程偉，韓超，范郁會(huì)

(西安市高新醫(yī)院泌尿外科，陜西 西安 710006)

白花蛇舌草通過JAK2/STAT3通路途經(jīng)誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡

程偉，韓超，范郁會(huì)

(西安市高新醫(yī)院泌尿外科，陜西 西安 710006)

目的研究白花蛇舌草對膀胱癌T24細(xì)胞凋亡的影響及其潛在機(jī)制。方法MTT法檢測不同濃度白花蛇舌草對T24增殖的抑制作用，AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，Western blot檢測細(xì)胞中JAK2、STAT3、Bax、Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)情況。結(jié)果白花蛇舌草明顯抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖同時(shí)誘導(dǎo)其凋亡，且作用強(qiáng)度隨著濃度的增加而增加。Western blot檢測證實(shí)白花蛇舌草能夠顯著抑制細(xì)胞中JAK2、STAT3和Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax和Caspase-3表達(dá)。結(jié)論白花蛇舌草能夠抑制膀胱癌細(xì)胞T24增殖，促進(jìn)其凋亡，可能與抑制JAK2/STAT3通路有關(guān)。

白花蛇舌草；膀胱癌細(xì)胞；JAK2；STAT3

目前，越來越多的中草藥被用于臨床各種腫瘤的預(yù)防和治療。作為我國最常見的中藥—白花蛇舌草，具有強(qiáng)大的藥用價(jià)值，例如清熱解毒、活血化瘀、利水消腫及抗腫瘤[1]。不少研究已經(jīng)證實(shí)白花蛇舌草能夠有效抑制肝癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞增長并且誘導(dǎo)凋亡，但對膀胱癌細(xì)胞的作用研究較少[2]。膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的一種惡性腫瘤，并且近年來發(fā)病率呈現(xiàn)增高趨勢[3]。因此，本研究探索白花蛇舌草對膀胱癌細(xì)胞T24增殖和凋亡的影響以及作用機(jī)制，為臨床膀胱癌的治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 藥物和細(xì)胞 白花蛇舌草購自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂醫(yī)院，批號為09072201，人膀胱癌T24細(xì)胞株購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 試劑材料 RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，MTT試劑盒購自Biosharp公司，Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒購自中國艾美捷科技公司?？贵wJAK2、STAT3、Bcl-2、Bax和Caspase-3均購自美國Cell Signaling公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將人膀胱癌T24細(xì)胞接種于RPMI1640培養(yǎng)液中，其中含有10%胎牛血清、100μ/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，常規(guī)培養(yǎng)在溫度為37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長貼壁時(shí)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測白花蛇舌草對T24細(xì)胞增殖的影響 將對數(shù)生長期的T24細(xì)胞濃度調(diào)整為1胞濃度5個(gè)/mL，吸取200 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長貼壁后棄上清液，分別加入質(zhì)量濃度為1 mg/mL、2 mg/mL和5 mg/mL的白花蛇舌草誘導(dǎo)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置空白對照組，不同濃度梯度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各自培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)共培養(yǎng)4 h，棄掉上清液，每孔加入200 μL DMSO，振蕩使其藍(lán)紫色顆粒完全溶解。置于Ascent酶標(biāo)儀490 nm下檢測每孔OD值。

1.5 AnnexinV-FITC/PI染色法檢測白花蛇車草對T24細(xì)胞凋亡的影響 收集空白對照組細(xì)胞和不同濃度的藥物組(1 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL)培養(yǎng)24 h后細(xì)胞，室溫條件下以2 000 r/min進(jìn)行離心10 min，棄去上清液，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞，再次進(jìn)行2 000 r/min離心10 min，洗滌細(xì)胞，加入300 μL Binging Buffer懸浮，加入5 μLAnnexinV-FITC混勻，室溫孵育15 min，上機(jī)前5 min，加入5 μL PI以及200 μL的AnnexinV-FITC，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.6 Western blot檢測各組細(xì)胞JAK2、STAT3、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá) 分別加入蛋白裂解液置于各組已經(jīng)收集的細(xì)胞，提取其蛋白含量并進(jìn)行定量分析。每個(gè)樣品孔加入25 μg蛋白，各組細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，37°C下進(jìn)行1%BSA封閉1 h，依次加入1:1 000稀釋的JAK2、STAT3、Bcl-2、Bax和Caspase-3多克隆抗體，加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，37℃溫度下反應(yīng)1 h，PBS洗膜5次。染色，曝光，采用BIORAD GELDOC XR凝膠成像系統(tǒng)依次顯影、定影，Quantity One Basic軟件分析蛋白條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用最小顯著差法(least significant difference，LSD)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 白花蛇舌草對T24細(xì)胞增殖的抑制作用 與空白對照組比較，不同濃度的白花蛇舌草預(yù)處理均能夠減少T24細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值，并且呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 不同濃度白花蛇舌草對T24細(xì)胞OD值的影響(±s)

表1 不同濃度白花蛇舌草對T24細(xì)胞OD值的影響(±s)

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與1 mg/mL白花蛇舌草比較，bP＜0.05；與1 mg/mL白花蛇舌草比較，cP＜0.05。

組別24 h 48 h 72 h空白對照組1 mg/mL白花蛇舌草2 mg/mL白花蛇舌草5 mg/mL白花蛇舌草F值P值0.150+0.008 0.135+0.007a0.124+0.008ab0.109+0.008abc137.000 0.000 0.258+0.007 0.241+0.010a0.220+0.009ab0.208+0.007abc196.000 0.000 0.364+0.012 0.341+0.008a0.320+0.009ab0.304+0.011abc265.000 0.000

2.2 白花蛇舌草對T24細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用 相比于空白對照組，不同濃度的白花蛇舌草預(yù)處理均能增加T24細(xì)胞的凋亡，并且呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=189.247，P＜0.05)，見圖1。

2.3 白花蛇舌草對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 相比于空白對照組，不同濃度的白花蛇舌草預(yù)處理均能夠抑制Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax和Caspase-3表達(dá)，并且呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系，各組Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相對表達(dá)比較分析得知F值分別為268.457、138.492和164.159，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

2.4 白花蛇舌草對JAK2/STAT3信號通路的影響 相比于空白對照組，不同濃度的白花蛇車草預(yù)處理均能夠抑制JAK2和STAT3表達(dá)，并且呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系，各組JAK2和STAT3蛋白相對表達(dá)比較分析得知F值分別為284.164和361.178，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

圖1 白花蛇舌草對T24細(xì)胞凋亡的影響

圖2 白花蛇舌草對T24細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 白花蛇舌草對T24細(xì)胞JAK2/STAT3相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

膀胱癌是一種最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，復(fù)發(fā)性強(qiáng)的同時(shí)治療費(fèi)用高，給人們的生活帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的公眾健康問題[4-6]。白花蛇舌草是一種常用的抗腫瘤中藥，臨床上已經(jīng)證實(shí)白花蛇舌草對胃癌、肺癌、淋巴癌、肝癌以及婦科腫瘤具有較好的療效，但是其作用機(jī)制尚不明確[7-10]。本研究探討了白花蛇舌草對膀胱癌細(xì)胞體外增殖和凋亡的影響以及作用機(jī)制。

本研究中，不同濃度白花蛇舌草處理膀胱癌T24細(xì)胞，MTT結(jié)果顯示不同濃度白花蛇舌草均能夠抑制T24細(xì)胞增殖，并且呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)檢測對其細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明濃度越高對膀胱癌細(xì)胞T24的凋亡作用具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。因此，筆者可以推斷白花蛇舌草能夠抑制膀胱癌細(xì)胞增殖并且誘導(dǎo)凋亡。

研究表明，惡性腫瘤的發(fā)生常常與細(xì)胞周期調(diào)控失常有密切關(guān)系。本研究中分析了白花蛇車草對膀胱癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。Western blot結(jié)果顯示不同濃度白花蛇舌草均能夠上調(diào)Bax和Caspase-3的表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)。JAKs家族和STATs家族廣泛分布于各種組織和細(xì)胞中，JAK-STATs信號通路調(diào)控著細(xì)胞增殖、分化和凋亡等重要途徑，該通路的異常激活能夠?qū)е录?xì)胞的過度增殖和惡性轉(zhuǎn)化。本研究在探索白花蛇舌草對膀胱癌細(xì)胞增殖凋亡作用機(jī)制的時(shí)候，采用Western blot分析細(xì)胞經(jīng)過不同濃度白花蛇舌草處理后JAK2和STAT3的表達(dá)情況。很明顯，不同濃度白花蛇舌草能夠顯著抑制細(xì)胞內(nèi)JAK2和STAT3的表達(dá)，并且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。因此，我們推斷白花蛇舌草抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖以及誘導(dǎo)其凋亡可能與抑制其JAK2/STAT3信號通路有關(guān)。

綜上所述，白花蛇舌草能夠有效抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，這可能與抑制JAK2/STAT3信號通路有關(guān)，這為臨床治療膀胱癌提供了理論基礎(chǔ)。

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Herba Hedyotis Diffusae induces human bladder cancer T24 cells apoptosis through inhibiting JAK2/STAT3 signaling pathways.

CHENG Wei,HAN Chao,FAN Yu-hui.Department of Urological Surgery,Xi'an Gaoxin Hospital, Xi'an 710006,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of Herba Hedyotis Diffusae on human bladder cancer cells T24 cells apoptosis and its possible molecular mechanism.MethodsAfter treated with different concentrations of Herba Hedyotis Diffusae,MTT assay was used to detect the inhibitory effect of Herba Hedyotis Diffusae on proliferation of T24 cells.AnnexinV-FITC/PI double labeled flow cytometry was used to detect the apoptosis rate.The expression of janus kinase 2(JAK2),signal transducer and activator of transcription 3(STAT3),Bax,Caspase-3,Bcl-2 in cells were detected by Western blot.ResultsHerba Hedyotis Diffusae significantly inhibited the T24 cells proliferation and induced apoptosis in a dose-dependent manner.Western blot results showed that Herba Hedyotis Diffusae significantly inhibited the expression of JAK2,STAT3 and Bcl-2,and up-regulated Bax and Caspase-3 expression.ConclusionHerba Hedyotis Diffusae could inhibite proliferation of bladder cancer T24 cells and induce apoptosis,and the mechanism maybe through inhibiting the JAK2/STAT3 signaling pathways.

Herba Hedyotis Diffusae;Bladder cancer cells;Janus kinase 2(JAK2);Signal transducer and activator of transcription 3(STAT3)

R737.14

A

1003—6350(2017）01—0014—03

2016-07-08)

韓超。E-mail：331226224@qq.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.004