孫 鵬,張 鑫,賀 凱,潘 瓊,王 爽,李金榮,郭亞男,曹思婷,白曉南,何生虎*
(1.寧夏大學農(nóng)學院,寧夏銀川 750021;2.寧夏回族自治區(qū)藥品檢驗所,寧夏銀川 750001;3.銀川第二人民醫(yī)院藥劑科,寧夏銀川 750001)
當歸顆粒劑與煎劑有效成分及體外抑菌活性比較
孫 鵬1△,張 鑫1△,賀 凱2,潘 瓊3,王 爽1,李金榮1,郭亞男1,曹思婷1,白曉南1,何生虎1*
(1.寧夏大學農(nóng)學院,寧夏銀川 750021;2.寧夏回族自治區(qū)藥品檢驗所,寧夏銀川 750001;3.銀川第二人民醫(yī)院藥劑科,寧夏銀川 750001)
為了比較當歸顆粒劑與煎劑在有效成分和藥效上的差異,采用薄層色譜法(TLC)鑒定當歸顆粒劑;高效液相色譜法(HPLC)測定顆粒劑、煎劑和對照藥材中阿魏酸的含量;應用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價》軟件對顆粒劑、煎劑進行相似度評價,同時進行體外抑菌試驗。結(jié)果表明,當歸顆粒劑TLC圖中存在當歸對照藥材的特征斑點,與對照藥材HPLC特征圖譜相似度達95.1%;顆粒劑、煎劑和對照藥材中阿魏酸的含量分別為3.95、1.69、2.84 mg/g;抑菌結(jié)果為金黃色葡萄球菌、沙門菌抑菌圈顆粒劑和煎劑相同,大腸埃希菌、鏈球菌抑菌圈顆粒劑>煎劑。通過試驗發(fā)現(xiàn),當歸顆粒劑中有效成分與對照藥材相近,體外抑菌結(jié)果優(yōu)于煎劑。
當歸顆粒劑;煎劑;薄層色譜法;高效液相色譜法;指紋圖譜;體外抑菌
當歸性溫,味辛、甘,入心、肝、脾、肺經(jīng)。功效養(yǎng)血、活血止痛[1]。本品味甘而重,故專能補血,適用于血虛引起的各種證候,常用于跌打損傷瘀痛,風濕痹痛及經(jīng)絡不利等證,具有良好的活血止痛作用[2]。 臨床上當歸顆粒劑替代當歸藥材使用,可以提高藥材的利用率,減少浪費,并且計量準確[3]。中醫(yī)臨床已被廣泛使用,但在獸醫(yī)臨床上鮮有報道和應用,本研究旨在為當歸顆粒劑替代水煎劑,應用于獸醫(yī)臨床治療提供試驗依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 試驗藥物 當歸對照藥材(批號:120927-201315,1 g)、阿魏酸對照品(批號:110773-201012,20 mg),中國食品藥品檢定研究院;當歸顆粒劑(批號:5111802,3 g包裝相當于飲片10 g),廣東一方制藥有限公司;當歸飲片(批號:150601),毫州金勺堂中藥飲片有限公司。
1.1.2 主要試劑 甲醇、乙腈(色譜純),德國默克公司產(chǎn)品;甲酸、無水乙醇、乙醚、環(huán)己烷、二氯甲烷、碳酸氫鈉、稀鹽酸均為分析純;超純水,實驗室自制。
1.1.3 菌種與培養(yǎng)基 菌種:金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌和鏈球菌,均由寧夏大學農(nóng)學院獸醫(yī)微生物實驗室分離、鑒定并保存;MH瓊脂(批號:20140814),青島高科園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
1.1.4 儀器、耗材與軟件 1200高效液相色譜儀,美國Agilent公司產(chǎn)品;KQ-300VDB型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品;BS210型電子天平,深圳市深美儀器有限公司產(chǎn)品;薄層色譜展開缸,硅膠G薄層板(100 mm×200 mm,批號:710808),青島海洋化工特種硅膠有限公司產(chǎn)品;中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2008版,中國軟件與技術(shù)服務股份有限公司研發(fā)。
1.2 方法
1.2.1 樣品制備
1.2.1.1 煎劑 將當歸飲片粉碎至40目,放入藥材重量10倍量的水中煎煮3次,每次1 h,然后將所有提取溶液混合,單層濾紙過濾后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮制成1∶1的流浸膏,即1 g藥材最后得到1 mL流浸膏。
1.2.1.2 顆粒劑 取當歸顆粒劑1包(3 g包裝),溶于10 mL超純水中,即得相對于當歸飲片濃度1 g/mL的溶液。
1.2.2 TLC法
1.2.2.1 供試品溶液的制備 取顆粒劑樣品3 mL,加10 g/L碳酸氫鈉溶液50 mL,超聲處理10 min,離心,取上清液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2~3,用乙醚振搖提取2次,每次20 mL,合并乙醚液。待乙醚液揮發(fā)干,殘渣加1 mL甲醇使溶解,作為供試品溶液。
1.2.2.2 對照品溶液的制備 取當歸對照藥材3 g,同“1.2.2.1”法制成對照藥材溶液。取阿魏酸對照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對照品溶液。
1.2.2.3 薄層層析 照薄層色譜法[4],吸取同“1.2.2.1”法制備的當歸顆粒劑、同“1.2.2.2”法制備的對照藥材和對照品溶液各10 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙醇-甲酸(4∶1∶1∶0.1)為展開劑展開,取出晾干后,置365 nm紫外光燈下檢視。
1.2.3 HPLC法
1.2.3.1 色譜條件 照高效液相色譜法[4],色譜柱:AgilentExtend-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫:35℃,以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈為流動相A,以0.85 mL/L磷酸溶液為流動相B,流速:1.0 mL/min,檢測波長:316 nm,進樣量:10 μL,洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
1.2.3.2 供試品溶液的制備 取當歸顆粒劑、煎劑樣品0.2 mL,置錐形瓶中,加人700 mL/L甲醇20 mL,密塞后稱定重量,加熱回流30 min,放冷,再稱定重量,用700 mL/L甲醇補足減失的重量。搖勻,用0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。
1.2.3.3 對照藥材溶液的制備 取當歸對照藥材0.2 g,同“1.2.3.2”法制成對照藥材溶液。
1.2.3.4 對照品溶液的制備 取阿魏酸對照品,加700 mL/L甲醇制成每1 mL含12 μg的溶液,作為對照品溶液。
1.2.3.5 方法學考察
(1)標準曲線的制備 精密量取適量的阿魏酸標準品溶液置于容量瓶中,用甲醇配成系列標準溶液,使?jié)舛确謩e為0.001、0.010、0.020、0.050、0.100、1.000 mg/mL,按“1.2.3.1”項色譜條件分別進樣10 μL測定。
(2)穩(wěn)定性考察 在避光條件下,精密吸取當歸顆粒劑、煎劑各5份,進樣量10 μL,分別于0、2、4、8、12、24 h進樣。
(3)精密度考察 精密吸取阿魏酸對照品溶液10 μL,按“1.2.3.1” 項色譜條件,連續(xù)進樣6次,測峰面積。
(4)重復性考察 精密吸取當歸顆粒劑、煎劑,同“1.2.3.2”法平行制備6份供試品溶液,按“1.2.3.1” 項色譜條件分別進樣分析。
1.2.3.6 HPLC特征圖譜 同“1.2.3.2、1.2.3.3”法制備當歸顆粒劑、煎劑和對照藥材溶液,按“1.2.3.1”項色譜條件測定特征圖譜。
1.2.3.7 阿魏酸含量測定 同“1.2.3.2、1.2.3.3”法制備當歸顆粒劑、煎劑和對照藥材各3份,按“1.2.3.1”項色譜條件測定。
1.2.3.8 指紋圖譜相似度匹配 打開《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2008版》軟件,導入當歸顆粒劑、煎劑和對照藥材溶液HPLC特征圖譜,將對照藥材溶液HPLC特征圖譜設(shè)定為參照圖譜后,與當歸顆粒劑、煎劑HPLC特征圖譜進行自動匹配,利用相似度計算功能對顆粒劑和煎劑進行相似度評價。
1.2.4 體外抑菌試驗
1.2.4.1 菌液制備 將菌種接種于營養(yǎng)肉湯中,37℃培養(yǎng)24 h后,采用平板傾注法進行活菌計數(shù)并將菌液濃度稀釋為105CFU/mL的含菌量。
1.2.4.2 MH瓊脂培養(yǎng)基制備 將培養(yǎng)基裝在三角瓶中,121℃高壓滅菌15 min。無菌條件下,溫度控制在45℃時倒入平皿中。鏈球菌使用加50 mL/L綿羊血的MH瓊脂。
1.2.4.3 當歸顆粒劑及煎劑體外抑菌試驗 取稀釋好的菌液100 μL,均勻涂在MH瓊脂板上,在室溫下干燥3 min~5 min。采用牛津杯法,進行抑菌試驗[5]。將培養(yǎng)基平均分為5個區(qū)域,用無菌鑷子將無菌牛津杯放在固定位置,用手輕輕加壓,使不產(chǎn)生空隙。最后在牛津杯中加入100 μL(1 g/mL)藥液,將培養(yǎng)皿小心移入培養(yǎng)箱中,37℃培養(yǎng)18 h~24 h,測量抑菌環(huán)直徑。設(shè)3個平行試驗組,并設(shè)陽性、空白對照。
1.2.4.4 結(jié)果判定 抑菌效果判定標準:參考文獻標準[6],抑菌直徑(d)≥20 mm為極敏,20 mm>d≥15 mm高敏;15 mm>d≥10 mm為中敏,10 mm>d>8 mm為低敏,d≤8 mm無抑菌效果。
2.1 TLC法
在與對照藥材、對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點,見圖1。
2.2 HPLC法
2.2.1 方法學考察
2.2.1.1 標準曲線 以標準品溶液的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標,峰面積積分值(y)為縱坐標,繪制阿魏酸的標準曲線,回歸方程為y=1.031×104+9.380×107x(r=0.999 6,n=6)。結(jié)果表明,阿魏酸的質(zhì)量濃度在0.001 mg/mL~1.000 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系(保留時間17.73 min)。
2.2.1.2 穩(wěn)定性考察 阿魏酸的峰面積RSD(n=6)均<1.47%,表明供試品溶液中阿魏酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.1.3 精密度考察 阿魏酸的峰面積RSD(n=6)為0.57%,表明本方法精密度良好。
2.2.1.4 重復性考察 阿魏酸的峰面積RSD(n=6)均<2.24%,說明本方法重復性良好。
1.當歸顆粒劑; 2.當歸對照藥材; 3.阿魏酸
1.Angelicagranules; 2.Angelicasinensisradix; 3.Ferulic acid
圖1 當歸TLC圖譜
Fig.1 TLC ofAngelicasinensis
2.2.2 HPLC特征圖譜 結(jié)果見圖2和圖3。
2.2.3 阿魏酸含量計算結(jié)果 由表2可知,當歸顆粒劑、煎劑和對照藥材中含阿魏酸的量分別為3.95、1.69、2.84 mg/g。
2.2.4 相似度比較 當歸顆粒劑與當歸對照藥材指紋圖譜相似度較高,達到95.1%,當歸煎劑與當歸對照藥材指紋圖譜相似度為93.9%。
2.2.5 體外抑菌結(jié)果 觀察抑菌圈大小并記錄結(jié)果,見表3。由表3可知,金黃色葡萄球菌、沙門菌抑菌圈顆粒劑和煎劑相同,大腸埃希菌、鏈球菌抑菌圈顆粒劑>煎劑。
本試驗樣品的處理方法均參照2015年版《中國藥典》(一部)方法,該方法簡便快捷。測定阿魏酸含量的方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定可靠;精密度重復性好,且顆粒劑與對照藥材HPLC特征圖譜相似度達95.1%,該方法可以用于當歸顆粒劑的質(zhì)量評價。
當歸顆粒劑、煎劑和對照藥材中阿魏酸的含量分別為3.95、1.69、2.84 mg/g,顆粒劑中阿魏酸含量最高,這一結(jié)果與張惠等[7]報道中藥顆粒劑和傳統(tǒng)飲片的化學成分在種類、含量無明顯差異,有的甚至比飲片煎劑含量更高的結(jié)論一致。
S1.當歸顆粒劑; S2.當歸煎劑; S3.當歸對照藥材
圖3 阿魏酸對照品HPLC總離子流圖
表2 阿魏酸含量
表3 當歸顆粒劑和煎劑體外抑菌結(jié)果
中藥指紋圖譜相似度是辨別中藥材真?zhèn)魏唾|(zhì)量優(yōu)劣的一項重要指標[8]。它是以譜峰面積值作為比對計算參數(shù),利用色譜工作站可獲取譜圖中各指紋峰的保留時間和峰面積數(shù)據(jù)進行相似度評價,能夠全面、客觀地反映中藥指紋圖譜間的相似程度,進而評價中藥材質(zhì)量[9]。
由于MH瓊脂培養(yǎng)基產(chǎn)品批間藥物敏感試驗重復性比其他培養(yǎng)基好,接種于MH瓊脂培養(yǎng)基上,絕大多數(shù)致病菌生長良好,故體外抑菌試驗采用MH培養(yǎng)基[10]。本試驗中當歸顆粒劑抑菌作用優(yōu)于水煎劑,這一結(jié)果與任非等[11]報道的顆粒劑的抑菌作用弱于煎劑不一致,可能與其實驗室檢測所使用的免煎劑有關(guān)。當歸煎劑對大腸埃希菌、鏈球菌無抑菌效果,可能與原藥材質(zhì)量和制備工藝有關(guān),提取時間、次數(shù)和加水量等因素均會影響有效成分的溶出。
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Comparison of Active Compositions and Antibacterial ActivitiesinVitrobetweenAngelicaGranule and Decoction
SUN Peng1,ZHANG Xin1,HE Kai2,PAN Qiong3,WANG Shuang1,LI Jin-rong1, GUO Ya-nan1,CAO Si-ting1,BAI Xiao-nan1,HE Sheng-hu1
(1.SchoolofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia,750021,China; 2.NingxiaDrugInspectionAgency,Yinchuan,Ningxia,750001,China;3.PharmacyDepartment,YinchuanNo.2People'sHospital,Yinchuan,Ningxia,750001,China)
To compare differences in active compositions and efficacy betweenAngelicagranules and decoction,theAngelicagranules were identified by thin layer chromatography (TLC),the contents of ferulic acid inAngelicagranules, decoction andAngelicasinensisradix were detected by high performance liquid chromatography (HPLC), the similarities of the three solutions were evaluated by "chromatographic fingerprint similarity evaluation" software. In addition, the antibacterial tests were made.Angelicagranule was characterized in theAngelicasinensisradix by TLC figure. HPLC characteristic spectrum similarity was higher than 95.1%. The amount of ferulic acid was 3.95 mg/g, 1.69 mg/g and 2.84 mg/g in granules, decoction andAngelicasinensisradix respectively. The antibacterial results of granules and decoction showed that there is the same inhibition zone toStaphylococcusaureusandSalmonellasp.,toEscherichiacoliandStreptococcussp. inhibition zone: granules > decoction. The results found thatAngelicagranules contain active compositions which were similar toAngelicasinensisradix, and showed more effective inhibition results than decoction.
Angelicagranule; decoction; TLC; HPLC; fingerprint; antibacteriainvitro
2016-06-28
孫 鵬(1986-),男,山東泰安人,博士研究生,主要從事動物疫病防控技術(shù)研究。△同等貢獻作者*通訊作者
S853.75
A
1007-5038(2017)02-0050-05