薛 梅， 李曉英， 周衛(wèi)平

(1.重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶永川 402160； 2.重慶文理學(xué)院體育學(xué)院，重慶永川 402160)

龍牙百合花總黃酮提取工藝及抗氧化性

薛 梅1， 李曉英1， 周衛(wèi)平2

(1.重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶永川 402160； 2.重慶文理學(xué)院體育學(xué)院，重慶永川 402160)

以龍牙百合花為研究對(duì)象，優(yōu)化超聲波法提取總黃酮工藝條件，并作抗氧化活性分析。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)，研究乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)總黃酮提取效果的影響并確定最佳工藝條件，對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明，最佳工藝條件為提取溫度60 ℃，乙醇濃度60%，料液比1 g ∶5 mL，提取時(shí)間40 min，在此條件下，百合花總黃酮提取量為75.034 mg/g。由抗氧化試驗(yàn)結(jié)果看出，龍牙百合花總黃酮提取液對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)的清除效果優(yōu)于相同濃度的維生素C溶液，并且總體上差異顯著。

龍牙百合花；總黃酮；超聲波法；提取工藝；抗氧化

百合(Liliumspp.)為百合科(Liliacea)百合屬(Lilium)多年生草本植物。食用百合肉質(zhì)鮮美，鱗莖中含有鉀、鈣、鋅、鐵、硒等13種礦質(zhì)元素及多種維生素和18種氨基酸[1]，被譽(yù)為蔬菜中的珍品。龍牙百合(L.brownievar.viridulumBaker)是目前栽培面積較大的食用百合品種之一，主產(chǎn)于湖南省、江西省等地[2]。近年來(lái)重慶市部分區(qū)(縣)開(kāi)始規(guī)?；N植龍牙百合，成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收的重要途徑。農(nóng)民在栽培食用百合時(shí)，通常將花蕾摘除以提高鱗莖產(chǎn)量。目前對(duì)食用百合的研究主要集中在食用部分鱗莖的加工利用上，對(duì)于其他非食用部位的開(kāi)發(fā)和利用較少。百合花味甘，性平，無(wú)毒，具補(bǔ)中益氣、潤(rùn)肺安神之功效，主治咳嗽、眩暈、夜寐不安、天瘡等癥，常吃可使人面部肌膚光潔細(xì)滑[3-4]。

黃酮類(lèi)化合物(flavonoids)屬植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，又名生物類(lèi)黃酮(blonavonolds)、維生素P，常與維生素C伴存[5]。黃酮類(lèi)化合物主要分為黃酮類(lèi)、黃酮醇類(lèi)，廣泛存在于果蔬、中草藥中，具有顯著的清除人體內(nèi)自由基、抗衰老、抗癌變、調(diào)血脂、降血壓、消炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等藥理保健功能[6]，是一類(lèi)極具開(kāi)發(fā)前景的天然有機(jī)抗氧化劑。針對(duì)龍牙百合相關(guān)次生代謝產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)和利用較落后的現(xiàn)狀，本研究以龍牙百合花為研究對(duì)象，以乙醇為提取劑，超聲輔助水浴提取百合花總黃酮，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，選擇龍牙百合花總黃酮最佳提取工藝，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行初步研究，以期為龍牙百合的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍牙百合花購(gòu)于重慶市江津百合種植基地；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇等化學(xué)藥品均為分析純；蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，色譜純，純度≥98%(由中國(guó)藥品生物制品檢定研究院提供)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

主要儀器與設(shè)備：HZT-A電子天平、RRH-200型高速多功能粉碎機(jī)、Q/BKYY31-2000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、數(shù)控超聲波清洗器、電熱恒溫水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、UV-102PCS型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原材料的前處理 將龍牙百合花于60 ℃恒溫烘干，再粉碎并過(guò)60目篩，密封冷藏待用。

1.3.2 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精確稱(chēng)取5.0 mg蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品置于25 mL容量瓶?jī)?nèi)，加70%乙醇至刻度，搖勻，得到 0.2 mg/mL 蕓香苷溶液；精確量取0、1、2、3、4、5、6 mL蕓香苷溶液，分別置于25 mL容量瓶中，各加水至6 mL，分別加1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6 min；加1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻放置6 min，加10 mL 4%氫氧化鈉溶液，再加水至刻度，搖勻放置15 min，以相應(yīng)的溶劑為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度(C)為橫坐標(biāo)、吸光度(D510 nm)為縱坐標(biāo)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=10.206x+0.007 5，r2=0.998 9。

1.3.3 樣品總黃酮的測(cè)定 稱(chēng)取龍牙百合花瓣粉末2.5 g于250 mL具塞三角瓶中，根據(jù)不同提取條件，抽濾得到提取物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后溶解定容。根據(jù)蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作方法，測(cè)定總黃酮提取量。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 分別改變提取溫度(40～80 ℃)、乙醇濃度(50%～90%)、料液比[1 g ∶(10～50) mL]、提取時(shí)間(10～50 min)進(jìn)行單因素多水平試驗(yàn)，考察以上因素對(duì)龍牙百合花總黃酮提取量的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選定提取溫度(A)、乙醇濃度(B)、料液比(C)、提取時(shí)間(D)為考察因素，采用L9(34)正交表安排試驗(yàn)，因素水平設(shè)置見(jiàn)表1。通過(guò)測(cè)定總黃酮提取量，優(yōu)選最佳工藝條件。

表1 龍牙百合花總黃酮提取工藝L9(34)因素水平

1.3.6 方法重現(xiàn)性試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳提取方法和條件后，同時(shí)做5個(gè)平行試驗(yàn)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.7 抗氧化性研究 根據(jù)最優(yōu)提取方法提取百合花總黃酮，按比例稀釋成不同濃度的溶液(0.010 0、0.012 5、0.016 7、0.025 0、0.050 0 mg/mL)進(jìn)行1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)清除能力試驗(yàn)。取2 mL稀釋后的各濃度百合花瓣提取液及2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，加入同一具塞試管中，搖勻，在室溫下密閉靜置30 min，用純?nèi)軇┳鲄⒈龋?17 nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)以下公式計(jì)算百合花黃酮提取液對(duì)DPPH自由基的清除率：

DPPH·清除率=[1-(D517 nm1-D517 nm2)/D517 nm0]×100%。

式中：D517 nm1為加提取液后DPPH溶液的吸光度；D517 nm2為提取液的吸光度；D517 nm0為未加提取液時(shí)DPPH溶液的吸光度。

以同樣的方法測(cè)定相同濃度維生素C溶液對(duì)DPPH·的清除能力，作為對(duì)照。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS 13.0軟件進(jìn)行處理并作差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溫度對(duì)龍牙百合花總黃酮提取量的影響

從圖1可以看出，在料液比為1 g ∶40 mL、乙醇濃度為70%、提取時(shí)間為30 min的條件下，總黃酮提取量隨著溫度的升高呈上升趨勢(shì)，但是到達(dá)一定溫度后，總黃酮提取量趨于穩(wěn)定；在溫度為70、80 ℃時(shí)總黃酮提取量最高，與其他溫度處理差異顯著。從節(jié)約能源、效益綜合考慮，70 ℃為最佳提取溫度。

2.2 乙醇濃度對(duì)龍牙百合花總黃酮提取量的影響

由圖2可知，在料液比為1 g ∶40 mL、提取時(shí)間為 30 min、提取溫度為70 ℃的條件下，總黃酮提取量隨著乙醇濃度的升高大致呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；在乙醇濃度為70%時(shí)，總黃酮提取量最高，隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加，總黃酮提取量逐漸降低，這可能與過(guò)高的乙醇濃度會(huì)導(dǎo)致更多的雜質(zhì)析出，從而降低總黃酮的提取量有關(guān)[7]。由結(jié)果可知，提取總黃酮的最佳乙醇濃度為70%。

2.3 料液比對(duì)龍牙百合花總黃酮提取量的影響

由圖3可知，在提取溫度為70 ℃、乙醇濃度為70%、提取時(shí)間為30 min、不同料液比的條件下，隨著溶劑量的增大，龍牙百合花總黃酮提取量整體呈降低趨勢(shì)；在料液比為 1 g ∶10 mL 的條件下，總黃酮提取量最高。由結(jié)果可知，最佳料液比為1 g ∶10 mL。

2.4 提取時(shí)間對(duì)龍牙百合花總黃酮提取量的影響

在提取溫度為70 ℃、乙醇濃度為70%、料液比為 1 g ∶10 mL 的條件下，隨著提取時(shí)間的增加，總黃酮提取量呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)；當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)40 min后，再增加提取時(shí)間，總黃酮提取量變化不顯著(圖4)。從提取效果及節(jié)約時(shí)間的角度考慮，龍牙百合花總黃酮提取的最佳時(shí)間應(yīng)控制在40 min。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2、表3可以看出，C(料液比)對(duì)總黃酮提取量的影響最大，其極差在4個(gè)因素中最大。經(jīng)分析，料液比對(duì)總黃酮提取量的影響極顯著(P<0.01)，其他因素對(duì)總黃酮提取量的影響不顯著。R值越大，說(shuō)明該因素的水平變動(dòng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越大，4個(gè)因素對(duì)龍牙百合花總黃酮提取量的影響順序?yàn)镃(料液比)>B(提取劑濃度)>A(提取溫度)>D(提取時(shí)間)，最優(yōu)水平為A1B1C1D2，即提取溫度為60 ℃、乙醇濃度為60%、料液比為1 g ∶5 mL、提取時(shí)間為40 min時(shí)，提取效果最好。

表2 4因素3水平正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的單變量方差分析結(jié)果

2.6 方法重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)最優(yōu)提取方法，同時(shí)做5個(gè)平行樣品進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得總黃酮平均提取量為75.034 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.07%，提取物總黃酮提取量高于所有正交試驗(yàn)結(jié)果，表明提取工藝穩(wěn)定合理，重現(xiàn)性較好。

2.7 不同濃度龍牙百合花總黃酮提取液與維生素C的體外抗氧化能力比較

從圖5可以看出，在樣品濃度為0.010 0～0.050 0 mg/mL 的范圍內(nèi)，龍牙百合花總黃酮提取液和維生素C溶液對(duì)DPPH·的清除效果均隨藥液濃度的升高而增加，且總黃酮提取液對(duì)DPPH·的清除率始終優(yōu)于相同濃度下的維生素C溶液。經(jīng)方差分析，龍牙百合花總黃酮提取液與維生素C在相同濃度下，對(duì)DPPH·的清除效果總體上差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以龍牙百合花為原料，采用超聲波輔助乙醇溶劑法提取龍牙百合花中有效成分黃酮，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝。結(jié)果表明，影響龍牙百合

花總黃酮提取量的因素排序?yàn)榱弦罕?提取劑濃度>提取溫度>提取時(shí)間；最佳工藝：提取溫度60 ℃，乙醇濃度60%，料液比1 g ∶5 mL，提取時(shí)間40 min。在優(yōu)化的工藝條件下，總黃酮的提取量為75.034 mg/g。

體外抗氧化試驗(yàn)研究中，以清除DPPH·較為常見(jiàn)的天然抗氧化劑維生素C為對(duì)照。結(jié)果表明，隨著濃度的增加，龍牙百合花總黃酮提取液和維生素C溶液對(duì)DPPH·的清除能力都呈逐漸增加的趨勢(shì)，龍牙百合花總黃酮提取液對(duì) DPPH·的清除能力總體上顯著優(yōu)于相同濃度的維生素C溶液，說(shuō)明龍牙百合花總黃酮在體外具有較好的清除DPPH·的能力，但在人體內(nèi)清除自由基的能力還需要進(jìn)一步的研究。

料液比試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著料液比增加，總黃酮提取量呈逐漸下降的現(xiàn)象，這與其他研究結(jié)論不符[8-9]。這是由于料液比起始值(1 g ∶10 mL)選擇較大導(dǎo)致的，雖然在正交試驗(yàn)中，選擇了較小的料液比(1 g ∶5 mL)，但從綜合試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，料液比可能仍有較大的改善空間，這是今后進(jìn)一步研究中應(yīng)該注意的。

[1]劉峻蓉. 食用百合栽培技術(shù)[J]. 北方園藝，2005(1)：26-27.

[2]陳立德，劉新桃，蔣盛巖，等. 龍牙百合花氨基酸含量的柱前衍生OPA-HPLC法測(cè)定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(18)：10832-10833，10836.

[3]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979：857.

[4]李八方. 功能保健食品[M]. 青島：青島海洋大學(xué)出版社，1998.

[5]方 菊. 竹葉黃酮的提取分離有抑菌效果研究[D]. 合肥：合肥工業(yè)大學(xué)，2012.

[6]彭程程，王青山，趙國(guó)祥，等. 黃酮類(lèi)化合物的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2010(5)：38-41，43.

[7]任廷遠(yuǎn)，安玉紅，王 華，等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波柑橘皮渣發(fā)酵液中總黃酮的提取工藝研究[J]. 食品與發(fā)酵科技，2010，46(1)：77-81，99.

[8]楊申明，王振吉，沈繼森. 彝藥豬鬃草中總黃酮提取工藝研究[J]. 北方園藝，2014(11)：125-129.

[9]田春蓮，蔣鳳開(kāi). 茜草總黃酮提取工藝研究[J]. 食品科學(xué)，2011，32(24)：60-63.

10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.054

2015-11-24

重慶市教委科研項(xiàng)目(編號(hào)：KJ1401129)。

薛 梅(1973—)，女，重慶人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事植物生理、植物種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)與利用等研究。E-mail：xuemei.1998@163.com。

李曉英，碩士，副教授，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)的提取與檢測(cè)。E-mail：lxyi2@126.com。

Q946-3；R284.2

A

1002-1302(2017)02-0182-03

薛 梅，李曉英，周衛(wèi)平. 龍牙百合花總黃酮提取工藝及抗氧化性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(2)：182-184.