韓長(zhǎng)志

(西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院/云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224)

全基因組預(yù)測(cè)希金斯炭疽菌中碳水化合物酶類蛋白

韓長(zhǎng)志

(西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院/云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224)

希金斯炭疽菌侵染菜心等十字花科植物引起的炭疽病，給各國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失?；谇捌谘芯拷Y(jié)果，以658個(gè)分泌蛋白為基礎(chǔ)序列，利用CAZymes Analysis Toolkit預(yù)測(cè)程序，分析上述蛋白中的碳水化合物酶類(CAZymes)蛋白，明確該菌中含有238個(gè)CAZymes，分為主要類別和復(fù)合類別2類，前者包括75個(gè)糖苷水解酶(GHs)、48個(gè)碳水化合物綁定結(jié)構(gòu)(CBMs)、33個(gè)輔助酶類家族(AAs)、30個(gè)碳水化合物酯酶(CEs)、23個(gè)多糖裂解酶(PLs)、4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)，后者則包括17個(gè)GHs/CBMs、4個(gè)AAs/CBMs、4個(gè)CEs/CBMs等。研究結(jié)果可為深入開展該病菌侵染植物作用機(jī)制的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

希金斯炭疽菌；碳水化合物酶類蛋白；預(yù)測(cè)程序；全基因組預(yù)測(cè)

碳水化合物酶類(carbohydrate-active enzymes，簡(jiǎn)稱CAZymes)是植物病原菌侵染過程中突破寄主細(xì)胞第一道屏障——細(xì)胞壁的關(guān)鍵因素[1]。同時(shí)，對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)類型的植物病原真菌進(jìn)行分析，可以明確非活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌基因組較活體營(yíng)養(yǎng)型編碼更多的CAZymes[2]。隨著大量植物病原菌基因組測(cè)序的完成，近些年關(guān)于CAZymes的研究進(jìn)展較快[3]。根據(jù)最新研究成果，以涵蓋木質(zhì)纖維素降解所需要的相關(guān)酶類進(jìn)行分類，主要涉及以下6類：糖苷水解酶(glycoside hydrolases，簡(jiǎn)稱GHs)[4]、糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferases，簡(jiǎn)稱GTs)[5]、多糖裂解酶(polysaccharide lyases，簡(jiǎn)稱PLs)[6]、碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases，簡(jiǎn)稱CEs)[6]、輔助酶類家族(auxiliary activities，簡(jiǎn)稱AAs)[7]以及碳水化合物綁定結(jié)構(gòu)(carbohydrate-binding modules，簡(jiǎn)稱CBMs)[8]。

希金斯炭疽菌(ColletotrichumhigginsanumSacc.)作為半活體營(yíng)養(yǎng)型植物病原菌，可以侵染菜心、白菜、羽衣甘藍(lán)、大白菜、蘿卜、結(jié)球甘藍(lán)等十字花科蔬菜引起炭疽病[9-10]，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上較為嚴(yán)重的病害之一[11]。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)其生物學(xué)特性、生防菌篩選以及遺傳轉(zhuǎn)化[12]、致病基因[13-14]、轉(zhuǎn)化子的突變體庫建立[15-16]、防治[17]、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)信號(hào)通路繪制[18]，以及G蛋白信號(hào)調(diào)控因子(RGS)[19]、磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白(PITP)[20]、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)[21]、腺苷酸環(huán)化酶及其相關(guān)蛋白[22-23]、14-3-3[24]、胞裂蛋白(septin)[25]、磷酸二酯酶(PDE)[26]等在內(nèi)的諸多蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。

本研究基于前期所獲得的希金斯炭疽菌中658個(gè)分泌蛋白，利用CAZymes Analysis Toolkit(CAT)預(yù)測(cè)工具明確該菌中CAZymes不同亞家族的分布情況，以期為深入開展其功能研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 希金斯炭疽菌分泌蛋白序列來源

希金斯炭疽菌分泌蛋白，來自筆者在前期研究中獲得的658個(gè)分泌蛋白[27]。

1.2 CAZymes預(yù)測(cè)

利用在線工具CAZymes Analysis Toolkit[28]進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 希金斯炭疽菌中含有的CAZymes

通過CAT分析，明確希金斯炭疽菌中共含有238個(gè)CAZymes，其中GHs含量較高，所占比例為31.51%；其后依次為CBMs、AAs、CEs、PLs、GTs，所占比例分別為20.17%、13.87%、12.61%、9.66%、1.68%(圖1)。此外，在上述CAZymes的預(yù)測(cè)中，不僅具有單一的酶類型，而且有部分蛋白同屬于2種酶的類型，涉及GHs/CBMs、AAs/CBMs、CEs/CBMs 等(圖1)。由于CAZymes分類系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)是建立在氨基酸序列的相似性上， 不同蛋白具有不同的結(jié)構(gòu)折疊類型，因此，對(duì)于同一蛋白具有不同酶類型的情況，推測(cè)病原菌在侵染植物過程中上述酶所發(fā)揮的功能具有較多特性。

2.2 希金斯炭疽菌中含有的GHs

通過對(duì)上述糖基水解酶進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GH28中蛋白數(shù)量較多，為9個(gè)，其次為GH16，數(shù)量為7個(gè)(表1)。值得關(guān)注的是，GH105、GH128、GH132、GH20、GH30等類別的酶均只含有1個(gè)蛋白，推測(cè)希金斯炭疽菌侵染不同植物所利用的酶并不相同，也從分泌酶角度可以解釋其寄主廣泛的原因。然而，對(duì)于為什么有些酶類所含數(shù)量較多，而大多數(shù)所含數(shù)量較少，有待進(jìn)一步研究。

表1 希金斯炭疽菌中糖基水解酶分布情況

注：ID來自Broad數(shù)據(jù)庫。下表同。

2.3 希金斯炭疽菌中含有的CBMs

通過對(duì)碳水化合物綁定結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CBM50數(shù)量最多，為18個(gè)，其次為CBM13，數(shù)量為10個(gè)，上述蛋白所占比例為58.33%；此外，還涉及CBM1、CBM2、CBM3、CBM5、CBM12、CBM32、CBM63、CBM67等類別蛋白(表2)。值得關(guān)注的是，CH063_04845屬于CBM10/CBM2類別，是CZAymes酶類主要類別中存在的唯一1個(gè)CBM蛋白，推測(cè)它在發(fā)揮CBM功能方面具有特殊性。因此，對(duì)于該蛋白有待于開展更為細(xì)致的工作，以期解釋它們與其他蛋白之間的差別。

2.4 希金斯炭疽菌中含有的AAs

通過對(duì)輔助酶家族進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AA9數(shù)量較多，為12個(gè)，其次為AA7，為6個(gè)，上述蛋白所占比例為54.55%；此外，還涉及AA1、AA2、AA3、AA5等類別蛋白(表3)。該類蛋白作為近些年新分類蛋白，具有重要的生物學(xué)功能，因此，有待于開展后續(xù)生物學(xué)研究，從而更好地解析該類蛋白的功能。

2.5 希金斯炭疽菌中含有的CEs

通過對(duì)碳水化合物酯酶蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CE5、CE10數(shù)量較多，均為9個(gè)，其次為CE1，數(shù)量為3個(gè)，上述蛋白所占比例為70.00%；此外，還涉及CE3、CE4、CE6、CE8、CE10等類別蛋白(表4)。

2.6 希金斯炭疽菌中含有的PLs

通過對(duì)多糖裂解酶蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PL1數(shù)量較多，為10個(gè)，其次為PL3，數(shù)量為8個(gè)，上述蛋白所占比例為 78.26%；此外，還涉及PL4、PL9等類別蛋白，其數(shù)量較少(表5)。

表2 希金斯炭疽菌中碳水化合物綁定結(jié)構(gòu)分布情況

表3 希金斯炭疽菌中輔助酶類家族分布情況

表4 希金斯炭疽菌中碳水化合物酯酶的分布情況

2.7 希金斯炭疽菌中含有的GTs

通過對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)僅包含GT2、GT8、GT22、GT34等4個(gè)蛋白，其ID分別為CH063_00779、CH063_11721、CH063_11413、CH063_15057(表6)。與其他酶類進(jìn)行比較，該酶類較少，推測(cè)它們?cè)谙＝鹚固烤揖：χ参镞^程中發(fā)揮著特有功能。

2.8 希金斯炭疽菌中含有的復(fù)合類別蛋白

表5 希金斯炭疽菌中多糖裂解酶的分布情況

表6 希金斯炭疽菌中糖基轉(zhuǎn)移酶的分布情況

通過對(duì)希金斯炭疽菌中CAZymes進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除含有典型的GHs、CBMs、AAs、CEs、GTs以外，還含有一些復(fù)合類別的蛋白，涉及GHs/CBMs、AAs/CBMs、CEs/CBMs等3類，尤以GHs/CBMs類別中的蛋白數(shù)量居多，為17個(gè)，所占比例高達(dá)68.00%(表7)。上述復(fù)合類別的蛋白所具有的具體類別呈現(xiàn)出多樣性特點(diǎn)，推測(cè)它們?cè)谙＝鹚固烤揖：χ参镞^程中發(fā)揮著多種功能。

表7 希金斯炭疽菌中復(fù)合類別蛋白的分布情況

3 討論與結(jié)論

隨著希金斯炭疽菌全基因組序列的釋放[29]，學(xué)術(shù)界對(duì)其致病因子開展了大量研究。本研究結(jié)果與前人報(bào)道[29]不僅在CAZymes總數(shù)量方面有所差別，而且在具體的酶類別數(shù)量方面也有一定的差別。究其原因，就總數(shù)量而言，由于本研究所依賴的蛋白屬于前期通過生物信息學(xué)分析所獲得的分泌蛋白；在數(shù)量統(tǒng)計(jì)方面，以CAZymes主要類別和復(fù)合類別分別進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)，使得歸屬類別方面存在一定的差異，若將復(fù)合類別中的CAZymes分別歸屬到主要類別中，那么總的數(shù)量為263個(gè)，當(dāng)然該統(tǒng)計(jì)存在25個(gè)重復(fù)蛋白；此外，就不同類別中CAZymes數(shù)量而言，按照上述統(tǒng)計(jì)方法，本研究所獲得GHs、GTs、CBMs、CEs、PLs以及AAs則分別含有75、4、48、30、23、33個(gè)?？梢园l(fā)現(xiàn)，本研究所獲得GHs數(shù)量明顯少于前人所報(bào)道的361個(gè)[29]，原因尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。前人所開展的研究中CAZymes的具體類別有5個(gè)[29]，而最新的分類類別有6個(gè)，造成具體不同類別分項(xiàng)數(shù)量方面的差異。

本研究基于前期通過全基因組序列預(yù)測(cè)所獲得的分泌蛋白，利用現(xiàn)有在線工具所獲得的CAZymes是否為希金斯炭疽菌中的全部，均有待于進(jìn)一步開展試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。在數(shù)量方面，O′Connell等報(bào)道為689個(gè)[29]，該報(bào)道的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本研究結(jié)果，就每一類中的數(shù)量報(bào)道也有不同，原因也有待于進(jìn)一步明確。

前期明確希金斯炭疽菌中含有658個(gè)分泌蛋白，本研究利用CAT在線預(yù)測(cè)程序，明確該菌中含有238個(gè)CAZymes，分為主要類別和復(fù)合類別2類，前者包括75個(gè)GHs、48個(gè)CBMs、33個(gè)AAs、30個(gè)CEs、23個(gè)PLs、4個(gè)GTs；后者則包括17個(gè)GHs/CBMs、4個(gè)AAs/CBMs、4個(gè)CEs/CBMs等。本研究為深入開展希金斯炭疽菌中CAZymes的功能研究以及進(jìn)一步找尋新的藥劑作用靶標(biāo)打下了一定的理論基礎(chǔ)。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.006

2015-12-16

國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：31560211)；云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(編號(hào)：ZK150004)；云南省優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)一級(jí)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(編號(hào)：50097505)；云南省高校林下生物資源保護(hù)及利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(編號(hào)：2014015)。

韓長(zhǎng)志(1981—)，男，河北石家莊人，博士，副教授，研究方向?yàn)榻?jīng)濟(jì)林木病害生物防治與真菌分子生物學(xué)。E-mail：hanchangzhi2010@163.com。

S432.4+4

A

1002-1302(2017)02-0024-04

韓長(zhǎng)志. 全基因組預(yù)測(cè)希金斯炭疽菌中碳水化合物酶類蛋白[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(2)：24-28.