韓忠學(xué)，鞏靜，胡永勝，孫小杰，劉靜

(1.武警遼寧省總隊(duì)醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2.武警遼寧省總隊(duì)醫(yī)院普外科，遼寧 沈陽(yáng) 110034；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院中醫(yī)科，遼寧 沈陽(yáng) 110004)

薄芝糖肽聯(lián)合胸腺法新對(duì)胃癌放化療大鼠免疫功能的影響

韓忠學(xué)1，鞏靜1，胡永勝2，孫小杰3，劉靜1

(1.武警遼寧省總隊(duì)醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2.武警遼寧省總隊(duì)醫(yī)院普外科，遼寧 沈陽(yáng) 110034；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院中醫(yī)科，遼寧 沈陽(yáng) 110004)

目的探討薄芝糖肽聯(lián)合胸腺法新對(duì)經(jīng)放化療的胃癌大鼠免疫功能的影響。方法選取104只成功造模的胃癌大鼠，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(50只)和觀察組(54只)，兩組大鼠均進(jìn)行放療(10～12 Gy)、化療(順鉑+5-氟尿嘧啶)并同時(shí)給予胸腺法新治療，觀察組大鼠在此基礎(chǔ)上給予薄芝糖肽治療，共治療15 d。比較兩組大鼠治療前、后免疫功能的改變情況。結(jié)果兩組大鼠治療后血清CD3、CD4、自然殺傷細(xì)胞(NK)、IgG、IgM、IgA濃度與CD4/CD8較治療前有所降低，CD8較治療前有所升高，且觀察組大鼠的血清CD3、CD4、CD4/CD8、IgG、IgM、IgA濃度明顯高于對(duì)照組，CD8明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；兩組大鼠治療后IL-2、IL-4濃度較治療前有所降低，且觀察組IL-2濃度明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；兩組大鼠治療后IL-6、IL-12濃度較治療前有所升高，且觀察組IL-6濃度明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論行放化療的胃癌大鼠給予薄芝糖肽聯(lián)合胸腺法新治療有助于改善大鼠的免疫功能，為臨床實(shí)踐提供一定理論基礎(chǔ)。

大鼠；胃癌；薄芝糖肽；胸腺法新；放化療；免疫功能

胃癌是發(fā)病率最高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。我國(guó)是胃癌高發(fā)國(guó)家，且發(fā)病率逐年提高，其主要原因是生活水平的提高導(dǎo)致飲食種類更加豐富。手術(shù)結(jié)合放化療是目前最常用的治療方案，其中手術(shù)為首選治療方案，但是對(duì)于一些晚期失去手術(shù)機(jī)會(huì)的患者來(lái)說(shuō)只能采取放化療，但放化療僅有40%～50%的臨床療效，放化療的同時(shí)給患者帶來(lái)了很多副反應(yīng)，機(jī)體自身免疫反應(yīng)亦遭受破壞[1-3]。薄芝糖肽是一種與靈芝多糖具有相似藥理學(xué)作用的糖肽類物質(zhì)，它是從靈芝屬薄樹芝中分離出來(lái)的，有一定的調(diào)節(jié)免疫力及其抗腫瘤活性，在腫瘤的輔助性治療中廣泛應(yīng)用[4]。胸腺法新是一種免疫調(diào)節(jié)劑，能很好的增強(qiáng)機(jī)體免疫力，增加機(jī)體免疫力來(lái)發(fā)揮抗腫瘤活性[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立胃癌大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，給予相應(yīng)的臨床治療，評(píng)估治療前后的免疫學(xué)狀態(tài)，能夠給臨床實(shí)踐提供一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與胃癌細(xì)胞株的選擇 挑選144只健康且性成熟的Wistar大鼠(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：LD20140032)，周齡8～10周，體質(zhì)量230～250 g(雄鼠)、210～230 g(雌鼠)；人BGC823胃癌細(xì)胞株由上海市腫瘤研究所提供。造模前雌雄大鼠分開(kāi)飼養(yǎng)，自由飲水取食，人工控溫20℃～26℃，12 h光照，12 h黑暗，兩組大鼠的周齡、雌雄比、體質(zhì)量等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠周齡、體質(zhì)量、性別比較(±s)

表1 兩組大鼠周齡、體質(zhì)量、性別比較(±s)

組別對(duì)照組(n=72)觀察組(n=72)周齡(周) 8.63±1.34 8.78±1.87體質(zhì)量(g) 251.32±34.54 248.78±31.51雄：雌[例(%)] 40（55.56）：32（44.44）38（52.78）：34（47.22）t/χ2值P值0.337 0.738 0.531 0.483 0.112 0.738

1.1.2 主要試劑 薄芝糖肽注射液由北京賽升藥業(yè)提供；胸腺法新由成都地奧九泓制藥有限公司提供(3.6 mg/支，白色粉末狀)；5-氟尿嘧啶(5-FU)與順鉑均為齊魯制藥有限公司提供；酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒(IL-2、IL-4、IL-6、IL-12)由美國(guó)Sigma公司提供；淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-hypque)為美國(guó)Sigma公司提供；Ig-Grl-FITC/IgGr2a-PE、CD3-FITC/CD4-PE、CD3-FITC/ CD8-PE和FACS Lysing Solution溶血素為BD公司產(chǎn)品；IgG、IgM、IgA體液免疫指標(biāo)檢測(cè)采用美國(guó)BD公司提供的雙色熒光試劑盒。

1.1.3 主要儀器 AxSYM型全自動(dòng)免疫發(fā)光分度儀與FACSCalibur流式細(xì)胞儀均為美國(guó)雅培公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模方案[6]人BGC823胃癌細(xì)胞株傳代培養(yǎng)后，制成活細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為1.0×107/mL)，在每只大鼠大腿內(nèi)側(cè)近腹股溝處皮下接種0.5 mL，制作胃癌大鼠動(dòng)物模型，此模型經(jīng)過(guò)大鼠臨床表現(xiàn)、癥狀體征確定成功后才可以進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 治療方案 兩組大鼠均給予連續(xù)放化療15 d+胸腺法新注射液。放射劑量為10～12 Gy，進(jìn)一步采取化療方案(第1天腹腔注順鉑6 mg·kg-1·d-1，第10天注射5-氟尿嘧啶10 mg·kg-1·d-1，連續(xù)化療15 d，同時(shí)每隔1 d給予腹腔注射胸腺法新0.5 mg·kg-1·d-1，觀察組在此基礎(chǔ)上每天給予腹腔注射薄芝糖肽注射液2 mL(含5 mg多糖、1 mg多肽)。胸腺法新、5-氟尿嘧啶、順鉑粉末均溶解于0.9%的生理鹽水中(1 mg/mL)配成混懸液，用注射器腹腔注射液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 免疫指標(biāo)(細(xì)胞免疫、體液免疫、相關(guān)細(xì)胞因子)的測(cè)定 抽取靜脈血3 mL，注入玻璃試管中，靜置10 min，以3 000 r/min離心10 min，分離血清在-70℃超低溫冰箱內(nèi)保存待測(cè)，采用流式細(xì)胞儀細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)外周血T細(xì)胞亞群(CD3、CD4、CD8)水平，用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離外周血有核細(xì)胞，外周血中有核細(xì)胞染色標(biāo)記30 min，棄去上清液，沖洗兩次后上機(jī)檢測(cè)。免疫散射比濁法檢測(cè)免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)；酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-12(檢測(cè)時(shí)按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行)，所取標(biāo)本均在1周內(nèi)測(cè)定，結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)量資料不同組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)量資料組內(nèi)治療前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模情況 144只大鼠成功造模104只，其中雄鼠56只，雌鼠48只，40只造模失敗，其中造模過(guò)程中死亡16只(40.00%)、造模后出現(xiàn)無(wú)法進(jìn)食13只(32.50%)、造模未達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需的胃癌模型11只(27.50%)。其中對(duì)照組造模成功50只、失敗22只；觀察組成功54只、失敗18只，兩組造模成功率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.554，P=0.457＞0.05)。治療中共死亡16只(對(duì)照組8只，觀察組8只)，兩組大鼠治療過(guò)程中死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.028，P=0.867＞0.05)，完成實(shí)驗(yàn)的大鼠共88只(對(duì)照組42只，觀察組46只)。

2.2 兩組大鼠治療前后細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能和相關(guān)細(xì)胞因子比較 兩組造模大鼠治療前免疫功能(細(xì)胞免疫、體液免疫、相關(guān)細(xì)胞因子)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。兩組大鼠治療后血清自然殺傷細(xì)胞(NK)、CD4、CD3、IgA、IgG、IgM濃度及CD4/CD8跟治療前相比有所降低(P＜0.05)，CD8比治療前有所升高(P＜0.05)；治療后觀察組患者血清IgG、IgA、IgM、CD3、CD4/CD8、CD4濃度明顯的高于對(duì)照組(P＜0.05)，觀察組比對(duì)照組CD8低(P＜0.05)；兩組大鼠治療后IL-2、IL-4濃度較治療前有所降低(P＜0.05)，且觀察組IL-2濃度明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)；兩組大鼠治療后IL-6、IL-12濃度比治療前升高(P＜0.05)，且觀察組IL-6濃度明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)表2、表3。

表2 兩組大鼠治療前后細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能比較(±s)

表2 兩組大鼠治療前后細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能比較(±s)

注：治療后與對(duì)照組比較，aP＜0.05。

組別對(duì)照組(n=72)治療前治療后t值P值觀察組(n=72)治療前治療后t值P值CD3(%)CD4(%)CD8(%)CD4/CD8NK IgG IgM IgA 72.64±8.54 62.47±8.37 -4.342＜0.01 46.64±6.76 34.57±6.34 -3.447＜0.01 31.65±5.43 35.67±6.47 2.436＜0.01 1.47±0.21 0.97±0.15 -3.452＜0.01 22.65±4.21 17.32±2.45 -3.326＜0.01 14.76±3.56 10.32±2.12 -3.342＜0.01 1.84±0.21 1.53±0.21 -2.437＜0.01 2.64±0.36 2.12±0.37 -1.576＜0.01 71.94±9.56 65.21±7.53a-5.763＜0.01 45.92±7.45 39.41±7.34a-4.375＜0.01 30.89±5.76 32.31±4.52a3.672＜0.01 1.49±0.23 1.22±0.24a-2.324＜0.01 21.97±3.53 18.73±3.32a-2.452＜0.01 14.72±2.67 11.56±2.63a-1.325＜0.01 1.85±0.24 1.64±0.23a-2.546＜0.01 2.61±0.42 2.38±0.45a-0.324＜0.01

表3 兩組大鼠治療前后免疫相關(guān)細(xì)胞因子水平比較(±s)

表3 兩組大鼠治療前后免疫相關(guān)細(xì)胞因子水平比較(±s)

注：治療后免疫相關(guān)細(xì)胞因子水平明顯低于治療前，aP＜0.05。

組別IL-2(pg/mL)IL-4(ng/L)IL-6(pg/mL)IL-12(ng/L對(duì)照組(n=72)治療前治療后t值P值觀察組(n=72)治療前治療后t值P值) 2.62±0.31 1.71±0.23 -2.436＜0.01 5.57±0.62 5.04±0.63 -1.547＜0.01 4.67±0.58 5.68±0.79 2.437＜0.01 3.62±0.52 4.83±0.83 3.561＜0.01 3.65±0.62 5.21±0.78a2.436＜0.01 2.59±0.36 2.11±0.31a-3.436＜0.01 5.53±0.67 5.21±0.76a-3.567＜0.01 4.61±0.71 5.10±0.84a2.214＜0.01

3 討 論

遠(yuǎn)端型為我國(guó)胃癌發(fā)病的主要類型，但近年來(lái)胃癌有逐漸向近端型發(fā)展的趨勢(shì)。中低分化的腺癌為主要病理類型，分化程度、病理類型、發(fā)病部位均將影響患者的預(yù)后。生活水平的提高導(dǎo)致飲食類型的改變，這導(dǎo)致我國(guó)胃癌近年來(lái)的發(fā)病部位向近端型發(fā)展[7]。過(guò)去針對(duì)胃癌的治療以手術(shù)結(jié)合放化療為主。胃癌晚期患者失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，便以放化療為主，但放化療有毒副反應(yīng)大及患者副反應(yīng)較多的缺點(diǎn)，很多患者因此不能堅(jiān)持治療。雖然腫瘤得到了很好的抑制，但是放化療同時(shí)損傷機(jī)體自身免疫功能。腫瘤侵蝕壓迫周圍組織導(dǎo)致正常細(xì)胞新陳代謝與營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)受到損傷，因此這些都大大降低了放化療的臨床療效。往往在臨床中需要配合使用一些輔助性的藥物以增強(qiáng)并調(diào)節(jié)放化療導(dǎo)致的免疫功能降低，此外也能更好地對(duì)微小病灶的腫瘤細(xì)胞實(shí)施有效的殺傷[8]。順鉑+5-氟尿嘧啶化療是有著優(yōu)良臨床使用經(jīng)驗(yàn)的化療方案，但同時(shí)存在的副反應(yīng)多(骨髓抑制、胃腸反應(yīng)為主)及其患者耐受性差的缺點(diǎn)，大大降低了臨床療效[6]。薄芝糖肽是臨床中使用較廣泛的一種免疫調(diào)節(jié)劑，是腫瘤患者化療輔助性用藥，能通過(guò)抗自由基、保護(hù)免疫細(xì)胞膜、保護(hù)肝臟解毒功能來(lái)抗腫瘤。研究表明：薄芝糖肽在發(fā)揮抗腫瘤作用上主要是通過(guò)促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟與分化、增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別性、直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)的，特別是在消化道惡性腫瘤的輔助性治療中取得了很好的臨床療效[4]。胸腺法新又稱胸腺肽α1(thymosin alpha-1)，是由28個(gè)氨基酸組成的小分子多肽類免疫制劑，目前已經(jīng)可以化學(xué)合成。主要通過(guò)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞在胸腺內(nèi)的增生、分化與成熟來(lái)發(fā)揮其免疫作用的[9]。蔡鵬等[10]研究了胸腺法新應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌化療過(guò)程中對(duì)免疫功能的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為：經(jīng)長(zhǎng)春瑞濱+順鉑化療方案的兩組患者，其中試驗(yàn)組是在該化療方案的基礎(chǔ)上加用胸腺法新每次1.6 mg，2次/周?；熃Y(jié)束后，試驗(yàn)組患者外周血清CD3、CD4、CD4/CD8和NK細(xì)胞水平均較高于對(duì)照組，CD8水平低于對(duì)照組，證實(shí)了該化療藥物的免疫調(diào)節(jié)作用，針對(duì)T淋巴細(xì)胞的免提調(diào)節(jié)性作用較強(qiáng)。

T淋巴細(xì)胞(亞群包括CD3、CD4、CD8等)參機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。惡性腫瘤患者免疫功能嚴(yán)重受到抑制，免疫細(xì)胞濃度降低。流式細(xì)胞儀檢查發(fā)現(xiàn)參與機(jī)體特異性免疫反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞亞群(CD3、CD4、CD8)數(shù)量均明顯減少[11]。機(jī)體內(nèi)的體液免疫主要載B淋巴細(xì)胞所分泌的抗體(IgG、IgM、IgA)來(lái)實(shí)現(xiàn)體液免疫反應(yīng)應(yīng)答，其抗體濃度高低直接反應(yīng)其活力強(qiáng)弱，是機(jī)體內(nèi)重要的免疫球蛋白[12]。兩組大鼠治療后血清CD3、CD4、自然殺傷細(xì)胞(NK)、IgG、IgM、IgA濃度與CD4/CD8較治療前有所降低(P＜0.05)，CD8較治療前有所升高(P＜0.05)；治療后觀察組患者血清CD3、CD4、CD4/CD8、IgG、IgM、IgA濃度明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，觀察組CD8較對(duì)照組低(P＜0.05)；兩組大鼠治療后IL-2、IL-4濃度較治療前有所降低(P＜0.05)，且觀察組IL-2濃度明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)；兩組大鼠治療后IL-6、IL-12濃度較治療前有所升高(P＜0.05)，且觀察組IL-6濃度標(biāo)明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，其中細(xì)胞免疫學(xué)變化情況與蔡鵬等[10]研究肺癌結(jié)果相同。

本研究通過(guò)大鼠胃癌動(dòng)物模型的建立來(lái)證實(shí)胃癌放化療過(guò)程中免疫制劑輔助治療的重要性，采用薄芝糖肽與胸腺法新兩種免疫調(diào)節(jié)劑來(lái)改善免疫功能，很好的指導(dǎo)臨床實(shí)踐。免疫功能與營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)是相輔相成、互相影響的，今后我們還將從胃癌大鼠的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的改變?nèi)ド钊胙芯俊?/p>

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Effects of ganoderma's glycopeptide combined with thymalfasin on immune function in rats with gastric cancer treated by chemoradiotherapy.

HAN Zhong-xue1,GONG Jing1,HU Yong-sheng2,SUN Xiao-jie3,LIU Jing1. 1.Department of Clinical Laboratory,Liaoning Provincial Corps Hospital of Chinese People's Armed Police Forces,Shenyang 110034,Liaoning,CHINA;2.Department of General Surgery,Liaoning Provincial Corps Hospital of Chinese People's Armed Police Forces,Shenyang 110034,Liaoning,CHINA;3.Department of Traditional Chinese Medicine,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,Liaoning,CHINA

ObjectiveTo study the effects of ganoderma′s glycopeptide combined with thymalfasin on immune function in rats with gastric cancer treated by chemoradiotherapy.MethodsA total of 104 gastric cancer rat models were successfully established and divided into two groups using random number table:observation group(n=50), control group(n=54).The rats were all treated by radiotherapy(10～12 Gy),chemotherapy(cisplatin+5-fluorouracil),and thymalfasin,and the rats in the observation group were additionally given ganoderma′s glycopeptide.The course of treatment was 15 days.The indexes of immune function in the two groups of rats were compared before and after treatment.ResultsThe levels of CD3,CD4,natural killer(NK)cell,IgG,IgM,IgA,IL-2,IL-4,and CD4/CD8 after treatment were lower than those before treatment(P＜0.05),and the levels of CD8 and IL-6,IL-12 were higher than that before treatment(P＜0.05).After treatment,the levels of CD3,CD4,CD4/CD8,IgG,IgM,IgA,IL-2 in the observation group were higher than those in the control group(P＜0.05),and the levels of CD8 and IL-6 were lower than those in the control group(P＜0.05).ConclusionGanoderma′s glycopeptide combined with thymalfasin can improve the immune function in rats with gastric cancer treated by chemoradiotherapy,and provide certain theoretical basis for clinical practice.

Rat;Gastric cancer;Ganoderma′s glycopeptide;Thymalfasin;Chemoradiotherapy;Immune function

R-332

A

1003—6350（2017）01—0017—03

2016-05-26)

劉靜。E-mail：jiayy813@126.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.005