李 瓊， 張愛華， 鄭 穎， 匙 坤， 楊 鶴， 盧寶慧， 許永華， 張連學(xué)

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院/吉林省人參工程技術(shù)研究中心，吉林長春 130118；2.濰坊工程職業(yè)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物工程學(xué)院，山東濰坊 262500)

2種模式細(xì)菌對人參皂苷的化學(xué)趨向性響應(yīng)

李 瓊1， 張愛華1， 鄭 穎2， 匙 坤1， 楊 鶴1， 盧寶慧1， 許永華1， 張連學(xué)1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院/吉林省人參工程技術(shù)研究中心，吉林長春 130118；2.濰坊工程職業(yè)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物工程學(xué)院，山東濰坊 262500)

采用毛細(xì)管法測定大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)在4種趨化參數(shù)(濃度、溫度、pH值和時間)下對人參總皂苷的化學(xué)趨向性響應(yīng)。結(jié)果表明，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌對低濃度人參總皂苷表現(xiàn)出較強(qiáng)的化學(xué)趨向性，與陰性對照組相比，趨化指數(shù)分別為3.868、3.755；與陽性對照組相比，趨化指數(shù)分別為1.075、1.175。研究結(jié)果顯示，低濃度的人參總皂苷對2種細(xì)菌的化學(xué)趨向性有促進(jìn)作用，但是隨著濃度的增加而減弱。

人參總皂苷；大腸桿菌；金黃色葡萄球菌；化學(xué)趨向性

人參(PanaxginsengC. A. Mey.)為五加科人參屬重要藥用植物，是我國的名貴中藥材。然而在人參生長過程中，連作障礙是影響其規(guī)范化種植的主要因素之一。據(jù)報道，植物連作障礙的發(fā)生是由多方面因素導(dǎo)致的，如病蟲害高發(fā)、自毒物質(zhì)積累、土壤營養(yǎng)失衡、土壤惡化等[1]。在近幾年的研究中，根系分泌物生態(tài)效應(yīng)的間接作用及土壤微生物種群比例失調(diào)被視為誘發(fā)植物連作障礙的主要因素，某些種群微生物可借助趨化感應(yīng)(chemotaxis response)利用根系分泌物中的特定組分，實現(xiàn)快速增殖，從而對其他有益微生物的生長產(chǎn)生抑制，以此改變分泌物中的組分和數(shù)量，進(jìn)而為趨化性病原微生物提供更多碳源、能源，形成惡性循環(huán)，使植物生長發(fā)育不良[2-6]。

人參皂苷是人參根系分泌物中一類主要次生代謝產(chǎn)物，它不僅被視為土壤微生物的基質(zhì)，同時也在植物體與土壤微生物之間起著調(diào)節(jié)作用[7-9]。人參病害暴發(fā)流行時期正是人參根系分泌物分泌最旺盛時期，病害高發(fā)是導(dǎo)致人參連作障礙的先決條件。然而在這期間，關(guān)于人參皂苷是否對人參根際微生物起到趨化作用、能否保持土壤微生態(tài)平衡等未見相關(guān)報道。大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)分別屬于革蘭氏陰性細(xì)菌(G-)、革蘭氏陽性細(xì)菌(G+)，通常被作為模式微生物來研究，這2種細(xì)菌在自然界中無處不在，在空氣、土壤、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到它們。大多數(shù)學(xué)者關(guān)注這2種細(xì)菌在人體或動物體內(nèi)的衛(wèi)生學(xué)及致病性，而忽視了它們在自然界中的存在對植物生態(tài)方面的影響。本試驗以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌作為模式菌株，探討人參皂苷對其化學(xué)趨向性的影響，以期為人參根際微生物的化學(xué)趨向性響應(yīng)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.2 供試藥品 人參根系總皂苷由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)張春紅博士提供(純度80%)。氯化鈉(分析純)，北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司；牛肉膏(生物試劑純度)、蛋白胨(生物試劑純度)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉(H8145)，上海稼豐園藝用品有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 采用牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基配方：5.0 g/L牛肉膏，10.0 g/L蛋白胨，5.0 g/L NaCl，pH值7.2～7.4；固體培養(yǎng)基配方：5.0 g/L牛肉膏，10.0 g/L蛋白胨，5.0 g/L NaCl，20 g/L瓊脂，pH值7.2～7.4。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備 將-70 ℃保存的菌種接種到牛肉膏-蛋白胨固體培養(yǎng)基上，于37 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h。挑取單菌落于適量稀釋液(0.90% NaCl，pH值7.2)中，充分振蕩混勻后制成一定濃度的菌液(約108CFU/mL，D625 nm=0.1)，通過稀釋得到107CFU/mL的菌液，備用。

1.2.2 皂苷溶液的制備 用蒸餾水配制濃度分別為 12.500 0、1.250 0、0.125 0、0.012 5 mg/L的人參總皂苷溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，備用。

對照設(shè)置：CK1為陰性對照，成分是無菌水；CK2為陽性對照，成分為無菌肉湯培養(yǎng)液。

1.2.3 化學(xué)趨向性反應(yīng)試驗 采用改進(jìn)的毛細(xì)管法進(jìn)行化學(xué)趨向性反應(yīng)試驗[10]，玻璃毛細(xì)管(內(nèi)徑為0.5 mm)一端吸入人參總皂苷趨化待測液，另一端用熱熔膠封閉。將毛細(xì)管插入到含500 μL菌液的1 mL注射器中，37 ℃下水平孵育 60 min。用無菌水沖毛細(xì)管外壁以去除附著的菌液，折斷毛細(xì)管后將內(nèi)含物轉(zhuǎn)入EP管中，加入40 μL無菌水稀釋3倍，再將溶液吸出，均勻涂抹在固體平板上，反復(fù)操作5次。平板于37 ℃培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計單菌落的平均數(shù)。以單菌落的數(shù)量來衡量大腸桿菌和金黃色葡萄球菌化學(xué)趨向性的大小。

1.2.4 趨化指數(shù)的測定 趨化指數(shù)=(S-SCK)/SCK。式中：S為2種細(xì)菌對人參總皂苷的趨化參數(shù)；SCK為2種細(xì)菌相較于對照試驗組的趨化參數(shù)。

1.2.5 不同濃度人參總皂苷對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌化學(xué)趨向性的影響 將配置好的人參總皂苷溶液(12.500 0、1.250 0、0.125 0、0.0125 mg/L)按“1.2.3”節(jié)的方法進(jìn)行趨化試驗。

1.2.6 溫度對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌化學(xué)趨向性的影響 將2種細(xì)菌置于不同溫度(25、30、35、40 ℃)下培養(yǎng)，按“1.2.3”節(jié)的方法進(jìn)行趨化試驗，其中培養(yǎng)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的人參總皂苷濃度分別為0.012 5、0.125 0 mg/L。

1.2.7 pH值對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌化學(xué)趨向性的影響 分別將濃度為0.012 5、0.125 0 mg/L的人參總皂苷溶液配制成不同的pH值(5、6、7、8)，按“1.2.3”節(jié)的方法進(jìn)行趨化試驗，2種細(xì)菌都在40 ℃條件下培養(yǎng)。

1.2.8 培養(yǎng)時間對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌化學(xué)趨向性的影響 將pH值為7、濃度分別為0.012 5、0.125 0 mg/L的人參總皂苷溶液設(shè)置不同培養(yǎng)時間(0、30、45、60、75 min)，按“1.2.3”節(jié)的方法進(jìn)行趨化試驗，2種細(xì)菌都在40 ℃條件下培養(yǎng)。

1.2.9 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌在最優(yōu)趨化參數(shù)下對人參總皂苷的化學(xué)趨向性響應(yīng) 綜合篩選以上4種條件下趨化現(xiàn)象最為明顯的試驗參數(shù)，按“1.2.3”節(jié)的方法進(jìn)行趨化試驗。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 本試驗均重復(fù)5次，試驗數(shù)據(jù)取“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件進(jìn)行處理，利用SPSS 18.0中的單因素方差分析(One-Way ANOVA)結(jié)合LSD法對統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)行顯著性方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度人參總皂苷對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌化學(xué)趨向性的影響

如圖1所示，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌分別對4種濃度的人參總皂苷表現(xiàn)出化學(xué)趨向性響應(yīng)。其中，當(dāng)人參總皂苷濃度為0.012 5 mg/L時，大腸桿菌的化學(xué)趨向性最明顯，而金黃色葡萄球菌則對0.125 0 mg/L濃度的人參總皂苷的化學(xué)趨向性最強(qiáng)，且二者都顯著高于對照1、對照2(P<0.05)，趨化指數(shù)分別為3.891、1.155，3.929、1.206。隨著溶液濃度的逐級遞增，大腸桿菌的化學(xué)趨向性減弱，而金黃色葡萄球菌的化學(xué)趨向性先增強(qiáng)后減弱，呈現(xiàn)低濃度大于高濃度的趨勢。

2.2 溫度對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌化學(xué)趨向性的影響

如圖2所示，當(dāng)培養(yǎng)溫度不同時，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌對人參總皂苷都表現(xiàn)出敏感的化學(xué)趨向性，且2種細(xì)菌的化學(xué)趨向性都隨溫度的增加而增強(qiáng)。一個有趣的現(xiàn)象是，2種細(xì)菌在培養(yǎng)溫度為25、30 ℃試驗組中所表現(xiàn)出來的化學(xué)趨向性要顯著低于35、40 ℃試驗組(P<0.05)，而在培養(yǎng)溫度為40 ℃的試驗組中，2種細(xì)菌所表現(xiàn)出的化學(xué)趨向性最強(qiáng)、單菌落數(shù)量最多，且均顯著高于其他試驗組(P<0.05)。

2.3 pH值對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌化學(xué)趨向性的影響

如圖3所示，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌對不同pH值的人參總皂苷培養(yǎng)液均表現(xiàn)出化學(xué)趨向性響應(yīng)，但是隨著pH值的逐漸增加，2種細(xì)菌的化學(xué)趨向性都出現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢。中性和偏堿性(pH值=7、8)試驗組的化學(xué)趨向性要明顯強(qiáng)于酸性、偏弱酸性(pH值=5、6)試驗組(P<0.05)，且都在pH值=7時達(dá)到最大趨化值。結(jié)果顯示，當(dāng)pH值繼續(xù)增加，不會增強(qiáng)2種細(xì)菌的化學(xué)趨向性響應(yīng)，這可能與細(xì)菌生存的最適pH值存在一定的偶聯(lián)關(guān)系。

2.4 培養(yǎng)時間對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌化學(xué)趨向性的影響

如圖4所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌對人參總皂苷的化學(xué)趨向性都呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢，且都顯著高于0 min試驗組。其中，2種細(xì)菌在培養(yǎng)60、75 min時的化學(xué)趨向性明顯高于培養(yǎng)30、45 min試驗組，尤其在60 min時的化學(xué)趨向性最強(qiáng)且顯著高于其他試驗組(P<0.05)。結(jié)果還表明，隨著培養(yǎng)時間的進(jìn)一步延長， 2種

細(xì)菌的化學(xué)趨向性會受到一定的限制。

2.5 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌在最優(yōu)趨化參數(shù)下對人參總皂苷化學(xué)趨向性的響應(yīng)

如圖5所示，通過對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行不同人參總皂苷濃度、培養(yǎng)溫度、pH值及趨化時間條件下的化學(xué)趨向性研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌對于濃度為0.012 5 mg/L的人參總皂苷，在pH值=7、培養(yǎng)溫度為40 ℃、培養(yǎng)時間為 60 min 的條件下達(dá)到最大趨化值，顯著高于對照1、對照2(P<0.05)，趨化指數(shù)分別為3.868、1.075；而金黃色葡萄球菌則對濃度為0.125 0 mg/L的人參總皂苷在pH值=7、培養(yǎng)溫度為40 ℃、培養(yǎng)時間為60 min時達(dá)到最大趨化值，顯著高于對照1、對照2(P<0.05)，趨化指數(shù)分別為3.755、1.175。由此看出，2種模式細(xì)菌在最優(yōu)趨化參數(shù)條件下對人參總皂苷都表現(xiàn)出較強(qiáng)的化學(xué)趨向性響應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

有報道指出，不同濃度下的人參根系分泌物不僅影響人參根際微生物的生長、繁殖及種群分布，而且分泌物中自毒性物質(zhì)的濃度效應(yīng)同樣影響人參種子的萌發(fā)及幼苗生長[11-17]。自然條件下次生代謝物質(zhì)的濃度效應(yīng)對于闡明化學(xué)趨向性具有重要意義，只有在特定的濃度下才能顯示較強(qiáng)的化學(xué)趨向性響應(yīng)。在本試驗中，2種模式細(xì)菌都對低濃度的人參總皂苷表現(xiàn)出較強(qiáng)的化學(xué)趨向性響應(yīng)，但是隨著濃度的增加而減弱。于是筆者推測，低濃度的人參根系分泌物可能會引起人參根際土壤微生物的化學(xué)趨向性響應(yīng)，以至于改變微生物的群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對人參的生長產(chǎn)生一定影響。

在自然界中，存在許多與植物生長代謝相關(guān)的微生物，且它們其中大部分都具有群體效應(yīng)，如某些植物病原菌可利用自身群體效應(yīng)來調(diào)控對宿主植物根際的定殖過程及其致病性[18-19]。然而人參根際土壤中的微生物是否存在群體效應(yīng)，其作用機(jī)制又是什么，這種效應(yīng)與人參根系分泌物及某些趨化性微生物之間又存在何種聯(lián)系等還有待深入研究。

[1]張重義，林文雄. 藥用植物的化感自毒作用與連作障礙[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，17(1)：189-196.

[2]Qi J J，Yao H Y，Ma X J，et al. Soil microbial community composition and diversity in the rhizosphere of a Chinese medicinal plant[J]. Communications in Soil Science and Plant Analysis，2009，40(9/10)：1462-1482.

[3]陳冬梅，柯文輝，陳蘭蘭，等. 連作對白肋煙根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2010，21(7)：1751-1758.

[4]張重義，陳 慧，楊艷會，等. 連作對地黃根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2010，21(11)：2843-2848.

[5]林茂茲，王海斌，林輝鋒.太子參連作對根際土壤微生物的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2012，31(1)：106-111.

[6]Zhou X，Wu F. p-Coumaric acid influenced cucumber rhizosphere soil microbial communities and the growth ofFusariumoxysporumf.sp.cucumerinum[J]. PLoS One，2012，7(10)：1310-1315.

[7]張秋菊，張愛華，楊 鶴，等. 人參皂苷對4種栽培作物早期根系發(fā)育的化感效應(yīng)[J]. 植物分類與資源學(xué)報，2012，34(4)：391-396.

[8]Nicol R W，Yousef L，Traquair J A，et al. Ginsenosides stimulate the growth of soilborne pathogens of American ginseng[J]. Phytochemistry，2003，64(1)：257-264.

[9]張愛華，雷鋒杰，許永華，等. 人參皂苷對人參主要土傳病害的化感作用[C]//中國植物保護(hù)學(xué)會植物化感作用專業(yè)委員會，中國海洋大學(xué). 中國第四屆植物化感作用學(xué)術(shù)研討會論文摘要集. 青島：中國植物保護(hù)學(xué)會植物化感作用學(xué)術(shù)委員會，2009：55.

[10]O’toole R，Lundberg S，F(xiàn)redriksson S A，et al. The chemotactic response ofVibrioanguillarumto fish intestinal mucus is mediated by a combination of multiple mucus components[J]. Journal of Bacteriology，1999，181(14)：4308-4317.

[11]雷鋒杰. 人參根系分泌物的化感作用研究[D]. 長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[12]張秋菊，耿艷秋，郜玉剛，等. 人參皂苷對人參幼苗生長發(fā)育的影響[J]. 中草藥，2012(12)：2503-2507.

[13]應(yīng)益昕. 人參連作對土壤微生物群落的影響研究[D]. 北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2013.

[14]張鴻雁，薛泉宏. 人參連作障礙防治研究進(jìn)展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，22(6)：68-71.

[15]張連學(xué)，陳長寶，王英平，等. 人參忌連作研究及其解決途徑[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，30(4)：481-485，491.

[16]楊靖春，張春麗，辛 華，等. 老參地輪作不同年限的紫穗槐對人參土壤微生物區(qū)系的影響研究[J]. 東北師大學(xué)報(自然科學(xué)版)，1985(2)：101-109.

[17]Walker T S，Bais H P，Déziel E，et al.Pseudomonasaeruginosa-plant root interactions. Pathogenicity，biofilm formation，and root exudation[J]. Plant Physiology，2004，134(1)：320-331.

[18]Von Bodman S B，Bauer W D，Coplin D L. Quorum sensing in plant-pathogenic bacteria[J]. Phytopathology，2003，41(41)：455-482.

[19]Fray R G. Altering plant-microbe interaction through artificially manipulating bacterial quorum sensing[J]. Annals of Botany，2002，89(3)：245-253.

10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.035

2015-11-18

國家科技支撐計劃(編號：2011BAI03B01)；國家自然科學(xué)基金(編號：31100239、31200224、31470420)；吉林省科技發(fā)展計劃(編號：20130206030YY、20140520159JH)。

李 瓊(1990—)，男，遼寧錦州人，碩士研究生，主要從事藥用植物栽培研究。E-mail：wode17k@163.com。

許永華，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥用植物栽培加工研究，E-mail：xuyonghua777@yeah.net；張連學(xué)，博士，教授，研究方向為藥用植物栽培與加工，Tel：(0431)84532952，E-mail：zlxbooksea@163.com。

S567.5+10.1

A

1002-1302(2017)02-0121-03

李 瓊，張愛華，鄭 穎，等. 2種模式細(xì)菌對人參皂苷的化學(xué)趨向性響應(yīng)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(2)：121-123.