王 萍， 母洪娜， 耿興敏， 楊秀蓮， 王良桂

(南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇南京 210037)

利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化桂花的SSR-PCR體系

王 萍， 母洪娜， 耿興敏， 楊秀蓮， 王良桂

(南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇南京 210037)

以潢川金桂DNA為SSR-PCR擴(kuò)增模板，采用L16(45)正交設(shè)計(jì)對Taq酶用量、Mg2+濃度、模板DNA用量、dNTPs濃度以及引物濃度在4個水平上進(jìn)行了優(yōu)化，建立了桂花SSR-PCR反應(yīng)的最佳體系，即在10 μL反應(yīng)體系中，不同成分的最佳含量為Taq酶0.2 U、Mg2+3.0 mmol/L、模板DNA 40 ng、dNTPs 0.60 mmol/L、引物0.8 μmol/L。應(yīng)用最佳體系對引物OfP50進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化，得到最適退火溫度范圍為60～62 ℃。

桂花；SSR-PCR；體系優(yōu)化；正交設(shè)計(jì)

簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)是一類由 1～6個堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列[1]，其長度在100 bp以內(nèi)，廣泛分布于各類真核生物基因組中。SSR標(biāo)記由于具有高度的重復(fù)性、豐富的多態(tài)性、共顯性等優(yōu)點(diǎn)，成為構(gòu)建遺傳圖譜[2-3]，研究遺傳多樣性，分析親緣關(guān)系[4-5]，種質(zhì)鑒定[6-8]，進(jìn)行分子輔助標(biāo)記[9-10]、基因定位與克隆[11-12]等的理想工具。

桂花(OsmanthusfragransLour.)為木犀科木犀屬常綠小喬木或灌木，是城市優(yōu)良的綠化樹種，也是我國十大傳統(tǒng)名花之一。近年來，對桂花分子方面的研究主要是利用SRAP[13-14]、RAPD[15]、ISSR[16-18]、AFLP[19-20]這幾種分子標(biāo)記技術(shù)，以SSR分子標(biāo)記對桂花開展的相關(guān)研究較少。本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法對桂花SSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以期建立一個穩(wěn)定可靠的反應(yīng)體系，為今后利用SSR標(biāo)記技術(shù)對桂花開展進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)桂花采自南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)的潢川金桂，提取其DNA作為SSR-PCR反應(yīng)的模板DNA?？旖菪椭参锘蚪MDNA提取試劑盒(非離心柱型)購自天根生化科技(北京)有限公司；dNTPs、Mg2+、10×Buffer(Mg2+Free)、TaqDNA聚合酶、SSR引物、Marker(DL50)均購自上海捷瑞生物工程有限公司。根據(jù)筆者前期試驗(yàn)，引物OfP50(5′-TTACCACCAAGATGACAGCGG-3′、5′-CCGCCCCCTTTCTCTCTCTA-3′)對于桂花具有良好的條帶可讀性與多態(tài)性，故選其為此次正交試驗(yàn)及退火溫度的固定引物。

1.2 基因組DNA的提取

取生長良好的潢川金桂嫩葉，采用試劑盒的方法提取DNA。DNA的純度和濃度測定使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)，選用D260 nm/D280 nm在1.7～1.9且濃度大于 20 ng/μL 的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增前將DNA稀釋至 20 ng/μL。

1.3 PCR反應(yīng)體系正交設(shè)計(jì)

選用L16(45)正交設(shè)計(jì)表，對PCR反應(yīng)中5個因素(Taq酶含量、dNTPs含量、Mg2+含量、模板DNA含量、引物含量)在4個水平上進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平的選取參考徐沂春等的方法[21-22]并加以綜合。PCR反應(yīng)因素水平見表1，L16(45)設(shè)計(jì)方案見表2，本試驗(yàn)采用 10 μL 體系，不足體積用ddH2O補(bǔ)齊，試驗(yàn)設(shè)2次重復(fù)。

表1 優(yōu)化桂花PCR反應(yīng)體系的因素水平

1.4 SSR-PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Biometrac TPfofessional Standard PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序：首先94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.5 反應(yīng)產(chǎn)物的電泳與檢測

在PCR產(chǎn)物中加入5 μL 0.25%溴酚藍(lán)，然后加樣，樣孔中每樣品點(diǎn)樣1 μL，D50Marker為對照，用12%聚丙烯酰胺凝膠于恒壓240 V電壓下電泳1 h左右，再進(jìn)行銀染和顯影，凝膠在燈光下用數(shù)碼相機(jī)照相以供分析。

1.6 退火溫度的篩選

采用試驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)體系對本次試驗(yàn)所用引物OfP50 的退火溫度進(jìn)行篩選。利用 ABI Veriti梯度PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)程序中退火溫度梯度試驗(yàn)。設(shè)置退火溫度為 48～65 ℃，共18個梯度，對所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

表2 優(yōu)化桂花SSR-PCR反應(yīng)體系L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.7 最佳反應(yīng)體系的檢測

隨機(jī)選擇引物OfP16(5′-TGCATTTCTGACGCCTGGAT-3′、5′-ACCGTTGTCAAGCCCCTTTT-3′)對21份采集于南京林業(yè)大學(xué)校園同一植株的潢川金桂實(shí)生苗DNA進(jìn)行SSR擴(kuò)增，對優(yōu)化確定的桂花SSR-PCR體系的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)

從圖1可以看出，5個因素的濃度組合不同，擴(kuò)增出來的效果存在明顯差異。處理1、處理5、處理9沒有條帶；處理7、處理11、處理12、處理14、處理15、處理16擴(kuò)增出了分子量小于50 bp的引物二聚體，處理15、處理16存在不同程度的雜帶；處理2、處理6、處理8、處理10條帶比較模糊；處理3、處理4、處理13擴(kuò)增出了比較好的條帶。綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素以及清晰度，選擇處理4為最佳體系，即在10 μL反應(yīng)體系中，Taq酶含量為0.2 U，Mg2+濃度為3.0 mmol/L，模板DNA含量為40 ng、dNTPs濃度為0.60 mmol/L、引物濃度為 0.8 μmol/L。

2.2 退火溫度篩選

退火溫度對擴(kuò)增結(jié)果有較大的影響，引物在最適宜的退火溫度下擴(kuò)增出來的條帶清晰，反之條帶會模糊、拖尾。試驗(yàn)對引物OfP50設(shè)置了18個不同的退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不同溫度條件下產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖2，退火溫度過低，非特異性條帶增多，結(jié)果不可靠；退火溫度過高時，引物與模板結(jié)合差，清晰度下降。綜合考慮條帶數(shù)與清晰度，引物OfP50適宜的退火溫度范圍為60～62 ℃。

2.3 最佳反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測

應(yīng)用該最佳反應(yīng)體系，隨機(jī)選擇引物OfP16對21份取自同植株的潢川金桂實(shí)生苗DNA進(jìn)行擴(kuò)增，從圖3可以看出，21份DNA模板都擴(kuò)增出了清晰目的條帶，說明該體系較穩(wěn)定，適用于桂花SSR-PCR反應(yīng)。

3 討論

PCR的體積對擴(kuò)增效果有一定影響，體積過小，容易出現(xiàn)操作上的誤差，體積過大，增加試驗(yàn)成本。本試驗(yàn)采用 10 μL 反應(yīng)體系，得到了清晰的條帶，相較王靜對桂花采用的20 μL反應(yīng)體系[22]，節(jié)省了試驗(yàn)材料，并節(jié)約了成本。

引物的退火溫度對擴(kuò)增效果有較大的影響，因此，采用不同的引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時，須對引物進(jìn)行退火溫度篩選，以確定最適宜的退火溫度。

正交設(shè)計(jì)的優(yōu)越性就在于能均衡各個試驗(yàn)因素并考慮到各因素間的交互效應(yīng)，在減少試驗(yàn)次數(shù)的同時又不使信息損失過多，可以在最短的時間內(nèi)找到最優(yōu)的組合[23]。很多學(xué)者在優(yōu)化體系時也經(jīng)常使用多次單因素設(shè)計(jì)[24-26]，這種方法雖然簡便易行，但忽略了試驗(yàn)因素間的交互效應(yīng)，因此不能完全保證各個因素的最佳濃度組合到一起就是最佳反應(yīng)體系，但是結(jié)果可以作為正交設(shè)計(jì)結(jié)果的參考。

桂花SSR-PCR優(yōu)化體系的建立，可為今后桂花及其他木犀科植物的群體遺傳及基因型鑒定提供參考。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.011

2016-01-12

國家科技支撐計(jì)劃(編號：2013BA001B06)；江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程(編號：PAPD)。

王 萍(1989—)，女，江蘇常熟人，碩士，研究方向?yàn)閳@林植物育種。E-mail：alvawang@yeah.net。

王良桂，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閳@林植物應(yīng)用。E-mail：wlg@nifu.com.cn。

S685.130.1

A

1002-1302(2017)02-0044-03

王 萍，母洪娜，耿興敏，等. 利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化桂花的SSR-PCR體系[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(2)：44-46.