氧穩(wěn)定性［8-9］，但也有學(xué)者研究報(bào)道植物乳桿菌對青貯玉米飼料發(fā)酵的有氧穩(wěn)定性沒有顯著影響［10-11］。

目前，玉米秸稈和水稻秸稈是我國主要農(nóng)業(yè)作物秸稈，在我國每年的作物秸稈總產(chǎn)量中占很大比例，而秸稈養(yǎng)畜對提高秸稈利用率具有重要意義。與牧草相比，玉米秸稈和水稻秸稈品質(zhì)較低，秸稈飼料加工成為提高秸稈飼喂價(jià)值的重要手段，國內(nèi)外專家對各種添加劑在秸稈養(yǎng)畜中的作用進(jìn)行了大量研究，而對添加植物乳桿菌是否能提高玉米秸稈和水稻秸稈體外瘤胃發(fā)酵特性鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)利用體外發(fā)酵實(shí)時(shí)監(jiān)測技術(shù)，以植物乳桿菌為試驗(yàn)菌株，以玉米秸稈和水稻秸稈為發(fā)酵底物，研究其對奶牛瘤胃體外發(fā)酵特性的影響，為進(jìn)一步研究其在奶牛生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

植物乳桿菌，經(jīng)真空冷凍干燥保存于安瓿管，購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，菌種號(hào)：22696。

1.1.2 MRS培養(yǎng)基

酪蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖5.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸二銨2.0 g、Tween 80 1.0 g、K2HPO42.0 g、MgSO4· 7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、CaCO320.0 g、瓊脂15.0 g，用蒸餾水溶解定容至1.0 L，調(diào)整pH為6.8。

1.1.3 緩沖液

按照 Menke等［12］的方法配制瘤胃體外發(fā)酵厭氧緩沖液。

1.1.4 發(fā)酵底物

本試驗(yàn)采用玉米秸稈（湖南長沙科湘甜玉1號(hào)）與水稻秸稈（湖南瀏陽湘125s）作為發(fā)酵底物。2種秸稈經(jīng)65℃烘干24 h，粉碎過1 mm孔徑篩后備用。底物粗纖維含量按照 GB/T 18868—2002方法測定；依照Hall等［13］的方法，使用Fibretherm FT12全自動(dòng)纖維儀（Gerhardt Analytical Systems，德國）測定中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量；按照楊勝［14］確定的常規(guī)方法測定干物質(zhì)（DM）、有機(jī)物（OM）、粗蛋白質(zhì)（CP）、中性洗滌可溶物（NDS）含量。玉米秸稈和水稻秸稈主要營養(yǎng)成分含量見表1。

表1 玉米秸稈和水稻秸稈主要營養(yǎng)成分含量（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Main nutrient composition contents of maize stover and rice straw（DM basis）［15］ %

1.1.5 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

本試驗(yàn)供體奶牛為健康狀況良好、體重［（500±50）kg］相近的3頭裝有永久瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛（Holstein cow），試驗(yàn)?zāi)膛Ｓ珊鲜￠L沙市望城縣白若鋪鎮(zhèn)勝和奶牛養(yǎng)殖基地提供。試驗(yàn)期間，奶牛飼糧參照NRC（2001）標(biāo)準(zhǔn)配制。基礎(chǔ)飼糧由粗料（水稻秸稈）和精料組成，飼糧精粗比為60∶40?；A(chǔ)飼糧營養(yǎng)成分水平測定方法與底物相同；利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）法測定鈣（Ca）、磷（P）含量［16］?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采取單因子隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）設(shè)置4個(gè)添加水平［0（對照）、0.25×107、0.50×107、0.75×107CFU/mL］，每個(gè)添加水平設(shè)置12、24、48 h 3個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)樣品重復(fù)。

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet（DM basis）［15］ %

1.2.2 菌株培養(yǎng)

將保存有菌株的安瓿管管口一端于酒精燈火焰上灼燒，然后滴1～2滴無菌水，輕輕敲打使其管口破碎，向安瓿管中加入0.5～1.0 mL已滅菌無瓊脂液體MRS培養(yǎng)基，使固體菌株完全溶解后，利用無菌1 mL注射器轉(zhuǎn)入到裝有20 mL液體MRS培養(yǎng)基的50 mL錐形瓶中，37℃靜止培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，至第4代時(shí)，對其進(jìn)行平板涂布計(jì)數(shù)。試驗(yàn)所需菌株濃度為1× 107CFU/mL時(shí)，培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至4℃冰箱保存待用。菌株活化、傳代以及平板計(jì)數(shù)過程均在無菌條件下進(jìn)行。

1.2.3 體外發(fā)酵液配制

于晨飼前采集3頭瘺管牛瘤胃食糜，用8層紗布過濾，濾液等體積混合后裝入事先充滿CO2并預(yù)熱到39.5℃的保溫瓶中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，與事先在39.5℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱的厭氧緩沖液混合（緩沖液∶瘤胃液＝9∶1，體積比），并持續(xù)通入CO2。

1.2.4 體外培養(yǎng)

本試驗(yàn)中所用培養(yǎng)設(shè)備為自主研發(fā)體外發(fā)酵設(shè)備，由恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱（6×6格）、電腦主機(jī)、顯示器等硬件設(shè)備組成。其中恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱每格為1個(gè)單元，體外發(fā)酵時(shí)，放置1個(gè)發(fā)酵瓶；每格均對應(yīng)1個(gè)空氣壓力傳感器與發(fā)酵瓶相連，空氣壓力傳感器與電腦主機(jī)相連，實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵瓶內(nèi)氣壓變化。稱?。?.500 0±0.000 3）g發(fā)酵底物于發(fā)酵瓶中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別向發(fā)酵瓶中加入0、0.25、0.50、0.75 mL菌液。將上述準(zhǔn)備好的發(fā)酵瓶置于39.5℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)熱，向發(fā)酵瓶中通入CO2，隨后加入 5 0 mL發(fā)酵液，并持續(xù)通入CO2，立即加上瓶塞瓶蓋，并使用針頭放氣，使內(nèi)外壓強(qiáng)保持一致，然后迅速放回恒溫培養(yǎng)箱，39.5℃恒溫培養(yǎng)48 h。

1.2.5 體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量測定

分別于體外發(fā)酵中的 1 、2、4、6、12、24、36、48 h使用壓力傳感器（CYG130-12，昆山雙橋傳感器測控技術(shù)有限公司）測定發(fā)酵瓶內(nèi)的氣壓，并按公式y(tǒng)＝1.506x將氣壓換算成為室溫標(biāo)準(zhǔn)氣壓下的氣體體積。其中1.506為實(shí)測壓強(qiáng)與體積之間的換算系數(shù)，x為實(shí)測壓強(qiáng)，y為產(chǎn)氣量。

利用Wang等［18］提出的LE模型對累積產(chǎn)氣量數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合：

式中：V為t時(shí)間點(diǎn)底物的產(chǎn)氣量（mL）；Vf為理論最大產(chǎn)氣量（mL）；k為產(chǎn)氣分率（%/h）；b和d為曲線的形狀指標(biāo)，b＞0表示曲線為 S 形，b＜0則表示曲線非S形。下式同。

利用下列公式計(jì)算發(fā)酵初期產(chǎn)氣速率（FRD0）（＜12 h）；

利用下列公式計(jì)算達(dá)1/2理論最大產(chǎn)氣量的時(shí)間（t0.5）［19］。

1.2.6 體外發(fā)酵干物質(zhì)降解率（DMD）、中性洗滌纖維降解率（NDFD）及發(fā)酵液氨態(tài)氮（NH3-N）和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度、pH測定

分別于體外發(fā)酵12、24、48 h時(shí)取出發(fā)酵瓶，發(fā)酵液經(jīng)400目尼龍布過濾，利用 pH計(jì)（REX PHS-3C，上海儀器設(shè)備廠）立即測定濾液pH；隨后將濾液分裝到離心管中，用于NH3-N、VFA濃度測定。按照馮宗慈等［20］改進(jìn)的比色法測定NH3-N濃度；按照Vanzant等［21］提供的方法測定VFA濃度。將過濾后的殘?jiān)哭D(zhuǎn)移至石英坩堝中并用熱蒸餾水反復(fù)沖洗，置于105℃烘箱中烘干8 h以測定剩余干物質(zhì)含量，并計(jì)算其 DMD；測定過DMD后的殘?jiān)厥沼脴悠反芊獗４妫糜贜DFD的測定［13］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 8.2的MIXED過程統(tǒng)計(jì)，不同添加水平間的差異采用contrast語句進(jìn)行比較。統(tǒng)計(jì)差異顯著性定義為P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 植物乳桿菌不同添加水平對體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

植物乳桿菌不同添加水平對玉米秸稈體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響如表3所示。當(dāng)以玉米秸稈為發(fā)酵底物時(shí)，發(fā)酵前期（1、2和 4 h）添加 0.75× 107CFU/mL植物乳桿菌體外發(fā)酵產(chǎn)氣量均顯著高于對照組、0.25×107和0.50×107CFU/mL添加組（P＜0.05），而后 3組之間差異不顯著（P＞0.05）；發(fā)酵6 h時(shí)，添加0.75×107CFU/mL植物乳桿菌體外發(fā)酵產(chǎn)氣量顯著高于 0.50× 107CFU/mL添加組（P＜0.05），而與對照組和0.25×107CFU/mL添加組沒有顯著差異（P＞0.05）；發(fā)酵12 h時(shí)，添加0.75×107CFU/mL植物乳桿菌體外發(fā)酵產(chǎn)氣量均顯著高于對照組、0.25× 107和0.50×107CFU/mL添加組（P＜0.05），且0.50×107CFU/mL添加組亦顯著高于對照組和0.25×107CFU/mL添加組（P＜0.05），而后2組之間差異不顯著（P＞0.05）；在發(fā)酵 24 h時(shí)，添加0.75×107和0.50×107CFU/mL植物乳桿菌體外發(fā)酵產(chǎn)氣量均顯著高于對照組和 0.25× 107CFU/mL添加組（P＜0.05），而 0.75×107和0.50×107CFU/mL添加組之間、對照組和0.25× 107CFU/mL添加組之間均沒有顯著差異（P＞0.05）；而在發(fā)酵36和48 h時(shí)，各組之間體外發(fā)酵產(chǎn)氣量均無顯著差異（P＞0.05）。由此可知，在以玉米秸稈為底物的體外發(fā)酵過程中，添加植物乳桿菌能顯著促進(jìn)體外發(fā)酵前期的進(jìn)行，同時(shí)以植物乳桿菌添加量為0.75×107CFU/mL時(shí)，效果最強(qiáng)。

當(dāng)以水稻秸稈為發(fā)酵底物時(shí)，在發(fā)酵1 h時(shí)，對照組體外發(fā)酵產(chǎn)氣量均顯著高于其他3組（P＜0.05），且添加0.25×107CFU/mL植物乳桿菌時(shí)，顯著高于0.75×107CFU/mL添加組（P＜0.05），而與0.50×107CFU/mL添加組沒有顯著差異（P＞0.05）。這可能由于植物乳桿菌在發(fā)酵剛開始存在一定適應(yīng)性，一定程度上抑制了發(fā)酵初期的正常進(jìn)行。在發(fā)酵 36和 48 h時(shí)，添加 0.25× 107CFU/mL植物乳桿菌時(shí)體外發(fā)酵產(chǎn)氣量均顯著高于對照組和0.75×107CFU/mL添加組（P＜0.05），而與0.50×107CFU/mL添加組沒有顯著差異（P＞0.05）；且對照組、0.50×107和 0.75× 107CFU/mL添加組之間體外發(fā)酵產(chǎn)氣量差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 植物乳桿菌不同添加水平對體外發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)的影響

植物乳桿菌不同添加水平對玉米秸稈體外發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)的影響如表4所示。玉米秸稈理論最大產(chǎn)氣量、發(fā)酵初期產(chǎn)氣速率和達(dá)1/2理論最大產(chǎn)氣量的時(shí)間各添加水平的平均值均顯著高于水稻秸稈（P＜0.05）。

當(dāng)以玉米秸稈為底物時(shí)，添加 0.75× 107CFU/mL植物乳桿菌發(fā)酵初期產(chǎn)氣速率顯著高于對照組、0.25×107和0.50×107CFU/mL添加組（P＜0.05），且0.50×107CFU/mL添加組發(fā)酵初期產(chǎn)氣速率亦顯著高于對照組（P＜0.05），而與0.25×107CFU/mL添加組之間差異不顯著（P＞0.05），且0.25×107CFU/mL添加組與對照組之間差異亦不顯著（P＞0.05）。添加0.75×107CFU/mL植物乳桿菌體外達(dá)1/2理論最大產(chǎn)氣量的時(shí)間顯著低于對照組和0.25×107CFU/mL添加組（P＜0.05），而與0.50×107CFU/mL添加組之間差異不顯著（P＞0.05）；而0.50×107CFU/mL添加組與對照組、0.25×107CFU/mL添加組之間差異不顯著（P＞0.05）。不同添加水平植物乳桿菌對理論最大產(chǎn)氣量均沒有顯著影響（P＞0.05）。

當(dāng)以水稻秸稈為發(fā)酵底物時(shí)，不同添加水平植物乳桿菌對理論最大產(chǎn)氣量和達(dá)1/2理論最大產(chǎn)氣量的時(shí)間均沒有顯著影響（P＞0.05）；添加0.75×107CFU/mL植物乳桿菌發(fā)酵初期產(chǎn)氣速率顯著高于對照組（P＜0.05）。隨著植物乳桿菌添加水平的增加，發(fā)酵初期產(chǎn)氣速率呈顯著的線性增加效應(yīng)（P＜0.05）。對發(fā)酵初期產(chǎn)氣速率，發(fā)酵底物和植物乳桿菌添加水平之間呈顯著的交互效應(yīng)（P＜0.05），而對理論最大產(chǎn)氣量和達(dá)1/2理論最大產(chǎn)氣量的時(shí)間則沒有顯著的交互效應(yīng)（P＞0.05）。

表3 植物乳桿菌不同添加水平對玉米秸稈和水稻秸稈體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響Table 3 Effects of different supplemental levels ofLactobacillus plantarumonin vitrofermentation gas production of maize stover and rice straw mL

表4 植物乳桿菌不同添加水平對玉米秸稈和水稻秸稈體外發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)的影響Table 4 Effects of different supplemental levels ofLactobacillus plantarumonin vitrofermentation gas production parameters of maize stover and rice straw

續(xù)表4

2.3 植物乳桿菌不同添加水平對體外發(fā)酵VFA濃度的影響

植物乳桿菌不同添加水平對玉米秸稈和水稻秸稈體外發(fā)酵VFA濃度的影響如表5所示。玉米秸稈為發(fā)酵底物時(shí)，體外發(fā)酵各VFA濃度和乙酸/丙酸各植物乳桿菌添加水平的平均值均顯著高于水稻秸稈（P＜0.05）。

植物乳桿菌不同添加水平對玉米秸稈和水稻秸稈體外發(fā)酵乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸和總VFA濃度及乙酸/丙酸均沒有顯著影響（P＞0.05），且植物乳桿菌添加水平與發(fā)酵底物間的沒有顯著交互效應(yīng)（P＞0.05）。

表5 植物乳桿菌不同添加水平對玉米秸稈和水稻秸稈體外發(fā)酵48 h VFA濃度的影響Table 5 Effects of different supplemental levels ofLactobacillus plantarumon VFA concentrations of 48 hin vitrofermentation of maize stover and rice straw

續(xù)表5

2.4 植物乳桿菌不同添加水平對體外發(fā)酵NDFD和DMD的影響

植物乳桿菌不同添加水平對玉米秸稈和水稻秸稈體外發(fā)酵NDFD和DMD的影響如表6所示。玉米秸稈和水稻秸稈不同植物乳桿菌添加水平的NDFD和DMD平均值均無顯著差異（P＞0.05）。植物乳桿菌不同添加水平對玉米秸稈和水稻秸稈兩種發(fā)酵底物體外發(fā)酵NDFD和DMD亦沒有顯著影響（P＞0.05），且對這2個(gè)指標(biāo)，發(fā)酵底物和植物乳桿菌添加水平之間沒有顯著的交互效應(yīng)（P＞0.05）。

2.5 植物乳桿菌不同添加水平對體外發(fā)酵NH3-N濃度和pH的影響

植物乳桿菌不同添加水平對玉米秸稈和水稻秸稈體外發(fā)酵NH3-N濃度和pH的影響如表7所示。隨著植物乳桿菌添加水平的增加，玉米秸稈和水稻秸稈體外發(fā)酵NH3-N濃度均呈顯著的線性增加效應(yīng)（P＜0.05）。添加0.75×107CFU/mL植物乳桿菌玉米秸稈體外發(fā)酵NH3-N濃度顯著高于對照組和0.25×107CFU/mL添加組（P＜0.05），且0.50×107CFU/mL添加組亦極顯著高于對照組（P＜0.01），而與0.25×107CFU/mL添加組沒有顯著差異（P＞0.05），且0.25×107CFU/mL添加組和對照組亦沒有顯著差異（P＞0.05）。添加 0.75× 107CFU/mL植物乳桿菌水稻秸稈體外發(fā)酵NH3-N濃度顯著高于對照組及 0.25×107和 0.50× 107CFU/mL添加組（P＜0.05），而后3組之間沒有顯著差異（P＞0.05）。發(fā)酵底物、植物乳桿菌添加水平以及兩者之間的交互效應(yīng)對體外發(fā)酵pH均沒有顯著影響（P＞0.05）。

表6 植物乳桿菌不同添加水平對玉米秸稈和水稻秸稈體外發(fā)酵48 h NDFD和DMD的影響Table 6 Effects of different supplemental levels ofLactobacillus plantarumon NDFD and DMD of 48 hin vitrofermentation of maize stover and rice straw %

表7 植物乳桿菌不同添加水平對玉米秸稈和水稻秸稈體外發(fā)酵48 h NH3-N濃度和pH的影響Table 7 Effects of different supplemental levels ofLactobacillus plantarumon NH3-N concentration and pH of 48 hin vitrofermentation of maize stover and rice straw

3 討 論

低添加水平的植物乳桿菌一定程度上可促進(jìn)水稻秸稈中后期發(fā)酵的進(jìn)行，而高添加水平的植物乳桿菌對水稻秸稈體外發(fā)酵的促進(jìn)作用不明顯。瘤胃內(nèi)的氣體主要來源于瘤胃微生物消耗可溶性碳水化合物和其他營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生的低級脂肪酸、甲烷、氫氣和二氧化碳等代謝產(chǎn)物。添加植物乳桿菌能促進(jìn)玉米秸稈前期體外發(fā)酵，相反對水稻秸稈體外發(fā)酵中后期發(fā)酵促進(jìn)作用則更加明顯，這可能與玉米秸稈和水稻秸稈2種發(fā)酵底物植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和養(yǎng)分釋放規(guī)律的差異有關(guān)。

體外發(fā)酵產(chǎn)氣量一定程度上可以反映出發(fā)酵底物為瘤胃微生物所利用的程度［22］，同時(shí)利用產(chǎn)氣量，能有效預(yù)測體內(nèi)干物質(zhì)的降解率以及代謝能［23］。 Muck等［24］研究報(bào)道，體外發(fā)酵過程中65%～70%產(chǎn)氣量在發(fā)酵初期9～10 h內(nèi)產(chǎn)生，而本試驗(yàn)中，玉米秸稈和水稻秸稈體外發(fā)酵達(dá)1/2理論最大產(chǎn)氣量的時(shí)間分別約為15和19 h，即2種底物體外發(fā)酵產(chǎn)氣量達(dá)到總產(chǎn)氣量50%時(shí)所需時(shí)間分別約為15和19 h，明顯高于Muck等［24］所報(bào)道的結(jié)論，可能是由于兩者體外培養(yǎng)方式的不同而導(dǎo)致產(chǎn)氣速率上存在差異。

Contreras-Govea等［6］利用植物乳桿菌接種青貯飼料進(jìn)行體外發(fā)酵，研究結(jié)果證實(shí)VFA濃度也沒有顯著改變，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。通過青貯飼料接種微生物進(jìn)行體外發(fā)酵，證明微生物能夠影響體外發(fā)酵VFA濃度［22］；同時(shí)體外瘤胃接種乳酸菌亦能夠影響VFA的組成［25-26］。在本試驗(yàn)中，除戊酸外，添加不同水平植物乳桿菌對其他VFA濃度以及乙酸/丙酸并無顯著影響，VFA濃度只在添加植物乳桿菌的不同底物間存在顯著差異，可能由于發(fā)酵底物化學(xué)成分以及細(xì)胞比結(jié)構(gòu)不同引起的。2種底物不同的有機(jī)物含量以及礦物質(zhì)含量均會(huì)導(dǎo)致不同的發(fā)酵液VFA濃度［21-28］，此外，2種秸稈不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，也可能是造成VFA濃度不同的原因。張?jiān)獞c等［29］研究報(bào)道6種不同來源植物細(xì)胞壁發(fā)酵產(chǎn)生總VFA及其除丁酸外的其他VFA組分濃度均存在顯著性差異。

通過對添加植物乳桿菌的青貯飼料進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，添加植物乳桿菌的青貯飼料NDFD和DMD均無顯著差異［6］；利用全株玉米做發(fā)酵底物進(jìn)行體外發(fā)酵時(shí)，也得到類似結(jié)論［30］，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。而利用植物乳桿菌發(fā)酵青貯飼料，結(jié)果表明該菌可提高體外DMD［4］，二者之間的差異可能是由于發(fā)酵底物不同而造成的。此外，隨著植物乳桿菌添加量的增加，玉米秸稈和水稻秸稈體外DMD亦不斷增加，且體外產(chǎn)氣量也隨之增加；產(chǎn)氣量與DMD之間存在高度正相關(guān)［31］，此結(jié)論與本試驗(yàn)結(jié)果相符合。在本試驗(yàn)中，玉米秸稈體外平均DMD和NDFD均高于水稻秸稈，造成此種差異除化學(xué)組成存在差異外，微生物與底物的吸附能力以及底物的結(jié)構(gòu)也可能是造成此種差異的原因之一。Fernando等［32］報(bào)道，細(xì)菌與底物的吸附能力是影響底物消化率的重要因子，徐俊等［33］研究報(bào)道，苜蓿莖被瘤胃微生物降解的速率及程度受其組織結(jié)構(gòu)及組分影響，同時(shí)其指出微生物對植物組織的吸附方式的不一致性也可能是造成不同底物纖維降解率不同的原因之一。

隨著體外發(fā)酵時(shí)間的延長，NH3-N濃度和產(chǎn)氣量上升趨勢一致，表明植物乳桿菌對體外瘤胃發(fā)酵氮代謝具有一定的影響。孟慶翔等［34］研究指出，體外發(fā)酵NH3-N濃度與體外產(chǎn)氣量存在高度正相關(guān)（r＞0.99）。Hu等［8］利用植物乳桿菌對干物質(zhì)含量不同的青貯玉米秸稈進(jìn)行體外發(fā)酵，結(jié)果表明植物乳桿菌能顯著降低NH3-N濃度，這可能是由于發(fā)酵底物營養(yǎng)成分不同所致。瘤胃液pH常作為衡量瘤胃內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵的重要生化指標(biāo)之一，它的穩(wěn)定直接影響著瘤胃內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)的多樣性，并直觀地反映動(dòng)物體的健康狀況［35］。本試驗(yàn)pH為6.40～6.47，屬于反芻動(dòng)物體內(nèi)瘤胃液pH的正常范圍［36］，且隨添加量增加，并無顯著變化，這與體外發(fā)酵VFA濃度變化保持一致。但也有研究報(bào)道用植物乳桿菌發(fā)酵青貯飼料后，pH降到4以下［37］，此結(jié)果可能是由于青貯飼料中含有大量微生物以及有機(jī)物所致。

4 結(jié) 論

①添加植物乳桿菌能顯著提高玉米秸稈體外發(fā)酵初期的產(chǎn)氣速率和產(chǎn)氣量（1～24 h），以添加0.75×107CFU/mL效果最為理想。

②添加植物乳桿菌能顯著提高水稻秸稈體外發(fā)酵后期（36～48 h）產(chǎn)氣量，以添加 0.25× 107CFU/mL效果最為理想。

③ 隨著植物乳桿菌添加水平的增加，玉米秸稈和水稻秸稈體外發(fā)酵NH3-N濃度均呈現(xiàn)顯著的線性性增加效應(yīng)，表明添加植物乳桿菌能促進(jìn)2種底物體外發(fā)酵氮代謝，同時(shí)對維持pH的穩(wěn)定平衡具有積極作用。

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Effects ofLactobacillus plantarumonin VitroRumen Fermentation Characteristics of Maize Straw and Rice Straw

CHEN Liang1，2REN Ao1，2?LI Bin3ZHOU Chuanshe2，4??TAN Zhiliang2
（1.College of Animal Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha410128，China；2.Key Laboratory for Agri-Ecological Processes in Subtropical Region，Hunan Research Center of Livestock＆Poultry Sciences，South Central Experimental Station of Animal Nutrition and Feed Science in Ministry of Agriculture，Institute of Subtropical Agriculture，Chinese Academy of Sciences，Changsha410125，China；3.Institute of Animal Science of Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Lhasa850000，China；4.Hunan Co-Innovation Center of Animal Production Safety，Changsha410128，China）

The objective of this trial was to explore and the effects ofLactobacillus plantarumon the characteristics ofin vitroruminal fermentation of maize straw and rice straw in dairy cows.The trial was conducted as one-factor block experimental design，and four supplemental levels［0（control），0.25×107，0.50×107and 0.75×107CFU/mL］ofLactobacillus plantarumwere designed to analyze the influence onin vitrofermentation gas production（1，2，4，6，12，24，36 and 48 h），gas production parameters，dry matter degradability（DMD），neutral detergent fiber degradability（NDFD），and concentrations of volatile fatty acid（VFA）and ammonia nitrogen（NH3-N），as well as pH in fermentation fluid.The results showed that the supplementation ofLactobacillus plantarumcould significantly increase theoretical maximum gas production and gas production at 1 to 24 h of maize straw（P＜0.05），and the optimum supplemental level was 0.75×107CFU/mL；the supplementation ofLactobacillus plantarumcould significantly increase gas production at 36 to 48 h（P＜0.05），and the optimum supplemental level was 0.25×107CFU/mL.NH3-N concentration of two substrates of in vitro fermentation was enhanced linearly and significantly with the improvement of supplemental level ofLactobacillus plantarum（P＜0.05）.However，there were no significant differences on NDFD，DMD，and VFA（acetic acid，propionic acid，isobutyric acid，butyric acid and valeric acid）concentrations and pH of fermentation fluid with the change of supplemental levels ofLactobacillus plantarum（P＞0.05）.The results suggest that addingLactobacillus plantarumcan promote in vitro fermentation and nitrogen metabolism，and maintain pH balance of maize straw and rice straw，the optimal supplemental levels of which are 0.75×107and 0.25× 107CFU/mL，respectively.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2017，29（2）：678-689］

Lactobacillus plantarum；in vitrofermentation；rumen；dairy cows；maize straw；rice straw

S816.7；S823

A

1006-267X（2017）02-0678-12

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.02.038

（責(zé)任編輯 王智航）

2016-08-22

娟姍牛生產(chǎn)性能與乳品質(zhì)提升營養(yǎng)調(diào)控關(guān)鍵技術(shù)研究（西藏自治區(qū)財(cái)政專項(xiàng)）；國家“十二五”科技支撐計(jì)劃（2012BAD14B17）；國家自然科學(xué)基金（31001024）；中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所青年人才領(lǐng)域項(xiàng)目（ISACX-LYQY-QN-1105）

陳 亮（1987—），男，安徽阜陽人，碩士，研究方向反芻動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)。E-mail：chenliang071110＠163.com

?同等貢獻(xiàn)作者

??通信作者：周傳社，研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail：zcs＠isa.ac.cn

?Contributed equally

??Corresponding author，professor，E-mail：zcs＠isa.ac.cn