鄭 建，馬仕昆，陳 建

食管癌組織中PR-SET7的表達(dá)及其與臨床特征、增殖細(xì)胞核抗原的相關(guān)性

鄭 建，馬仕昆，陳 建

目的 探討賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Lysine methyltransferase, KMT) PR-SET7在食管癌組織中的表達(dá)及其與臨床特征、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)之間的相關(guān)性。方法 選擇2010-06至2011-02住院的食管癌患者32例，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)食管癌組織和癌旁組織中PR-SET7和PCNA的表達(dá)，并分析PR-SET7表達(dá)量與患者性別、年齡、細(xì)胞分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征的相關(guān)性，以及PR-SET7的表達(dá)情況和PCNA指數(shù)之間的相關(guān)性。結(jié)果 PR-SET7及PCNA均以核表達(dá)為主，癌組織中PR-SET7及PCNA的表達(dá)明顯強(qiáng)于癌旁組織，其中PR-SET7高表達(dá)率為81.25%，癌旁組織中以低表達(dá)為主，高表達(dá)率為15.62%(P<0.01)；PCNA指數(shù)癌組織中為68.12±16.03，癌旁組織38.22±20.56，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PR-SET7在食管癌中的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P<0.05)，與患者的性別、年齡無相關(guān)性(P>0.05)。PR-SET7的表達(dá)程度和PCNA指數(shù)有相關(guān)性(rs=0.551，P=0.001)。結(jié)論 食管癌組織中PR-SET7異常表達(dá)，其表達(dá)水平可能與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)；PR-SET7的表達(dá)與PCNA指數(shù)有顯著相關(guān)性，對(duì)探討其作用機(jī)制有一定意義。

賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶；增殖細(xì)胞核抗原；食管癌；表達(dá)；預(yù)后

PR-SET7是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)唯一能夠特異性單甲基化組蛋白H4賴氨酸20位(histone H4 lysine20，H4K 20)的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Lysine methyltransferase, KMT)[1,2]，又稱SETD8、SET8、KMT5a，它們與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)密切相關(guān)[3]。Takawa等[4]發(fā)現(xiàn)，PR-SET7在肝癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中的表達(dá)均增強(qiáng)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是DNA合成所必需的，PCNA表達(dá)增強(qiáng)，說明細(xì)胞處于增生活躍期[5]。我們通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)食管癌組織中PR-SET7及PCNA的表達(dá)，并初步探討食管癌組織中PR-SET7的表達(dá)及其與臨床特征、PCNA指數(shù)的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 標(biāo)本取自2010-06至2011-02手術(shù)治療病例，經(jīng)病理確診為食管鱗狀細(xì)胞癌32例，其中男19例，女13例；年齡48～73歲，平均(62.0±9.8)歲。所有患者術(shù)前均未行放化療治療。

1.2 免疫組織化學(xué)方法 標(biāo)本組織經(jīng)10%甲醛溶液固定、石蠟包埋，切成4 μm切片，65 ℃烘片24 h，常溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取組織石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，超純水洗 3次，甲醇+H2O2去過氧化物；PBS洗 5 min；檸檬酸緩沖液修復(fù)10 min，室溫自然冷卻，PBS洗2次；羊血清封閉2 h；加一抗孵育，一抗為鼠抗人PR-SET7多抗(1∶300，Abcam公司)，兔抗人PCNA多抗(1∶300，蘇州睿灜)，4 ℃過夜；1%PBS-T洗2次，PBS洗1次5 min；二抗為鼠兔通用型二抗(基因科技上海有限公司)，室溫1 h，PBS洗3次，切片經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蒸餾水終止，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，45 ℃水浴返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.3 觀察指標(biāo) 收集患者的一般資料、臨床特征，以及PR-SET7及PCNA指數(shù)。PR-SET7及PCNA陽性基因主要定位在細(xì)胞核，胞核及胞漿出現(xiàn)棕黃色為陽性。PR-SET7免疫組織化學(xué)評(píng)分采用H-score(histochemistry score)評(píng)分系統(tǒng)法[6]，H-score=陽性強(qiáng)度×100個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)目。陽性強(qiáng)度分為陰性(0分)、弱陽性(1分)、中等陽性(2分)和強(qiáng)陽性(3分)。本研究將評(píng)分0～200分的定義為低表達(dá)，>200分的組織定義為高表達(dá)。PCNA指數(shù)：每例標(biāo)本隨機(jī)觀察5個(gè)視野(×200)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)為其PCNA指數(shù)。所得結(jié)果由兩位資深病理科醫(yī)師閱片，取均值納入統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1 PR-SET7及PCNA在食管癌組織中的表達(dá) PR-SET7及PCNA主要在胞核中表達(dá)，食管癌組織中高表達(dá)，癌旁組織中低表達(dá)(圖1)。PR-SET7在食管癌組織中高表達(dá)26例，高表達(dá)率為81.25%，在癌旁組織中高表達(dá)5例，高表達(dá)率為15.62%，食管癌組織高表達(dá)率高于癌旁組織(χ2=27.5，P<0.05)；PCNA指數(shù)在食管癌組織中為68.12±16.03，癌旁組織中為38.22±20.56，食管癌組織PCNA指數(shù)大于癌旁組織(t=14.6，P<0.05)。

圖1 PR-SET7及PCNA在食管癌組織及癌旁組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)

A.癌旁組織PR-SET7；B.癌組織PR-SET7；C.癌旁組織PCNA；D.癌組織PCNA

2.2 PR-SET7表達(dá)與食管癌臨床特征的相關(guān)性 PR-SET7在食管癌組織中的表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P<0.05)，腫瘤分化程度低、Ⅲ期伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織PR-SET7有明顯高表達(dá)率。與患者的性別、年齡無明顯相關(guān)性(P>0.05，表1)。

2.3 PR-SET7在食管癌組織中的表達(dá)水平與PCNA指數(shù)的相關(guān)性 食管癌組織中PR-SET7的高表達(dá)組PCNA指數(shù)為74.33±15.11，低表達(dá)組為51.31±14.68，二組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.1，P<0.05)。經(jīng)相關(guān)分析，PR-SET7在食管癌組織中的表達(dá)水平與PCNA指數(shù)之間顯著相關(guān)(rs=0.551，P=0.001)，相關(guān)性強(qiáng)。

表1 PR-SET7在食管癌組織中的表達(dá)水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性 (n；%)

3 討 論

研究表明，PR-SET7在細(xì)胞周期、DNA復(fù)制起始、基因組穩(wěn)定、DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡等多方面發(fā)揮作用[7-11]，涉及到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等多個(gè)環(huán)節(jié)。多種腫瘤中的研究表明，PR-SET7的rs16917496位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性有可能成為腫瘤發(fā)病和預(yù)后的指標(biāo)之一[3]，其通過相關(guān)癌基因及抑癌基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。例如，PR-SET7介導(dǎo)的P53K382me1 修飾可增強(qiáng)L3MBTL1 與P53 的相互作用，抑制P53 的轉(zhuǎn)錄作用。然而，當(dāng)DNA損傷時(shí)，PR-SET7表達(dá)降低，導(dǎo)致P53K382me1 水平下降，L3MBTL1與P53的結(jié)合作用減弱，L3MBTL1從P53靶基因解離，促使P53靶基因轉(zhuǎn)錄活化增強(qiáng)[12]。Oda等[13]的研究揭示了PR-SET7在DNA損傷修復(fù)過程中的作用模式：DNA損傷誘導(dǎo)H2AX磷酸化，PCNA被募集到DNA損傷位點(diǎn)，PR-SET7通過其PIP結(jié)構(gòu)域與PCNA相結(jié)合，催化H4K20單甲基化，53BP1通過其雙舵結(jié)構(gòu)域與H4K20單甲基化的賴氨酸相結(jié)合，CRL4Cdt4使PR-SET7通過第二PIP結(jié)構(gòu)域發(fā)生泛素化修飾進(jìn)行酶解，PCNA仍然停留在DNA損傷位點(diǎn)并作為一種平臺(tái)招募其他的修復(fù)蛋白。

我們通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PR-SET7及PCNA在食管癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，證實(shí)癌組織中PR-SET7強(qiáng)表達(dá)，主要位于食管癌腫瘤細(xì)胞的胞核中，在胞漿中也有表達(dá)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，其在食管癌腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織，其與食管癌的腫瘤分化程度、病理學(xué)分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，提示PR-SET7的異常表達(dá)與食管癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，但其在食管癌中的調(diào)控機(jī)制尚不明確。癌組織中PCNA指數(shù)高于癌旁組織，同時(shí)，食管癌組織中PR-SET7高表達(dá)組PCNA指數(shù)明顯高于低表達(dá)組，而且PCNA指數(shù)與PR-SET7高表達(dá)具有顯著相關(guān)性，說明PR-SET7的表達(dá)與食管癌的增殖活動(dòng)有關(guān)。

蛋白質(zhì)甲基化失調(diào)被證實(shí)與許多疾病的發(fā)生有關(guān)，大量的研究表明PR-SET7異常表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[14,15]。在當(dāng)前腫瘤生物學(xué)研究中，表觀遺傳學(xué)改變已經(jīng)成為熱點(diǎn)，通過DNA甲基化、非編碼RNA調(diào)控、染色質(zhì)重塑等領(lǐng)域的研究，對(duì)腫瘤預(yù)后評(píng)估提供了諸多有價(jià)值的分子標(biāo)志[16]。目前有研究提示，在食管癌組織中存在多條異常激活的信號(hào)傳導(dǎo)通路[17]。因此，進(jìn)一步研究PR-SET7及PCNA在食管癌中調(diào)控機(jī)制，了解其在食管癌中是否有其專屬的調(diào)節(jié)通路，以及該通路上所存在的相關(guān)靶基因，對(duì)食管癌的預(yù)測(cè)、早期診斷、病情發(fā)展及預(yù)后等方面具有重要的價(jià)值，可作為一個(gè)評(píng)估食管癌潛在風(fēng)險(xiǎn)的重要因素，為食管癌的治療及藥物研發(fā)提供新的方向。

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(2016-10-10收稿 2016-11-10修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

Expression of PR-SET7 in esophageal carcinoma and its correlation with clinical features and PCNA index

ZHENG Jian，MA Shikun，and CHEN Jian.

Department of Surgery，Jiangsu Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Force，Yangzhou 225003，China

Objective To investigate the expression of lysine methyltransferase(KMT) PR-SET7 in esophageal carcinoma and its relationship with clinical features and proliferating cell nuclear antigen(PCNA).Methods Immunohistochemistry was used to detect the PR-SET7 and PCNA expressions in esophageal cancer tissues and adjacent normal tissues of 32 cases between June 2010 and February 2011. The correlations between the expression of PR-SET7 and patients’ gender, age, degree of carcinoma tissue differentiation, TNM stages, lymph node metastasis and proliferation of tumor cells were analyzed.Results Immunohistochemistry results showed that PR-SET7 and PCNA were mainly expressed in nuclear. The expression of PR-SET7 and PCNA in cancerous tissues was significantly stronger than in adjacent tissues. The high expression rate of PR-SET7 was 81.25%, but the expression was mostly low in adjacent tissues, where the high expression rate was 15.62%(P<0.01).PCNA index in cancer tissues was 68.12±16.03, normal tissues was 38.22±20.56,both comparative difference was statistically significint (P<0.05).PR-SET7 protein levels in patients with esophagus carcinoma were correlated with invasive depth and lymph node metastasis (P<0.05) rather than with age or gender (P>0.05).There was a significant correlation between the expression of PR-SET7 and PCNA index (rs=0.551，P=0.001).Conclusions There is an abnormal expression of PR-SET7 and PCNA during the development and progression of esophageal carcinoma. The expression level may be related to tumor progression, metastasis and prognosis. There is a significant correlation between PR-SET7 and PCNA overexpression in cancer tissues, which is of significance for exploration of the mechanism.

PR-SET7；PCNA；esophageal carcinoma；expression；prognosis

鄭 建，博士，主任醫(yī)師。

225003 揚(yáng)州，武警江蘇總隊(duì)醫(yī)院胸外科

馬仕昆，E-mail：535435133@qq.com

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